Summary
Denne protokol indeholder en trinvis procedure for reproducerbar generering, vedligeholdelse og ældning af cerebrale organoider afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC'er). Denne metode muliggør dyrkning og modning af cerebrale organoider i længere perioder, hvilket letter modellering af processer involveret i hjernens aldring og aldersrelateret patogenese.
Abstract
De aktuelt tilgængelige dyre- og cellulære modeller rekapitulerer ikke fuldt ud kompleksiteten af ændringer, der finder sted i den aldrende menneskelige hjerne. En nylig udvikling af procedurer, der beskriver dannelsen af humane cerebrale organoider, afledt af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er), har potentialet til fundamentalt at transformere evnen til at modellere og forstå aldring af den menneskelige hjerne og relaterede patogene processer. Her præsenteres en optimeret protokol til generering, vedligeholdelse, aldring og karakterisering af humane iPSC-afledte cerebrale organoider. Denne protokol kan implementeres for at generere hjerneorganoider på en reproducerbar måde og fungerer som en trinvis vejledning, der indeholder de nyeste teknikker, der resulterer i forbedret organoid modning og aldring i kultur. Specifikke problemer relateret til organoid modning, nekrose, variabilitet og batcheffekter behandles. Samlet set vil disse teknologiske fremskridt muliggøre modellering af hjernens aldring i organoider afledt af en række unge og ældre menneskelige donorer såvel som personer, der er ramt af aldersrelaterede hjernesygdomme, hvilket muliggør identifikation af fysiologiske og patogene mekanismer for menneskets hjerne aldring.
Introduction
Aldringssygdomsmodeller er blevet mere og mere relevante, da menneskets forventede levetid fortsætter med at stige. Store genomiske undersøgelser har afdækket ældre populationer med dysregulering af molekylære processer og genetiske ændringer, der påvirker livskvaliteten1. Aldringsprocessen er kendetegnet ved et generelt tab af funktionalitet af organismen, herunder tab af kognitiv funktion, øget risiko for neurodegenerative lidelser og et væld af kroniske sygdomme2.
Nuværende cellekulturteknikker repræsenterer ikke passende aldringens multifaktorielle karakter, da disse dysfunktioner ikke kan replikeres korrekt ved hjælp af mutationer, toksiner eller infektioner3. Dyremodeller, der udforsker aldringsprocessen, er ofte forbundet med lange forsøgstider og høje omkostninger, men bringer også etiske overvejelser med sig. Brug af inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) fra patienter kan belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomsprogression, da iPSC'er giver mulighed for den naturlige udvikling af celler til modent væv3. iPSC'er er blevet arbejdshesten i mange laboratorier, der undersøger neurodegenerative lidelser, da den cellulære omprogrammering af høstede celler ikke synes at slette donorernes sygdoms- eller aldringsaftryk4. Disse aftryk rekapitulerer cellulære fænotyper, der er blevet demonstreret i menneske- og dyremodeller, hvilket gør iPSC'er egnede til at undersøge individuel cellulær forringelse af det meget tætte hjernevæv 5,6. IPSC-afledte organoider er blevet den fremtrædende model for tredimensionel dyrkning af væv, hvilket muliggør mere komplekse celle-til-celle-interaktioner og en forbedret udviklingsmæssig rekapitulation. Selvom organoider primært anvendes til udviklingsdata, er organoider i stigende grad blevet anvendt til sygdomsmodellering, specifikt modeller for inflammation, neurodegeneration og aldring7. Baseret på tidligere iPSC-undersøgelser bevarer organoider sygdomsfænotyper og cellulære fænotyper inden for den fysiologiske kontekst af vævslignende netværksforbindelser 8,9. Imidlertid kan dyrkning af tredimensionelt væv af visse dimensioner være udfordrende, især i længere perioder.
Dette arbejde præsenterer en detaljeret metode til reproducerbar generering af cerebrale organoider, der gør det muligt for vævet at modnes væsentligt i størrelse i længere perioder. Cerebral organoid skabelse er forblevet relativt standardiseret og vedtager metoder fra flere fremtrædende protokoller10,11. Der er dog foreslået flere ændringer for forbedret differentiering og vedligeholdelse. Disse alternative metoder omfatter anvendelse af neurogene faktorer til forbedring af neural differentiering12, yderligere stilladser til forbedret næringsstofudveksling, der fremmer cellulær levetid 13 og lav ren stressagitation for langvarig kultur og vækst14. Disse forbedringer er blevet indarbejdet i denne metode til at udvikle modne organoider, der er i stand til at udtrykke neurodegenerative og aldrende fænotyper.
Protocol
Patientundersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board. Alle deltagere underskrev skriftligt informeret samtykke og opbevaringssamtykke for at tillade, at deres data og biospecimen genanvendes. iPSC-linjer blev genereret i henhold til IRB og institutionelle retningslinjer. Figur 1 illustrerer en skematisk oversigt over arbejdsgangen for denne protokol.
1. Omprogrammering og vedligeholdelse af iPSC
- Saml 8 ml af forsøgspersonens blod (ældre eller sygdomspatient; 65 år og ældre) i cellepræparationsrør (CPT) med natriumcitrat eller i EDTA eller hepariniserede rør.
- Der centrifugeres ved 1.800 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) for at opsamle pellet, der kun indeholder perifert blod og intet serum15.
- Brug specialiserede omprogrammeringsvektorer i henhold til producentens protokol (se materialetabellen) for at opnå iPSC'er16.
- Kultur-iPSC'er i føderfri, laktosedehydrogenaseforhøjende virus (LDEV)-fri med reduceret vækstfaktor kældermembranmatrixbelagte 6-brønds kulturplader i Essential 8 (E8) medier (se materialetabel) ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5 % CO2.
- Oprethold iPSC'er i E8-medier i 3-4 dage for at undgå overbelægning eller spontan differentiering.
- Valider pluripotensen af iPSC-linjerne ved hjælp af immunofluorescerende markører (trin 2) og test for mycoplasma (trin 3).
2. Pluripotens farvning
- For at bevare opløsninger og antistoffer sås cellerne på coatede (trin 1.4) 24-brønds dyrkningsplader 3-4 dage før analyse. Opsug mediet med en pipette og fastgør cellerne med 4% formaldehyd i fosfatbufret saltvand (1x PBS) i 15-20 minutter ved RT.
- Cellerne vaskes 3x med 1x PBS og permeabiliseres med 0,1% Triton-X 100 i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i mindst 15 min, men ikke mere end 1 time ved RT.
- Vask 3x med 1x PBS og bloker med 5% BSA i PBS i 30 min ved RT.
- Der vaskes igen 3x med 1x PBS og tilsættes antistofferne Sox2 og Oct3/4 (1:100 fortynding; se materialetabel) og nukleinpletten DAPI i 1% BSA (1:4.000 fortynding) natten over ved 4 °C. Pak ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
- Vask 3x med 1x PBS og lad cellerne blive i PBS. Billede med et fluorescensmikroskop ved en 10-20x forstørrelse. Sørg for, at pluripotensmarkørerne Sox2 og Oct3/4 er lokaliseret i kernerne i cellerne17,18.
3. Mycoplasma test
BEMÆRK: Se registreringssættets protokol (se materialetabellen) for detaljerede analyseudførelses- og analysetrin. Detektionssættet tilvejebringer reagenset, substratet og analysebufferen til mycoplasma-testning.
- Før cellerne eller opfriskningsmediet passeres, opsamles 2-3 ml cellekulturmedium i et centrifugerør og pelleteres eventuelle celler eller snavs ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten opbevares ved 4 °C i ≤5 dage. Inkuber cellerne med mediet i mindst 24 timer for at sikre et detekterbart signal.
- Der tilsættes 100 μL cellesupernatant til et frisk rør eller hul i en hvidvægget plade med 96 huller (uigennemsigtig bund anbefales, se materialetabellen). Rekonstituér reagenset og substratet i analysebufferen og ekvilibrer i 15 minutter ved RT.
- Der tilsættes 100 μL af reagenset til prøven, og der inkuberes i 5 minutter ved RT. Luminescensen måles med et luminometer (måling #1).
- Der tilsættes 100 μL substrat til prøven, og der inkuberes i 10 minutter ved RT. Luminescensen måles (måling #2).
- Bestem mycoplasmaforureningen ved forholdet mellem måling #2 og #1. Se sættets manual for fortolkning af resultaterne.
4. Fremstilling af mikrofilamenter
- Begynd fremstillingen af poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA, se materialetabel) mikrofilamenter ved at flosse suturstrengen med den stumpe ende af en skalpel. Steriliser den flossede fiber let med 70% ethanol.
- Under mikroskopet og ved hjælp af en lineal begynder du at skære PLGA-fiberen i fragmenter på 500 μm til 1 mm lange tråde. Skær ca. 25 mm af fiberen i alt. Opbevar filamenterne i et 15 ml rør med en 1 ml antibiotika-antimykotisk opløsning.
- I emhætten fortyndes fiberopløsningen med 10 ml DMEM / F-12 (tabel 1). Vortex godt for at blande opløsningen.
BEMÆRK: Arbejd i en cellekulturflowhætte i et sterilt miljø.
- I emhætten fortyndes fiberopløsningen med 10 ml DMEM / F-12 (tabel 1). Vortex godt for at blande opløsningen.
- Tilsæt 20 μL af fiberopløsningen til tre embryoide legemer (EB), der danner brønde af en 96-brøndplade. Under brightfieldmikroskopi tælles og beregnes fibrene pr. Brønd. Fortynd eller koncentrer til gennemsnitligt 5-10 PLGA mikrofilamenter pr. Brønd. Forbered hver brønd på denne måde.
- Brøndene er nu klar til at blive podet med celler. Opbevar pladen ved stuetemperatur, indtil den skal bruges, eller ved 4 °C den følgende dag.
5. Embryoid krop (EB) dannelse
BEMÆRK: Alle medier og løsninger skal opvarmes til RT.
- Når iPSC'erne har nået 70%-80% sammenløb (figur 2A), er de klar til at blive passeret og brugt til EB-dannelse. Kontroller cellerne med et mikroskop ved 10x-20x forstørrelse. Sørg for, at kolonierne viser minimale (<10%) områder med spontan differentiering.
- Opsug mediet med en pipette og vask cellerne en gang med DPBS. Kolonierne adskilles ved tilsætning af 500 μL celleløsrivelsesopløsning (se materialetabel) eller 0,5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuberes i 3-5 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Arbejd i en cellekulturflowhætte i et sterilt miljø. - De frigivne celler samles ved at tilsætte 1 ml frisk E8-medie til hvert hul og pipetteres forsigtigt, indtil alle celler er løsnet.
- Overfør 1,5 ml cellesuspension til et 15 ml rør, og tilsæt yderligere 1 ml frisk E8-medie for at nå et samlet volumen på 2,5 ml.
- Der centrifugeres ved 290 x g i 3 minutter ved RT.
- Supernatanten suges til med en pipette, cellepelletten resuspenderes i 1 ml Essential 6 (E6, se materialetabel) medier suppleret med 50 μM ROCK-hæmmer, og cellerne tælles med et hemocytometer19.
- Forbered en cellesuspension på 60.000-90.000 celler/ml, afhængigt af den ønskede såtæthed, i E6-medier suppleret med 50 μM ROCK-hæmmer (se materialetabel).
- Der tilsættes 150 μL af cellesuspensionen i hvert hul i en 96-brønds ULA-plade (eller en forberedt konkav plade20). Frø 9.000-11.000 celler pr. Brønd.
- Pladen centrifugeres for at tvangsaggregere cellerne ved 290 x g i 1 min ved RT. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2.
6. Neuroepitelial induktion
- Efter 24 timer aspireres forsigtigt 120 μL af mediet med en pipette. Sørg for ikke at opsuge EB ved at sænke pipettespidsen for langt ned i brønden.
- Der tilsættes 150 μL E6-medier (ved RT) suppleret med 2 μM XAV939 og SMAD-hæmmere: 10 μM SB431542 og 500 nM LDN 193189 pr. hul (se materialetabel).
- Skift mediet dagligt med frisklavet E6-medie suppleret med 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 og 500 nM LDN-193189.
BEMÆRK: På dag 6 (DIV6) skal EB'erne have en diameter på 550-600 μm og være klar til yderligere differentiering.
7. Organoid differentiering og modning
BEMÆRK: Alle medier skal opvarmes til RT.
- Ved ca. DIV7 skal du kontrollere, om alle EB'erne har nået en diameter på 550-600 μm og have en glat og klar kant (figur 2B); på dette stadium er de klar til at blive indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM).
BEMÆRK: Arbejd i et sterilt miljø. - Forbered fordybede indlejringsplader fra den termoplastiske forseglingsfilm (se materialetabel) ved at placere et filgfolie (ca. 4 tommer langt) på en tom P200-kasse. Brug et 15 ml konisk rør eller et 500 μL mikrocentrifugerør til forsigtigt at trykke filfilepladen ned i hullerne for at lave 12 fordybninger. Sprøjt filmarken med 70% ethanol og lad den tørre inde i flowhætten med UV-lyset tændt i mindst 30 min.
- Optø en tilstrækkelig mængde kældermembranmatrix (Matrigel, se materialetabel) på is, og placer den inde i strømningshætten.
BEMÆRK: Pr. EB er der behov for ca. 30 μL ufortyndet membranmatrix. Hold altid membranmatrixen under 4 °C for at forhindre, at den gelerer. Forkølede pipettespidser anbefales også, da de decelererer matrixen fra polymerisering i spidsen under pipettering og derved reducerer materialetabet. - Brug en P200-spids med bred boring til at overføre en EB til hver fordybning og fjerne så mange medier som muligt med en normal pipettespids. Vær opmærksom på ikke at lade EB'erne tørre. Brug en almindelig P200-spids til at tilføje ~ 30 μL ufortyndet membranmatrix til hver organoid, hvilket sikrer, at EB er i midten af dråben.
- Når alle EB'er er indlejret i matrixen, placeres filfilet, der indeholder EB'erne, i en steril petriskål.
BEMÆRK: Eventuelt kan en lille petriskål fyldt med sterilt vand placeres i den større petriskål ved siden af filtrinnet for at forhindre fordampning.- Fadet overføres til en inkubator og inkuberes ved 37 °C i befugtet atmosfære med 5% CO2 i ca. 10 minutter for at lade membranmatrixen størkne.
- For hvert sæt af 12 indlejrede organoider fremstilles 5 ml differentieringsmedier med B27 uden vitamin A (tabel 1) i en brønd i en ULA 6-brøndplade. Forvarm pladen til 37 °C i en inkubator.
- Når inkubationstiden er færdig, overføres de indlejrede EB'er til ULA 6-brøndpladen ved at tage filgrammen og skubbe fordybningerne ud fra bagsiden af arket. Tag om nødvendigt 1 ml fra brønden og pipette den på arket for at hjælpe dråberne med at løsne sig fra filmen.
BEMÆRK: Vigtige morfologiske ændringer kan ses 1 dag efter indlejring; EB'er går fra at have glatte kanter til udbulende fremspring, der danner knopper (figur 2C). - Efter 2 dage (DIV9) skal du udføre en halv medieændring. Pas på ikke at aspirere eller beskadige membranmatrixdråberne i processen.
- Efter yderligere 2 dage (DIV11) skal du udføre et fuldt medieskift og supplere mediet med 3 μM CHIR99021 (se materialetabel).
- Ved DIV14 skal du ændre mediet til differentieringsmedier med B27 med vitamin A (tabel 1) for en gradvis stigning i organoidstørrelsen.
- Ved DIV16 placeres brøndpladen på en orbitalryster ved 90 o / min inde i en inkubator. Skift medie hver 2. dag.
- For hver 40 DIV fortyndes 500 μL membranmatrix for hver 50 ml medie for yderligere næringsstoffer i mediet.
Representative Results
Integration af PLGA-fibre, fordybning og omrøring fører til en robust generation af cerebrale organoider, der gør det muligt at opretholde iPSC-afledte kulturer i længere perioder (figur 1).
Figur 1: Skematisk illustration af arbejdsprocessen og tidslinjen for denne metode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den indledende neurale induktionsperiode er sammenlignelig med tidligere offentliggjorte procedurer11. De embryoide legemer (EB) begynder som cirkulære aggregater (figur 2B) med hvide eller gennemsigtige kanter. Når EB ændres fra neurale induktionsmedier til neurale vedligeholdelsesmedier ved DIV7, fremkommer fremspring og spirer inden for 24 timer fra det cirkulære væv (figur 2C). Da organoiden fortsætter med at vokse, hjælper PLGA-fiberens overfladeareal organoiden med at forlænge (figur 2D). Under modning skal organoidens kanter forblive intakte, da det er et godt tegn på sunde celler og udvikling; I modsat fald skal der tilføres yderligere næringsstoffer13 (figur 2E). Organoidernes vækst lettes yderligere ved omrøring af organoidkulturen, da dette forbedrer perfusion med næringsstoffer.
Figur 2: Differentiering og modning af cerebrale organoider . (A) Repræsentativt billede af en iPSC-kultur ved 70%-80% sammenløb. (B) Der blev dannet embryoide legemer (EB'er), og neuroepiteldannelse blev induceret indtil DIV7. EB'er blev derefter indlejret i membranmatrixen og yderligere differentieret mod cerebrale organoider. (C) Organoider ved DIV10, der viser tydelige spirende formationer. Organoider kan modnes yderligere i membranmatrixen ved hjælp af enten (D) fordybning eller (E) sandwichindlejring, her vist på DIV30. (F) Langtidsdyrkning viser, at cerebrale organoider vokser til betydelige størrelser (DIV70). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Organoidens dimensioner og ydre morfologi suppleres med en kompleks arkitektur inde i organoiden. Efter fiksering af vævet ved DIV7 efter den første differentieringsfase udtrykker celler i EB SOX2, en HMG-bokstranskriptionsfaktor, der fungerer som markør for multipotente neurale stamceller21, samt parret proteinboks Pax-6, hvilket indikerer neurale stamceller (figur 3). Umodne neuroner markeret med TuJ1 (klasse III β-tubulin)22 kan allerede ses spredt over hele vævet.
På dette stadium bliver et eksempel på den selvorganisering, som disse organoider går igennem, tydelig. Organiseringen af radiale strukturer, kaldet rosetter, er analog med neuralrøret med SOX2+ celler i rosetcentret21 og PAX6 mod rosetperiferien. Disse rosetter giver anledning til neuroner, når de migrerer ud. Disse udstrålende celler er oprindeligt dobbelt positive for neurale stamceller / stamcellemarkør Nestin23 og glialfibrillært surt protein (GFAP), svarende til den radiale glia, der findes i neurogene områder af in vivo-hjernen . Når disse migrerende neuroner modnes, afspejler de cytoskeletale markører denne ændring22. Den tidlige fase neurale differentieringsmarkør TuJ1 22 er synlig i rosettens indre cirkel og skifter til mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2 )24, en neuronspecifik modningsmarkør i periferien.
Figur 3: Embryoidlegemer ved DIV7 viser strukturel organisation og umoden karakterisering. Helmonteret immunhistokemisk billede af en EB ved DIV7. (A) Et sammensat billede af EB, der viser (B) SOX2+ neurale rosetter, (C) umodne neuroner (TUJ1) spredt over hele EB, (D) neurale stamceller (PAX6) og (E) kerner visualiseret af DAPI. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når organoiderne bliver ældre, begynder organisationen og markørerne for de udviklende neuroner at replikere fysiologiske tilstande. Ved DIV30 kan mange rosetter, der giver anledning til neurogene områder svarende til den udviklende hjerne, observeres25. Ved DIV60 er disse SOX2+ neurogene regioner ikke-eksisterende og erstattes af modne MAP2 og NeuN26, en neurondifferentieringsmarkør og positive neuroner (figur 4 og figur 5).
Figur 4: Organoider ved DIV120 viser moden neuronal karakterisering. Immunhistokemisk billede af et organoidt snit ved DIV 120. (A) Et sammensat billede af sektionen, der viser modne neuronale markører for (B) MAP2 (lilla) og (C) NeuN (grøn). (D) Kerner blev visualiseret af DAPI. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Digital dråbe-PCR af DIV120-organoider. Digitale dråbe-PCR-grafer, der viser den absolutte ekspressionsværdi af (A) MAP2 (øverst, blå) og (B) NeuN (nederst, grøn). Skråstregede gule linjer adskiller forskellige iPSC-linjer (A, B, C osv.), Og organoider er blevet batchet sammen. N = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.
Disse cytoskeletale markører kan bruges sammen med andre postmitotiske markører (som doublecortin27 og synapsin28) til at sonde for synaptisk plasticitet og andre aldersrelaterede fald (figur 6) samt yderligere hjernevæv som astrocytter og glia (figur 7).
Figur 6: Eksempel på synaptisk terminalanalyse. Immunohistokemisk billede af et udsnit af organoid ved DIV 120. (A) Et sammensat billede af sektionen farvet til (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) og (D) synapsin I (SYN). (E) Kerner blev visualiseret af DAPI. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Bevis for glialudvikling. Immunohistokemisk billede af et udsnit af organoid ved DIV 120. (A) Et sammensat billede af sektionen farvet for (B) ioniseret calciumbindende adaptormolekyle 1 (Iba1) og (C) NeuN. (D) Kerner blev visualiseret af DAPI. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Endelig koncentration | Volumen (50 ml i alt) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Neurobasalt medium | 50% | 25 ml |
| N2 Tillæg (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Supplement -/+ Vitamin A (50x) | 0.5x | 0,5 ml |
| Insulin | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0.5x | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotikum/Antimykotisk (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-mercaptoethanol | 50 μM | 17,5 μL |
| *BEMÆRK: nogle DMEM-F12 indeholder allerede GlutaMAX, ingen grund til at tilføje yderligere. | ||
Tabel 1: Sammensætningen af de differentieringsmedier, der er anvendt i nærværende undersøgelse.
Discussion
Den standardiserede dannelse af EB'er er et kritisk skridt i den reproducerbare omdannelse af pluripotente stamceller til hjerneorganoider. Kraftaggregeringen af stamceller i enkeltvæv kan variere afhængigt af geometrien af de konkave brønde, såtæthed og brøndbehandling. Selvom den nuværende metode nævner et diameterområde på 500-600 μm efter 6 dage, udelukker disse diametre ikke andre diametre med korrekt organoiddannelse, da mange andre diametre har vist sig vellykkede. Imidlertid har varierende diametre vist sig at påvirke differentieringshastigheder og succes29. Af hensyn til reproducerbarheden anbefales diametervariationer under 50 μm stærkt20. Derudover kan antallet af neurale induktionsdage forlænges fra 6 til 10 dage for at give EB'erne mulighed for at vokse i diameter, da brugen af SMAD-hæmmere har vist sig effektivt at producere og opretholde neuroepiteldannelse efter kun 5 dages eksponering30. I fravær af SMAD-hæmmere kan neural induktion give inkonsekvente resultater, hvilket kræver længere induktionsperioder. SMAD-hæmmere citeret i dette arbejde er de mest effektive, men andre dorsomorphin og TGF-β små molekyler kan anvendes i deres effektive koncentration.
Kældermembranmatrixen giver et fremragende substrat til vækst og kan administreres forskelligt. Tidlige anvendelser af matrixen omfattede basalmembranen som en brøndbelægning31. Anvendelsen af matrixen til indlejring af væv viste sig imidlertid at forbedre differentiering og modning i disse væv32. For organoider har brugen af matrixen vist sig at forbedre EB-differentiering i organoider, fremme modning og forlænge dyrkningsperioder33. Mens organoider stadig kan dannes uden matrixen, da mange grupper har stræbt efter at opnå en matrixfri vævskultur 34,35, har undersøgelser vist, at de matrixindlejrede organoider har en større chance for langvarige dyrkningstider og kræver mindre vedligeholdelse36. Dimple-metoden til indlejring giver lige dækning af organoidoverfladen, hvilket sikrer lignende diffusion, adgang til næringsstoffer og reproducerbar differentiering. Alternativt kan kuppelindlejring anvendes til fuldt ud at indkapsle organoiderne37.
Overførslen af EB'erne til membranmatrixfordybningerne er et kritisk skridt. Selvom en 1 ml pipettespids har en bred nok åbning til at overføre EB'erne, foretrækkes en 200 μL spids for nem overførsel. De 200 μL spidser skal skæres for at skabe en tilstrækkelig stor åbning, hvilket sikrer en glat kant for at reducere forskydningsspændingen ved pipettering. Alternativt findes der bredborede 200 μL spidser for nem overførsel. Pipettering skal udføres langsomt, da hurtig pipettering kan forstyrre den organoide periferi og hindre korrekt vækst. Der skal lægges særlig vægt på at sikre, at der overføres tilstrækkeligt medium til at give næringsstoffer. For lidt medium risikerer at tørre organoiden ud og forårsage nekrose. Overførsel af EB med for meget kulturmedie kan medføre, at matrixen bliver for fortyndet og undlader at indkapsle organoiden sikkert. Ideelt set må matrixen ikke fortyndes med mere end 50% for at sikre dens polymerisation og funktion som en ECM for EB'erne. Hvis indlejringen ikke lykkes, kan EB gendannes og genindkapsles. Genindkapsling i den friske matrix kan gøres på ethvert tidspunkt for at give organoiden yderligere støtte.
I lighed med matrixindlejring til stilladser giver PLGA-fibre yderligere støtte til tredimensionel vækst. Oprindeligt inkorporeret for at producere aflange organoider og øge overfladearealet38, er inkorporeringen af PLGA-fibre gradvist blevet identificeret som et ekstra værktøj til forbedring af organoiddifferentiering og modning39. Da flere laboratorier ser ud til at reducere brugen af matrixen eller afskaffe den helt, giver de selvorganiserende egenskaber af organoider, der understøttes af de inkorporerede fibre, nok stilladser til tredimensionel vævsdannelse og differentiering39. Her blev begge metoder kombineret for at øge chancerne for langsigtet kultur38,39. Inkorporeringen af fibre under den indledende aggregering er kritisk, da disse muligvis ikke introduceres på et senere tidspunkt. Efter centrifugering vil kontrol af, at et par fibre er blandt de aggregerede celler, sikre, at en fiber er inkorporeret i EB. Hvis det ikke lykkes, bør en blid aspiration af brønden og gencentrifugering sikre blanding.
Et andet kritisk trin i organoid vedligeholdelse er introduktionen af en orbital shaker for bedre medieperfusion. I tidlige iterationer af organoidprotokoller blev en roterende bioreaktor brugt til at skabe agitation11. En orbital shaker ved 90 o / min giver tilstrækkelig omrøring uden at ødelægge matrixdråben eller beskadige organoid morfologi. Nogle grupper afholder sig fra at bruge matrixstilladset, men bevarer rysteruro for at skabe et passende miljø34. Som med alle protokoller skal rotationshastigheden justeres afhængigt af rysteren for at reducere mængden af forskydningsspænding. Hvis der blev valgt en kuppelindlejring, kunne en vippet ryster anvendes til at reducere mængden af forskydningsspænding11,34.
Samlet set giver integrationen af flere udvalgte teknikker en robust metode til iPSC-afledt organoiddannelse. Der er flere måder at skabe og vedligeholde organoider på, men mange af dem fokuserer på tidlige differentieringsbaner. I dette arbejde blev flere forskellige teknikker kombineret til kulturorganoider i længere perioder, forbi differentieringsfasen og ind i en modningsperiode, hvor aldrende fænotyper kan begynde at udvikle sig. Inkorporering af disse teknikker muliggør langvarig modning uden behov for eksogene biologiske faktorer for at opretholde kulturerne, bevare selvorganiseringen og den naturlige progression af aldring.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det nederlandske organ-on-chip-initiativ, et NWO gravitationsprojekt (024.003.001) finansieret af den nederlandske regerings ministerium for uddannelse, kultur og videnskab. D.C.B. anerkender heldigvis den økonomiske støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form af et ph.d.-stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
