Summary
본 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성, 유지 및 노화를 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법은 장기간 대뇌 오가노이드를 배양하고 성숙시킬 수 있어 뇌 노화 및 노화 관련 병인과 관련된 과정의 모델링을 용이하게 합니다.
Abstract
현재 이용 가능한 동물 및 세포 모델은 노화 된 인간 뇌에서 일어나는 변화의 복잡성을 완전히 요약하지 못합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 인간 대뇌 오가노이드의 생성을 설명하는 절차의 최근 개발은 인간 뇌 및 관련 병원성 과정의 노화를 모델링하고 이해하는 능력을 근본적으로 변화시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 인간 iPSC 유래 대뇌 오가노이드의 생성, 유지, 노화 및 특성화를 위한 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 방식으로 뇌 오가노이드를 생성하기 위해 구현될 수 있으며 배양에서 오가노이드 성숙 및 노화를 개선하는 최신 기술을 통합하는 단계별 가이드 역할을 합니다. 오가노이드 성숙, 괴사, 변동성 및 배치 효과와 관련된 특정 문제가 해결되고 있습니다. 종합하면, 이러한 기술 발전은 다양한 젊은이와 노인 인간 기증자뿐만 아니라 노화 관련 뇌 질환을 앓고 있는 개인으로부터 파생된 오가노이드의 뇌 노화를 모델링하여 인간 뇌 노화의 생리학적 및 병원성 메커니즘을 식별할 수 있게 합니다.
Introduction
노화 질병 모델은 인간의 기대 수명이 계속 증가함에 따라 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 대규모 게놈 연구를 통해 분자 과정의 조절 장애와 삶의 질에 영향을 미치는 유전적 변화가 있는 고령 인구가 발견되었습니다1. 노화 과정은 인지 기능 상실, 신경퇴행성 질환 위험 증가, 다수의 만성 질환 등 유기체의 전반적인 기능 상실을 특징으로 한다2.
현재의 세포 배양 기술은 돌연변이, 독소 또는 감염을 사용하여 이러한 기능 장애를 적절하게 복제할 수 없기 때문에 노화의 다인성 특성을 적절하게 나타내지 않습니다3. 노화 과정을 탐구하는 동물 모델은 종종 긴 실험 시간과 높은 비용과 관련이 있지만 윤리적 고려 사항도 함께 가져옵니다. 환자의 유도만능줄기세포(유도만능줄기세포, iPSC)를 사용하면 iPSC가 세포가 성숙한 조직으로 자연적으로 발달할 수 있기 때문에 질병 진행의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있다3. iPSC는 신경퇴행성 질환을 연구하는 많은 실험실에서 사용하게 되었는데, 이는 수확된 세포의 세포 재프로그래밍이 기증자의 질병이나 노화 흔적을 지우지 않는 것처럼 보이기 때문이다4. 이러한 각인은 인간 및 동물 모델에서 입증된 세포 표현형을 요약하여 iPSC를 고밀도 뇌 조직의 개별 세포 악화를 검사하는 데 적합하게 만듭니다 5,6. IPSC 유래 오가노이드는 조직의 3차원 배양을 위한 탁월한 모델이 되어 보다 복잡한 세포 간 상호 작용과 개선된 발달 요약을 가능하게 합니다. 오가노이드는 주로 발달 데이터에 사용되지만, 질병 모델링, 특히 염증, 신경변성 및 노화 모델에 점점 더 많이 적용되고 있다7. 이전의 iPSC 연구를 기반으로 오가노이드는 조직과 같은 네트워크 연결의 생리학적 맥락에서 질병 표현형과 세포 표현형을 유지합니다 8,9. 그러나 특정 치수의 3차원 조직을 배양하는 것은 특히 오랜 기간 동안 어려울 수 있습니다.
이 연구는 조직이 더 오랜 기간 동안 크기가 상당히 성숙할 수 있도록 하는 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성에 대한 자세한 방법을 제시합니다. 대뇌 오가노이드 생성은 몇 가지 저명한 프로토콜의 방법을 채택하여 비교적 표준화된 상태로 유지되었습니다10,11. 그러나 차별화 및 유지 관리를 개선하기 위해 몇 가지 수정 사항이 제안되었습니다. 이러한 대체 방법으로는 신경 분화를 강화하기 위한 신경성 인자를 사용하는 것12, 세포 수명을 촉진하는 영양소 교환 개선을 위한 추가 스캐폴드13, 배양 및 성장 연장을 위한 저스트레스 교반14 등이 있다. 이러한 개선 사항은 신경퇴행성 및 노화 표현형을 발현할 수 있는 성숙한 오가노이드를 개발하기 위해 이 방법에 통합되었습니다.
Protocol
환자 연구는 Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 데이터와 생물 표본의 용도를 변경할 수 있도록 서면 동의서 및 저장소 동의서에 서명했습니다. iPSC 라인은 IRB 및 기관 지침에 따라 생성되었습니다. 그림 1 은 이 프로토콜의 워크플로에 대한 개략적인 개요를 보여줍니다.
1. iPSC 재프로그래밍 및 유지보수
- 피험자의 혈액 8mL(노인 또는 질병 환자, 65세 이상)를 구연산나트륨이 포함된 세포 준비 튜브(CPT) 또는 EDTA 또는 헤파린 튜브에 수집합니다.
- 실온(RT)에서 30분 동안 1,800 x g 에서 원심분리하여 말초 혈액만 함유하고 혈청15는 포함하지 않는 펠릿을 수집합니다.
- 제조업체의 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 특수 재프로그래밍 벡터를 사용하여 iPSC16을 얻습니다.
- 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 피더가 없는 락토오스 탈수소효소 상승 바이러스(LDEV)가 없는 환원 성장 인자 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 배양 플레이트에서 iPSC를 Essential 8(E8) 배지(재료 표 참조)에서 배양합니다.
- 과밀 또는 자발적인 분화를 피하기 위해 E8 배지에서 3-4일 동안 iPSC를 유지합니다.
- 면역형광 마커를 사용하여 iPSC 라인의 다능성을 검증하고(2단계) 마이코플라스마를 테스트합니다(3단계).
2. 뱃멌성 염색
- 용액 및 항체를 보존하기 위해, 분석 3-4일 전에 코팅된(단계 1.4) 24-웰 배양 플레이트에 세포를 시딩한다. 피펫으로 배지를 흡인하고 RT에서 15-20분 동안 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 4% 포름알데히드로 세포를 고정합니다.
- 세포를 1x PBS로 3배 세척하고 PBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA) 중 0.1% Triton-X 100으로 최소 15분 동안 투과화하지만 RT에서 1시간 이하로 투과합니다.
- 1x PBS로 3x 세척하고 RT에서 30분 동안 PBS에서 5% BSA로 차단합니다.
- 다시 1x PBS로 3x 세척하고, 항체 Sox2 및 Oct3/4 (1:100 희석; 물질 표 참조) 및 핵 염색 DAPI를 4°C에서 밤새 1% BSA (1:4,000 희석)에 첨가한다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸십시오.
- 1x PBS로 3x 세척하고 PBS에 세포를 남겨 둡니다. 10-20x 배율의 형광 현미경으로 이미지. 다능성 마커 Sox2 및 Oct3/4가 세포의 핵에 국한되어 있는지 확인하십시오17,18.
3. 마이코플라스마 검사
알림: 자세한 분석 실행 및 분석 단계는 검출 키트의 프로토콜( 재료 표 참조)을 참조하십시오. 검출 키트는 마이코플라스마 검사를 위한 시약, 기질 및 분석 완충액을 제공합니다.
- 세포 또는 상쾌한 배지를 계대하기 전에 원심분리 튜브에 2-3mL의 세포 배양 배지를 수집하고 RT에서 5분 동안 200 x g 에서 임의의 세포 또는 파편을 펠릿화합니다. 상청액을 4°C에서 ≤5일 동안 보관합니다. 검출 가능한 신호를 보장하기 위해 최소 24시간 동안 배지와 함께 세포를 배양합니다.
- 100μL의 세포 상청액을 흰색 벽으로 된 96웰 플레이트의 새 튜브 또는 웰에 추가합니다(불투명한 바닥 권장, 재료 표 참조). 시약과 기질을 분석 완충액으로 재구성하고 RT에서 15분 동안 평형을 이룹니다.
- 100μL의 시약을 샘플에 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 광도계(측정 #1)로 발광을 측정합니다.
- 100 μL의 기질을 샘플에 첨가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 발광을 측정합니다(측정 #2).
- 측정 #2와 #1의 비율로 마이코플라스마 오염을 결정합니다. 결과 해석은 키트 설명서를 참조하십시오.
4. 마이크로필라멘트 준비
- 메스의 뭉툭한 끝으로 봉합사 가닥을 닳게 하여 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA, 재료 표 참조) 마이크로필라멘트의 준비를 시작합니다. 닳은 섬유를 70% 에탄올로 가볍게 중성화합니다.
- 현미경 하에서 그리고 자를 사용하여, PLGA 섬유를 500 μm 내지 1 mm 길이의 가닥의 조각으로 절단하기 시작한다. 총 약 25mm의 섬유를 자릅니다. 필라멘트를 1mL 항생제-항진균 용액과 함께 15mL 튜브에 보관합니다.
- 후드에서 섬유 용액을 DMEM/F-10 mL로 희석합니다(표 1). 용액을 잘 섞기 위해 잘 소용돌이.
참고: 무균 환경의 세포 배양 흐름 후드에서 작업하십시오.
- 후드에서 섬유 용액을 DMEM/F-10 mL로 희석합니다(표 1). 용액을 잘 섞기 위해 잘 소용돌이.
- 20 μL의 섬유 용액을 96-웰 플레이트의 3개의 배아체(EB) 형성 웰에 첨가한다. 명시야 현미경 검사에서 웰당 섬유를 계산하고 평균을 구합니다. 웰 당 평균 5-10 PLGA 마이크로 필라멘트로 희석하거나 농축하십시오. 이런 식으로 각 우물을 준비하십시오.
- 이제 우물에 세포를 뿌릴 준비가 되었습니다. 필요할 때까지 플레이트를 실온에서 보관하거나 다음 날 4°C에서 보관하십시오.
5. 배아체(EB) 형성
알림: 모든 미디어와 솔루션은 RT로 예열되어야 합니다.
- iPSC가 70%-80% 밀도에 도달하면 (그림 2A) 통과하여 EB 형성에 사용할 준비가 된 것입니다. 10x-20x 배율의 현미경으로 세포를 확인하십시오. 콜로니가 자발적인 분화의 최소(<10%) 영역을 나타내는지 확인합니다.
- 피펫으로 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. 500 μL의 세포 분리 용액 ( 물질 표 참조) 또는 0.5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 첨가하여 콜로니를 해리시키고 37 °C에서 3-5 분 동안 배양한다.
참고: 무균 환경의 세포 배양 흐름 후드에서 작업하십시오. - 각 웰에 1mL의 신선한 E8 배지를 추가하여 방출된 세포를 수집하고 모든 세포가 분리될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
- 1.5mL의 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 1mL의 새로운 E8 배지를 추가로 추가하여 총 부피가 2.5mL가 되도록 합니다.
- RT에서 290 x g 에서 3분 동안 원심분리기.
- 피펫으로 상청액을 흡인하고, 50 μM ROCK 억제제가 보충된 1 mL의 에센셜 6 (E6, 재료 표 참조) 배지에 세포 펠릿을 재현탁시키고, 혈구계19를 사용하여 세포를 계수한다.
- 60,000μM의 ROCK 억제제가 보충된 E90,000 배지에서 원하는 파종 밀도에 따라 50-50 cells/mL의 세포 현탁액을 준비합니다( 재료 표 참조).
- 150 μL의 세포 현탁액을 96-웰 ULA 플레이트 (또는 제조된 오목 플레이트20)의 각 웰에 첨가한다. 웰 당 9,000-11,000 개의 세포를 시드합니다.
- 플레이트를 원심분리하여 세포를 RT에서 1분 동안 290 x g 에서 강제 응집하고, 플레이트를 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C의 인큐베이터에 놓는다.
6. 신경상피 유도
- 24시간 후 피펫으로 배지 120μL를 조심스럽게 흡입합니다. 피펫 팁을 웰 안으로 너무 멀리 내려 EB를 흡인하지 않도록 하십시오.
- 2 μM의 XAV939 및 SMAD 억제제로 보충된 150 μL의 E6 배지(실온에서)를 추가합니다: 웰당 10 μM의 SB431542 및 500 nM의 LDN 193189 ( 재료 표 참조).
- 2μM의 XAV939, 10μM의 SB431542 및 500nM의 LDN 193189로 보충된 새로 준비된 E6 배지로 매일 배지를 교체하십시오.
참고: 6일차(DIV6)까지 EB는 직경이 550-600μm이고 추가 분화를 준비해야 합니다.
7. 오가노이드 분화 및 성숙
알림: 모든 미디어는 RT로 예열해야 합니다.
- 대략 DIV7에서 모든 EB가 550-600 μm의 직경에 도달했는지 확인하고 매끄럽고 선명한 가장자리를 표시합니다 (그림 2B). 이 단계에서 그들은 세포 외 기질 (ECM)에 내장 될 준비가되었습니다.
알림: 무균 환경에서 작업하십시오. - 빈 P4 상자에 필름 시트(약 200인치 길이)를 놓아 열가소성 밀봉 필름( 재료 표 참조)에서 딤플 임베딩 시트를 준비합니다. 15mL 원뿔형 튜브 또는 500μL 미세 원심분리 튜브를 사용하여 필름 시트를 구멍에 부드럽게 눌러 12개의 딤플을 만듭니다. 필름 시트에 70% 에탄올을 뿌리고 UV 라이트를 켠 상태에서 플로우 후드 내부에서 최소 30분 동안 건조시킵니다.
- 충분한 양의 기저막 매트릭스(Matrigel, 재료 표 참조)를 얼음 위에서 해동하고 플로우 후드 안에 넣습니다.
참고: EB당 약 30μL의 희석되지 않은 멤브레인 매트릭스가 필요합니다. 멤브레인 매트릭스가 겔화되는 것을 방지하기 위해 항상 4 °C 미만으로 유지하십시오. 사전 냉각된 피펫 팁은 피펫팅 중에 팁에서 매트릭스가 중합되는 속도를 늦추어 재료 손실을 줄이기 때문에 권장됩니다. - 광구경 P200 팁을 사용하여 각 딤플에 하나의 EB를 옮기고 일반 파이펫 팁으로 가능한 한 많은 배지를 제거합니다. EB가 마르지 않도록 주의하십시오. 일반 P200 팁을 사용하여 각 오가노이드에 ~30μL의 희석되지 않은 멤브레인 매트릭스를 추가하여 EB가 액적의 중심에 오도록 합니다.
- 모든 EB가 매트릭스에 내장되면 EB가 포함된 필름 시트를 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
알림: 선택적으로 멸균수로 채워진 작은 페트리 접시를 필름 시트 옆에 있는 더 큰 페트리 접시에 넣어 증발을 방지할 수 있습니다.- 접시를 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 5%CO2 로 가습된 분위기에서 약 10분 동안 인큐베이션하여 막 매트릭스가 고형화되도록 합니다.
- 내장된 12개의 오가노이드 세트마다 ULA 6웰 플레이트의 한 웰에 비타민 A가 없는 B27이 포함된 분화 배지 5mL(표 1)를 준비합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 예열합니다.
- 배양 시간이 끝나면 필름 시트를 가져 와서 시트 뒷면에서 딤플을 밀어 냄으로써 내장 된 EB를 ULA 6 웰 플레이트로 옮깁니다. 필요한 경우 웰에서 1mL를 꺼내 시트에 피펫하여 물방울이 필름에서 분리되도록 합니다.
참고: 중요한 형태학적 변화는 임베딩 후 1일 후에 볼 수 있습니다. EB는 가장자리가 매끄럽게 변하는 것에서 새싹을 형성하는 돌출부가 부풀어 오르는 것으로 바뀝니다(그림 2C). - 2일(DIV9) 후 반 미디어 교체를 수행합니다. 이 과정에서 멤브레인 매트릭스 방울을 흡인하거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 2일 후(DIV11), 3μM의 CHIR99021로 배지를 보충하면서 전체 배지 교체를 수행합니다( 재료 표 참조).
- DIV14에서 오가노이드 크기의 점진적인 증가를 위해 배지를 비타민 A와 함께 B27이 포함된 분화 배지로 변경(표 1).
- DIV16에서 웰 플레이트를 인큐베이터 내부의 90rpm으로 궤도 셰이커에 놓습니다. 2일마다 미디어를 교체합니다.
- 40 DIV마다 배지 50mL마다 멤브레인 매트릭스 50μL를 희석하여 배지의 추가 영양소를 제공합니다.
Representative Results
PLGA 섬유, 딤플 임베딩 및 교반을 통합하면 iPSC 유래 배양을 장기간 유지할 수 있는 강력한 대뇌 오가노이드 생성이 가능합니다(그림 1).
그림 1: 이 방법의 워크플로 및 타임라인에 대한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초기 신경 유도 기간은 이전에 발표된 절차(11)와 비슷하다. 배아체(EB)는 가장자리가 흰색 또는 투명한 원형 응집체(그림 2B)로 시작합니다. EB가 DIV7에서 신경 유도 매질에서 신경 유지 매질로 변경됨에 따라 원형 조직에서 24시간 이내에 돌출부와 출아가 나타납니다(그림 2C). 또한, 오가노이드가 계속 성장함에 따라 PLGA 섬유의 표면적은 오가노이드가 늘어나는 데 도움이 됩니다(그림 2D). 성숙하는 동안 오가노이드의 가장자리는 건강한 세포와 발달의 좋은 신호이기 때문에 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 그렇지 않으면, 추가적인 영양소가 제공되어야 한다13 (그림 2E). 오가노이드의 성장은 오가노이드 배양의 교반에 의해 더욱 촉진되는데, 이는 영양소 관류를 향상시키기 때문입니다.
그림 2: 대뇌 오가노이드의 분화 및 성숙 . (A) 70%-80% 합류도에서 iPSC 배양의 대표 이미지. (B) 배아체(EB)가 생성되고 DIV7까지 신경상피 형성이 유도되었습니다. 그런 다음 EB는 막 매트릭스에 내장되고 대뇌 오가노이드로 더욱 분화되었습니다. (C) 뚜렷한 출아 형성을 나타내는 DIV10의 오가노이드. 오가노이드는 (D) 딤플 또는 (E) 샌드위치 임베딩을 사용하여 멤브레인 매트릭스에서 추가로 성숙될 수 있습니다(여기 DIV30에 표시됨). (F) 장기 배양은 대뇌 오가노이드가 상당한 크기로 성장하는 것을 보여줍니다(DIV70). 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오가노이드의 치수와 외부 형태는 오가노이드 내부의 복잡한 구조로 보완됩니다. 분화의 첫 번째 단계 후 조직을 DIV7에 고정한 후, EB의 세포는 다분화능 신경 줄기 세포21의 마커 역할을 하는 HMG 상자 전사 인자인 SOX2와 신경 전구 세포를 나타내는 쌍을 이루는 단백질 상자 Pax-6을 발현합니다(그림 3). TuJ1(클래스 III β-튜불린)22 로 표시된 미성숙 뉴런은 이미 조직 전체에 흩어져 있는 것을 볼 수 있습니다.
이 단계에서 이러한 오가노이드가 겪는 자기 조직화의 예가 분명해집니다. 로제트라고 하는 방사형 구조의 조직은 신경관과 유사하며, 로제트 중심21에 SOX2+ 세포가 있고 로제트 주변을 향한 PAX6이 있습니다. 이 로제트는 밖으로 이동할 때 뉴런을 생성합니다. 이 방사 세포는 생체 내 뇌의 신경성 영역에서 발견되는 방사상 신경교와 유사한 신경 줄기/전구 세포 마커 Nestin23 및 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP)에 대해 초기에 이중 양성입니다. 이러한 이동하는 뉴런이 성숙함에 따라 세포골격 마커는 이러한 변화를 반영한다22. 초기 단계의 신경 분화 마커 TuJ1 22는 로제트의 안쪽 원에서 볼 수 있으며 말초의 뉴런 특이적 성숙 마커인 미세소관 관련 단백질 2(MAP2)24로 이동합니다.
그림 3: DIV7의 배아체는 구조적 조직과 미성숙한 특성을 보여줍니다. DIV7에서 EB의 전체 마운트 면역조직화학 이미지. (A) (B) SOX2+ 신경 로제트, (C) EB 전체에 흩어져 있는 미성숙 뉴런(TUJ1), (D) 신경 전구 세포(PAX6) 및 (E) DAPI로 시각화된 핵을 표시하는 EB의 합성 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오가노이드가 노화됨에 따라 발달 중인 뉴런의 조직과 마커가 생리적 조건을 복제하기 시작합니다. DIV30에서는 발달 중인 뇌와 동등한 신경성 영역을 생성하는 많은 로제트를 관찰할 수 있다25. DIV60에 의해 이러한 SOX2+ 신경원성 영역은 존재하지 않으며 성숙한 MAP2 및 NeuN26, 뉴런 분화 마커 및 양성 뉴런으로 대체됩니다(그림 4 및 그림 5).
그림 4: DIV120의 오가노이드는 성숙한 신경 특성 분석을 보여줍니다. DIV 120에서 오가노이드 섹션의 면역조직화학 이미지. (A) (B) MAP2(보라색) 및 (C) NeuN(녹색)의 성숙한 신경 마커를 보여주는 섹션의 합성 이미지. (D) 핵은 DAPI에 의해 시각화되었습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: DIV120 오가노이드의 디지털 액적 PCR. (A) MAP2(상단, 파란색) 및 (B) NeuN(하단, 녹색)의 절대 발현값을 나타내는 디지털 액적 PCR 그래프. 슬래시된 노란색 선은 서로 다른 iPSC 라인(A, B, C 등)을 분리하고 오가노이드를 함께 배치했습니다. N = 5입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 세포골격 마커는 다른 유사분열 후 마커(예: 더블코르틴27 및 시냅신28)와 함께 사용하여 시냅스 가소성 및 기타 노화 관련 감소(그림 6)뿐만 아니라 성상교세포 및 신경교세포와 같은 추가 뇌 조직(그림 7)을 조사할 수 있습니다.
그림 6: 시냅스 말단 분석의 예. DIV 120에서 오가노이드 부분의 면역조직화학 이미지. (A) (B) MAP2, (C) 더블코르틴(DCX) 및 (D) 시냅신 I(SYN)에 대해 염색된 섹션의 합성 이미지. (E) 핵은 DAPI에 의해 시각화되었다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 신경교세포 발달의 증거. DIV 120에서 오가노이드 부분의 면역조직화학 이미지. (A) (B) 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba1) 및 (C) NeuN에 대해 염색된 섹션의 합성 이미지. (D) 핵은 DAPI에 의해 시각화되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 최종 농도 | 용량(총 50mL) |
| DMEM-F12〈블랙〉 | 50% | 25 mL |
| Neurobasal 배지 | 50% | 25 mL |
| N2 보충제 (100x) | 1배 | 0.25 밀리리터 |
| B27 보충제 -/+ 비타민 A (50x) | 0.5배 | 0.5 밀리리터 |
| 인슐린 | 0.25% | 12.5 마이크로리터 |
| 글루타맥스(100x) | 1배 | 0.5 밀리리터 |
| MEM-NEAA (100배) | 0.5배 | 0.25 밀리리터 |
| 헤페스 (1m) | 10 밀리엠 | 0.5 밀리리터 |
| 항생제/항진균제(100x) | 1배 | 0.5 밀리리터 |
| 2-β-메르캅토에탄올 | 50 마이크로미터 | 17.5 μL |
| *참고: 일부 DMEM-F12에는 이미 GlutaMAX가 포함되어 있으므로 추가할 필요가 없습니다. | ||
표 1: 본 연구에 사용된 분화 배지의 조성.
Discussion
EB의 표준화된 형성은 만능 줄기 세포를 뇌 오가노이드로 재현 가능한 전환시키는 데 중요한 단계입니다. 줄기 세포가 단일 조직으로 강제로 응집되는 것은 오목한 우물의 기하학적 구조, 파종 밀도 및 우물 처리에 따라 달라질 수 있습니다. 현재의 방법은 6일 후 500-600 μm의 직경 범위를 인용하지만, 다른 많은 직경이 성공적인 것으로 입증되었기 때문에 이러한 직경은 적절한 오가노이드 형성의 다른 직경을 배제하지 않습니다. 그러나 다양한 직경이 차별화 속도와 성공에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다29. 재현성을 위해 50 μm 미만의 직경 변화를 적극 권장합니다20. 또한, SMAD 억제제를 사용하면 노출 후 5일 만에 신경상피 형성을 효율적으로 생성하고 유지하는 것으로 나타났기 때문에 신경 유도 일수를 6일에서 10일로 연장하여 EB의 직경이 성장할 수 있습니다30. SMAD 억제제가 없는 경우 신경 유도는 일관되지 않은 결과를 생성할 수 있으며 더 긴 유도 기간이 필요합니다. 이 연구에서 인용 된 SMAD 억제제가 가장 효과적이지만 다른 도르 소 모르핀 및 TGF-β 소분자를 유효 농도로 사용할 수 있습니다.
기저막 매트릭스는 성장을위한 우수한 기질을 제공하며 다르게 투여 할 수 있습니다. 매트릭스의 초기 용도는 웰 코팅(31)으로서 기저막을 포함하였다. 그러나, 조직을 포매하기 위한 매트릭스의 사용은 이들 조직에서 분화 및 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다32. 오가노이드의 경우, 매트릭스를 사용하면 EB가 오가노이드로 분화되는 것을 개선하고, 성숙을 촉진하며, 배양 기간을 연장하는 것으로 나타났다33. 오가노이드는 매트릭스 없이도 형성될 수 있지만, 많은 그룹이 매트릭스가 없는 조직 배양을 달성하기 위해 노력했기 때문에34,35, 연구에 따르면 매트릭스 포매 오가노이드는 배양 시간이 길어질 가능성이 더 높고 유지 관리가 덜 필요하다는 사실이 밝혀졌습니다 36. 딤플 포매 방법은 오가노이드 표면의 동일한 커버리지를 제공하여 유사한 확산, 영양소에 대한 접근 및 재현 가능한 분화를 보장합니다. 대안적으로, 돔 임베딩은 오가노이드(37)를 완전히 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다.
EB를 멤브레인 매트릭스 딤플로 전달하는 것은 중요한 단계입니다. 1mL 피펫 팁은 EB를 이송할 수 있을 만큼 충분히 넓은 입구를 가지고 있지만, 이송의 용이성을 위해 200μL 팁이 선호됩니다. 200 μL 팁을 절단하여 충분히 큰 개구부를 만들어야 하며, 피펫팅 시 전단 응력을 줄이기 위해 가장자리가 매끄럽게 보장됩니다. 또는 쉽게 이동할 수 있도록 광구경 200μL 팁이 있습니다. 빠른 피펫팅은 오가노이드 주변을 방해하고 적절한 성장을 방해할 수 있으므로 천천히 수행해야 합니다. 영양분을 공급하기에 충분한 배지가 옮겨지도록 특별한 주의를 기울여야 합니다. 배지가 너무 적으면 오가노이드가 건조되어 괴사를 일으킬 위험이 있습니다. 너무 많은 배양 배지로 EB를 옮기면 매트릭스가 너무 희석되어 오가노이드를 안전하게 캡슐화하지 못할 수 있습니다. 이상적으로, 매트릭스는 중합을 보장하고 EB의 ECM으로 기능하기 위해 50% 이상 희석되어서는 안 됩니다. 임베딩에 실패하면 EB를 복구하고 다시 캡슐화할 수 있습니다. 신선한 매트릭스에서 재캡슐화는 오가노이드에 추가 지지를 제공하기 위해 어느 시점에서나 수행할 수 있습니다.
스캐폴딩을 위한 매트릭스 임베딩과 유사하게, PLGA 섬유는 3차원 성장을 위한 추가적인 지원을 제공한다. 본래 길쭉한 오가노이드를 생산하고표면적을 증가시키기 위해 혼입된 PLGA 섬유의 혼입은 오가노이드 분화 및 성숙을 개선하기 위한 추가적인 도구로서 점진적으로 확인되었다39. 더 많은 실험실에서 매트릭스의 사용을 줄이거나 완전히 폐지하려고 함에 따라, 통합된 섬유에 의해 지지되는 오가노이드의 자기 조직화 특성은 3차원 조직 생성 및 분화를 위한 충분한 스캐폴딩을 제공합니다39. 여기에서 두 가지 방법을 결합하여 장기 배양 기회를 높였습니다38,39. 초기 응집 동안 섬유의 통합은 나중 단계에서 도입되지 않을 수 있으므로 매우 중요합니다. 원심분리 후, 응집된 세포 사이에 몇 개의 섬유가 있는지 확인하면 섬유가 EB에 통합되는지 확인할 수 있습니다. 성공하지 못하면 우물의 부드러운 흡인과 재 원심 분리가 혼합을 보장해야합니다.
오가노이드 유지 관리의 또 다른 중요한 단계는 더 나은 매체 관류를 위한 오비탈 셰이커의 도입입니다. 오가노이드 프로토콜의 초기 반복에서, 교반을 생성하기 위해 회전하는 생물반응기가 사용되었다11. 90rpm의 오비탈 쉐이커는 매트릭스 액적을 파괴하거나 오가노이드 형태를 손상시키지 않으면서 충분한 교반을 제공합니다. 일부 그룹은 매트릭스 스캐폴드를 사용하는 것을 자제하지만 적절한 환경(34)을 제공하기 위해 쉐이커 교반을 유지한다. 모든 프로토콜과 마찬가지로 전단 응력의 양을 줄이기 위해 Shaker에 따라 회전 속도를 조정해야 합니다. 돔 임베딩이 선택되면, 전단 응력(11,34)의 양을 줄이기 위해 기울어 진 쉐이커를 사용할 수 있습니다.
종합하면, 몇 가지 선택된 기술의 통합은 iPSC 유래 오가노이드 형성의 강력한 방법을 제공합니다. 오가노이드를 만들고 유지하는 방법에는 여러 가지가 있지만 대부분은 초기 분화 궤적에 초점을 맞춥니다. 이 작업에서는 분화 단계를 지나 노화 표현형이 발달하기 시작할 수 있는 성숙 기간까지 오랜 기간 동안 오가노이드를 배양하기 위해 여러 가지 다른 기술을 결합했습니다. 이러한 기술을 통합하면 배양을 유지하기 위해 외인성 생물학적 요인 없이 성숙을 연장할 수 있어 자체 조직화와 노화의 자연스러운 진행을 유지할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 네덜란드 정부의 교육 문화 과학부가 자금을 지원하는 NWO 중력 프로젝트(024.003.001)인 네덜란드 Organ-on-Chip Initiative의 지원을 받았습니다. DCB는 박사 장학금의 형태로 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)의 재정 지원을 고맙게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
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