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Biology

Evaluation de l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms laitiers à l’aide d’une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64619
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques pour évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms dans l’industrie laitière. Cette approche peut également être utilisée pour tester l’efficacité de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms.

Abstract

La présence de biofilms dans l’industrie laitière est très préoccupante, car ils peuvent conduire à la production de produits laitiers dangereux et altérés en raison de leur résistance élevée à la plupart des procédures de nettoyage en place (NEP) fréquemment utilisées dans les usines de transformation. Par conséquent, il est impératif de développer de nouvelles stratégies de contrôle du biofilm pour l’industrie laitière. Ce protocole vise à évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques (acides peracétique, perpropionique et perlactique et un désinfectant commercial à base d’acide peracétique) pour éradiquer les biofilms laitiers en utilisant une combinaison de méthodes statiques et dynamiques. Tous les désinfectants ont été testés sur les bactéries productrices de biofilm les plus fortes dans un biofilm unique ou mixte à l’aide du test de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC), une méthode de criblage statique à haut débit. Un temps de contact de 5 min avec les désinfectants aux concentrations recommandées a permis d’éradiquer avec succès les biofilms simples et mélangés. Des études sont actuellement en cours pour confirmer ces observations à l’aide du réacteur à biofilm du Center for Disease Control (CDC), une méthode dynamique pour imiter les conditions in situ . Ce type de bioréacteur permet l’utilisation d’une surface en acier inoxydable, qui constitue la plupart des équipements et surfaces industriels. Les résultats préliminaires du réacteur semblent confirmer l’efficacité des peroxyacides organiques contre les biofilms. L’approche combinée décrite dans cette étude peut être utilisée pour développer et tester de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms et éradiquer les microorganismes.

Introduction

L’industrie laitière est un secteur industriel important à l’échelle mondiale, y compris au Canada, où l’on compte plus de 10 500 fermes laitières produisant près de 90 millions d’hL de lait chaque année1. Malgré les exigences strictes en matière d’hygiène imposées dans l’industrie laitière, y compris dans les usines de transformation, le lait constitue un excellent milieu de culture pour les micro-organismes et, par conséquent, les produits laitiers sont susceptibles de contenir des micro-organismes, y compris des micro-organismes pathogènes ou d’altération. Ces agents pathogènes peuvent causer diverses maladies; par exemple, Salmonella sp. et Listeria monocytogenes peuvent causer une gastro-entérite et une méningite, respectivement2. Les microorganismes d’altération peuvent affecter la qualité et les propriétés organoleptiques des produits laitiers en produisant des gaz, des enzymes extracellulaires ou des acides3. L’apparence et la couleur du lait peuvent également être modifiées, par exemple par Pseudomonas spp.4.

Certains de ces micro-organismes peuvent former des biofilms sur différentes surfaces, y compris l’acier inoxydable. De tels biofilms permettent la persistance et la multiplication de micro-organismes à la surface de l’équipement et, par conséquent, la contamination des produits laitiers5. Les biofilms sont également problématiques en raison de leur capacité à entraver le transfert de chaleur et à accélérer la corrosion de l’équipement, ce qui entraîne un remplacement prématuré de l’équipement et, par conséquent, des pertes économiques6.

Les procédures de nettoyage en place (NEP) permettent à l’industrie alimentaire de contrôler la croissance des micro-organismes. Ces procédures impliquent l’utilisation séquentielle d’hydroxyde de sodium, d’acide nitrique et, parfois, d’assainissants contenant de l’acide hypochloreux et de l’acide peracétique 7,8. Bien que l’acide hypochloreux soit très efficace contre les micro-organismes, il réagit également avec la matière organique naturelle, provoquant la formation de sous-produits toxiques9. L’acide peracétique ne génère pas de sous-produits nocifs10; Cependant, son efficacité contre les biofilms dans l’industrie alimentaire est très variable10,11. Récemment, d’autres peroxyacides, y compris les acides perpropionique et perlactique, ont été étudiés pour leur activité antimicrobienne, et ils semblent être une bonne alternative pour le contrôle de la croissance microbienne dans les biofilms12,13.

Par conséquent, cette étude visait à évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques (acides peracétique, perpropionique et perlactique et un désinfectant à base d’acide peracétique) pour éradiquer les biofilms laitiers en utilisant une approche combinant le test de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC), une méthode de criblage statique à haut débit et le réacteur à biofilm du Center for Disease Control (CDC), une méthode dynamique qui imite in situ . conditions. Le test MBEC est ci-après appelé « plaques de microtitrage de biofilm » dans le protocole. Le protocole présenté ici et les résultats représentatifs démontrent l’efficacité des peroxyacides organiques et leur application potentielle pour le contrôle des biofilms microbiens dans l’industrie laitière.

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Protocol

Les travaux contenus dans cet article nécessitent un laboratoire de niveau de biosécurité 2 et ont déjà été approuvés (numéro de projet 119689) par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université Laval.

REMARQUE : L’organigramme de la figure 1 représente un résumé de la méthodologie combinant des approches statiques et dynamiques qui a été utilisée pour évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms.

1. Préparation du matériel

  1. Isolats microbiens
    1. Allumez l’enceinte de sécurité biologique (ESB) 15 minutes avant utilisation et nettoyez-la avec une solution d’alcool à 70 % (v/v).
    2. Une fois que l’ESB est stérile, placez un flacon de l’isolat microbien à tester (Pseudomonas azotoformans ou Brevundimonas vesicularis dans cette étude), une boucle d’inoculation, un tube de 15 mL rempli de 10 mL de bouillon de soya tryptique stérile (BST) et un mélangeur vortex. Avant de le placer dans l’ESB, désinfectez tous les matériaux avec de l’alcool.
    3. Vortex le flacon d’isolat microbien pour homogénéiser la culture.
    4. Transfère de façon aseptique 20 μL de l’isolat microbien dans 10 mL de BST stérile contenu dans un tube de 15 mL et incube-le à 30 °C pendant 16 à 24 h en agitant à 160 tr/min.
      MISE EN GARDE : B. vesicularis doit être utilisé dans un laboratoire de niveau de confinement 2 conformément aux lignes directrices requises pour la manipulation d’organismes pathogènes. Le préposé doit être bien formé et porter des lunettes de sécurité, des gants et un manteau.
  2. Désinfectants
    1. Pour préparer la solution de peroxyacide organique (60 mL), ajouter 24 mL de peroxyde d’hydrogène et 36 mL d’acide (acide acétique, propionique ou lactique) dans une fiole d’erlenmeyer de 250 mL. Ensuite, ajoutez un volume prédéfini d’acide sulfurique 10 M (655 μL pour l’acide peracétique, 635 μL pour l’acide perpropionique ou 715 μL pour l’acide perlactique). Agiter délicatement la fiole pour mélanger et la placer dans un bain-marie à 30 °C installé à l’intérieur de la hotte chimique. Incuber la fiole pendant 2 jours, en mélangeant doucement tous les matins.
      REMARQUE : Le désinfectant commercial à base d’acide peracétique (voir le tableau des matières) a été fourni directement par le fabricant.
      ATTENTION : Les désinfectants doivent être utilisés sous une hotte chimique. Des lunettes et des gants de sécurité doivent être portés pendant toute la durée de l’expérience. Pour plus d’informations sur les désinfectants, veuillez vous référer à la fiche signalétique correspondante.
    2. Effectuer le titrage du peroxyde d’hydrogène comme décrit ci-dessous.
      1. Placer un bécher vide de 300 ml sur une balance analytique (voir le tableau des matières) et tarer la balance. Peser environ 0,23 g de désinfectant dans le bécher et noter le poids exact ajouté. Ajouter 100 g de solution froide d’acide sulfurique 1 N dans le bécher, ajouter une barre d’agitation magnétique dans le bécher et le placer sur une plaque d’agitation.
      2. Laisser la solution remuer jusqu’à homogénéisation complète. Ensuite, ajouter trois gouttes d’une solution indicateur de ferroïne (0,1% en poids dansH2O) dans le bécher et titrer avec une solution de sulfate de cérium 0,1 N jusqu’à ce que la solution passe d’une couleur rose saumon à une couleur bleu clair. Notez le volume de solution de sulfate de cérium ajouté.
      3. Calculer le pourcentage de peroxyde d’hydrogène à l’aide de la formule suivante:
        Equation 1 Éq. (1)
        où S est le volume de solution de sulfate de cérium ajouté, N est la normalité de la solution de sulfate de cérium (0,1 N), W est le poids de l’échantillon (~0,2300 g) et 0,017 = (1 mol H 2 O 2/2 mol Ce) × (34,0147 g H 2O2/1 mol H 2 O)2× (1 L/1 000 mL)
    3. Effectuer le titrage des peroxyacides organiques comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 20 mL de solution d’iodure de potassium à 7,5 % (p/v) dans un bécher. Titrer lentement avec une solution de thiosulfate de sodium 0,1 N jusqu’à ce que la couleur bleue de la solution commence à virer au brun pâle/orange.
      2. Ajouter 2 mL de solution d’amidon (1 % en poids dansH2O) dans le bécher et titrer avec la solution de thiosulfate de sodium 0,1 N jusqu’à ce que la solution passe du noir à l’orange. Notez le volume de solution de thiosulfate de sodium utilisé.
      3. Calculer le pourcentage de peroxyacide organique avec la formule suivante:
        Equation 2 Éq. (2)
        où T est le volume de solution de thiosulfate de sodium utilisé, N est la normalité de la solution de thiosulfate de sodium (0,1 N), W est le poids de l’échantillon (~0,2300 g) et 0,038 = (1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2) × (1 mol I 2/2 molS2O3) × (76,06 g/1 mol CH 3COOOH) × (1 L/1 000 mL)
        NOTE: Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 avec deux échantillons supplémentaires pour effectuer chaque essai en trois exemplaires.

2. Formation de biofilms simples et mixtes

  1. Plaques de microtitrage de biofilm
    1. Vortex le tube contenant la culture bactérienne (20 μL de la souche + 10 mL de milieu BST, préparé à l’étape 1.1.4). Effectuer une dilution et un placage en série sur gélose tryptique de soja (TSA) afin de déterminer le nombre de cellules bactériennes (ufc) de la culture de nuit. Ensuite, transférer de façon aseptique 100 μL de la culture dans 10 mL de milieu TSB stérile (pour une concentration finale d’environ 2 x 107 ufc/mL).
      REMARQUE : Pour l’essai avec le bioréacteur, un volume de 100 μL d’isolat microbien est transféré dans 100 mL de BST stérile.
    2. Vortex le tube. Pour chaque bactérie, transférer la culture bactérienne diluée dans la plaque de microtitrage du biofilm (150 μL par puits) en triple exemplaire à l’aide d’une pipette multicanal. Charger 150 μL de milieu BST dans trois nouveaux puits pour servir de témoins. Incuber la plaque de microtitrage du biofilm (voir tableau des matériaux) à 30 °C pendant 24 h sans agitation.
      REMARQUE : Pour les essais mixtes sur biofilm, ajouter 75 μL de chaque suspension pour un volume total de 150 μL. La plaque de microtitrage du biofilm contient des chevilles dans ses couvercles, sur lesquelles les biofilms se forment.
  2. Bioréacteur
    1. Nettoyez et séchez à l’air libre les parties du bioréacteur (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant, puis procédez à la préparation du réacteur comme décrit ci-dessous.
      1. Tout d’abord, placez la lame plate à l’intérieur du bécher en verre de 1 L (bioréacteur), qui est fixé à son support par une barre magnétique, et maintenez l’installation en position verticale au moyen de la barre en plastique fixée sur la face intérieure du couvercle du bioréacteur.
      2. Placez les coupons ou glissières en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) sur leurs tiges de polypropylène à l’aide du tournevis et insérez-les dans les trous du couvercle, sans placer leurs goupilles d’alignement dans les encoches, pour permettre à la vapeur de s’échapper pendant la stérilisation.
      3. Couvrir tous les évents du bioréacteur avec une feuille d’aluminium et envelopper le reste de l’équipement, à savoir le tube L/S 18 (ID = 7,9 mm) et L/S 16 (ID = 3,1 mm), la rupture d’écoulement du verre, les bouchons du conteneur, les tournevis, les pinces et les filtres de 0,2 μm, avec une feuille d’aluminium.
        REMARQUE : Insérez le tube en silicone (voir le tableau des matériaux) dans la barbe située sur la surface interne du bouchon du récipient moyen.
      4. Autoclave du bioréacteur mis en place en cycle sec à 121 °C pendant 20 min.
    2. Effectuer la formation du biofilm dans le bioréacteur en mode batch (première étape).
      1. Dans une ESB, connectez une extrémité du tube L/S 18 au bec de sortie du bioréacteur et gardez l’autre extrémité enveloppée dans du papier d’aluminium pour préserver la stérilité.
      2. Retirez un porte-coupon ou une glissière du couvercle du bioréacteur et placez-le dans un tube stérile de 50 mL. Ensuite, remplissez le bécher du bioréacteur avec 340 mL de milieu BST à 300 mg/L à travers le trou occupé par la tige à l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL.
      3. Inoculer le milieu de culture dans le bioréacteur avec 1 mL de la solution bactérienne (~108 ufc/mL de P. azotoformans) à l’aide d’une pipette de 5 mL à travers le même orifice utilisé précédemment, puis remettre la tige dans sa position initiale. Positionnez les tiges qui sont déjà placées dans les trous du couvercle de manière à ce que les broches s’insèrent dans leurs encoches respectives.
      4. Placez un filtre de purge d’air bactérien de 0,2 μm à l’extrémité du tube avec le plus petit diamètre, qui est situé sur le couvercle du bioréacteur. L’autre tube du même diamètre reste bouché en permanence avec un bouchon à vis métallique ou un bouchon en silicone qui se ferme hermétiquement.
      5. Placer le bioréacteur pendant 24 h sur la plaque chauffante réglée à 30 °C et agiter à 130 tr/min.
        NOTE: Pour la formation de biofilms multi-espèces, utiliser un volume égal des différentes cultures bactériennes pour obtenir un volume total de 1 mL pour l’inoculum.
    3. Effectuer la formation de biofilm dans le bioréacteur en mode flux continu (deuxième étape).
      1. Placer une bonbonne contenant 18 L d’eau distillée stérile dans l’ESB et ajouter 2 L de milieu de culture de BST à 1 000 mg/L pour obtenir une concentration finale de 100 mg/L.
      2. Couvrez le récipient avec son capuchon stérile, auquel deux tubes sont connectés. Le premier est un tube en silicone fixé sur la face interne du capuchon et sert à pomper le milieu. Le deuxième tube (L/S 16) est relié à l’orifice externe pour permettre au liquide de s’écouler vers le bioréacteur. Placez un filtre de 0,2 μm dans le deuxième tube sur le couvercle du récipient moyen.
      3. Connectez ce deuxième tube à la pompe péristaltique et joignez l’autre extrémité à la rupture d’écoulement du verre, qui est ensuite insérée dans le plus grand tube sur le couvercle du bioréacteur.
      4. Utilisez une autre bonbonne de 20 L pour recueillir les effluents du bioréacteur. Fixez l’extrémité du tube relié au bec de sortie du bioréacteur au bouchon du conteneur à déchets. Insérez un filtre de 0,2 μm dans le tube disponible sur le couvercle de ce récipient.
      5. Démarrez la pompe péristaltique à un débit de 11,3 mL/min et laissez le système fonctionner pendant 24 h.
        REMARQUE : Le débit (11,3 mL/min) du milieu de culture ou du lait utilisé pendant la formation du biofilm dans le bioréacteur a été déterminé en divisant 340 mL (ce qui correspond au volume de liquide dans le réacteur) par le temps de séjour de 30 min.
    4. Récupérer le biofilm bactérien.
      1. Éteignez la pompe péristaltique et arrêtez d’agiter et de chauffer le bioréacteur.
      2. Retirez délicatement chaque tige du bioréacteur et rincez les coupons ou les lames 3x dans 40 ml de PBS pour éliminer les bactéries planctoniques. Ensuite, libérez les coupons ou les glissières dans des tubes coniques stériles de 50 mL contenant 40 mL de PBS à l’aide d’un tournevis approprié. Vortex les tubes pendant 30 s, transférez-les sur une crémaillère placée dans un bain de sonicateur et sonicisez les tubes à 40 kHz pendant 30 s (ce qui nécessite 110 W de puissance). Répétez cette opération 3x.
      3. Recueillir les suspensions de biofilm de 40 ml dans des tubes coniques stériles de 50 ml, puis rincer les coupons ou les lames avec 2 ml de solution PBS stérile. Récupérez ce liquide de rinçage et ajoutez-le à la suspension de biofilm déjà recueillie.
    5. Énumérer les bactéries viables dans le biofilm: Avec la suspension de biofilm obtenue, effectuer des dilutions en série 10 fois, puis plaquer 100 μL des dilutions 10−5 et 10−6 sur TSA en trois exemplaires. Incuber les plaques à 30 °C pendant 24 h. Comptez le nombre de colonies présentes sur les plaques de gélose et calculez la densité bactérienne sur les coupons et les lames (bactéries sessiles viables) selon la norme ASTM E2562-1714 en utilisant la formule suivante:
      Equation 3 Éq. (3)
      où X est le nombre d’unités formant colonies (UFC), B est le volume plaqué (0,1 mL), V est le volume dans lequel le biofilm est en suspension (la solution mère), A est la surface du coupon ou de la lame recouverte par le biofilm et D est le facteur de dilution.

3. Évaluation quantitative de l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms

  1. Plaques de microtitrage de biofilm
    1. Ajouter 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) dans trois puits d’une microplaque de 96 puits.
    2. Transférer le couvercle de la microplaque de biofilm, avec les biofilms qui se sont formés sur les chevilles, sur la microplaque à 96 puits contenant le PBS pendant 10 s afin de laver les biofilms et d’éliminer les bactéries planctoniques.
    3. Préparer les désinfectants aux concentrations requises (p. ex. 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1 000 ppm, 5 000 ppm, 10 000 ppm et 25 000 ppm de substance active).
      NOTE: Toutes les dilutions sont effectuées de manière aseptique à l’aide d’eau distillée stérile.
    4. Ajouter 200 μL de chaque concentration de désinfectant dans les puits d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits en trois exemplaires. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage de biofilm sur cette plaque de microtitrage de 96 puits contenant les désinfectants, et incuber la plaque à température ambiante pendant la durée d’exposition souhaitée.
    5. Ajouter 200 μL de bouillon neutralisant Dey-Engley aux puits d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage du biofilm sur la plaque de microtitrage à 96 puits contenant le bouillon neutralisant. Scellez la plaque de microtitrage avec un parafilm et placez-la dans le sonicateur de bain à 40 kHz pendant 30 min.
    6. Après 30 min, retirez la plaque de microtitrage du sonicateur et retirez le parafilm. Transférer 100 μL de la première colonne de la plaque de 96 puits contenant les biofilms détachés après la sonication à la première rangée d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits.
    7. Ajouter 180 μL de 1x PBS stérile aux puits de la nouvelle microplaque à 96 puits (préparée à l’étape 3.1.6), à l’exception de la première rangée. Transférer 20 μL de la solution de biofilm de la première rangée vers les puits de la deuxième rangée contenant 180 μL de 1x PBS (ligne 2, dilution : 10−1). Ensuite, transférer 20 μL du liquide contenu dans la deuxième rangée vers les puits de la rangée suivante contenant 180 μL de 1x PBS (rangée 3, dilution : 10−2). Répéter la même procédure pour obtenir des dilutions comprises entre 10−5 et 10−7.
    8. Inoculer 100 μL des dilutions sur TSA, et incuber les plaques selon les paramètres nécessaires à la croissance de chaque bactérie.
    9. Après l’incubation, compter les ufc et calculer la densité logarithmique10 pour chaque peg et la réduction logarithmique10 à chaque concentration de désinfectant à l’aide des équations suivantes :
      Equation 4 Éq. (4)
      où X est les unités formant colonie comptées au point, B est le volume plaqué (0,01 mL), V est le volume du puits (0,20 mL), A est la surface de la cheville (46,63 mm2) et D est la dilution.
      Equation 5 Éq. (5)
    10. Répétez chaque expérience 3x les jours indépendants.
      REMARQUE : La « concentration minimale de désinfectant qui éradique le biofilm », ou MBEC, correspond à la concentration la plus faible de désinfectant qui ne montre aucune croissance bactérienne.
  2. Bioréacteur
    NOTE: La procédure de la norme ASTM E2871-1915 est suivie pour effectuer cet essai avec P. azotoformans PFlA1.
    1. Commencez par former les biofilms sur les coupons dans le bioréacteur, comme décrit à l’étape 2.2. Ensuite, retirez la tige qui contient les coupons et rincez-la à l’intérieur d’un tube conique contenant 30 ml de PBS.
    2. Déposez chaque coupon dans un tube conique stérile de 50 mL à l’aide d’un tournevis, puis ajoutez 4 mL de la solution de peroxyacide organique appropriée ou du PBS pour le témoin. Incuber pendant 5 min, puis ajouter 36 mL de bouillon neutralisant Dey-Engley. Vortex pendant 30 s, puis sonicer à 40 kHz pendant 30 s à l’aide d’un bain de sonicateur. Répétez le processus 3x pour obtenir la suspension de biofilm.
    3. De même, rincez toutes les autres tiges et récupérez les biofilms des coupons. Effectuer des dilutions en série de la suspension et de la plaque de biofilm 0,1 mL sur milieu TSA. Incuber les plaques à 30 °C pendant 24 h.
    4. Après l’incubation, compter les cfus, puis calculer la densité du biofilm pour chaque coupon (Eq. 6), la densité logarithmique moyenne (LD) pour chaque ensemble de trois coupons de la même barre, y compris le traitement et le témoin (Eq. 7), et la réduction logarithmique pour le désinfectant (Eq. 8) en utilisant les équations suivantes :
      Equation 6 Éq. (6)
      où X est la moyenne des unités formant colonie comptées/coupon, B est le volume plaqué (0,1 mL), V est le volume de désinfectant ou de PBS plus neutralisant (40 mL) et D est la dilution.
      Equation 7 Éq. (7)
      Equation 8 Éq. (8)

4. Évaluation qualitative de l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms

REMARQUE : Après avoir été traités avec les désinfectants (étapes 3.1.1 à 3.1.5), les biofilms de P. azotoformans qui se sont formés sur les chevilles de la plaque de microtitrage du biofilm dans la méthode statique ont été préparés et analysés par observation au microscope électronique et confocal à balayage.

  1. Microscopie électronique à balayage (MEB)
    1. Ajouter 200 μL de 1x PBS à trois puits d’une microplaque de 96 puits. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage du biofilm (étape 3.1.5) sur la microplaque à 96 puits contenant du PBS et le laisser à température ambiante pendant 10 s pour éliminer le bouillon neutralisant Dey-Engley.
    2. Retirez les chevilles de la plaque de microtitrage du biofilm à l’aide d’une pince à nez à aiguille stérilisée. Placer chaque cheville dans un flacon vide sous une hotte et ajouter le fixateur primaire (glutaraldéhyde à 5% dans un tampon cacodylate Na 0,1 M pH 7,5) à chaque flacon. Boucher chaque flacon et les incuber à 4 °C pendant 24 h.
    3. Après l’incubation, décanter le fixateur à l’aide d’une pipette et jeter tous les déchets liquides dans un récipient approprié. Retirez les bouchons de chaque flacon et placez-les dans une hotte pour les faire sécher à l’air libre pendant 72 h.
    4. Montez les échantillons sur des souches d’aluminium (voir le tableau des matériaux) en appliquant de la résine époxy (voir le tableau des matériaux) sur la surface supérieure plane de chaque tige. Ensuite, fixez soigneusement les chevilles aux souches avec des pinces.
    5. Métalliser les échantillons avec une pulvérisation d’or EMS950x + 350s (voir Tableau des matériaux) pendant 4 min à 2 x 10−1 bar de pression argon et 20 mA de courant. Effectuez une mise à la terre appropriée en peignant le côté de la cheville non exposé à l’or avec de la peinture argentée (voir le tableau des matériaux).
    6. Acquérir des images au microscope électronique à balayage à l’aide de l’interface utilisateur de contrôle MEB version 6.28 (voir Tableau des matériaux). La tension d’accélération utilisée dans cette étude était de 15 kV et les grossissements étaient de 300x et 2 000x.
  2. Microscopie confocale
    1. Ajouter 200 μL de 1x PBS à trois puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits. Transférer le couvercle de la microplaque de biofilm à la plaque de 96 puits contenant le PBS et laisser pendant 10 s pour éliminer le bouillon neutralisant Dey-Engley.
    2. Préparer des solutions de colorants fluorescents en ajoutant 3 μL de colorant fluorescent vert et 3 μL de colorant fluorescent rouge (voir le tableau des matériaux) à 1 mL d’eau stérile.
    3. Ajouter 200 μL de solution de coloration dans un puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage du biofilm à la plaque à 96 puits contenant la solution de coloration. Couvrir la plaque de microtitrage du biofilm avec du papier d’aluminium et incuber l’échantillon pendant 20-30 minutes à température ambiante.
    4. Ajouter 200 μL d’eau stérilisée dans les puits d’une microplaque de 96 puits. Ensuite, transférez le couvercle de la microplaque de biofilm à la microplaque de 96 puits contenant l’eau et laissez-le jusqu’à l’observation.
    5. Visualisez les biofilms formés sur les chevilles à l’aide d’un microscope confocale à balayage laser (voir Tableau des matériaux) avec un objectif DIC d’huile 63x/1.40. Acquérir les images à l’aide du logiciel associé (voir le tableau des matériaux). Les longueurs d’onde d’excitation de fluorescence utilisées pour les colorations fluorescentes vertes et rouges étaient respectivement de 482 nm et 490 nm.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, coupez et placez la cheville dans une boîte de Petri de 60 mm et remplissez la boîte avec de l’eau stérile.

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Representative Results

L’analyse MEB montre la présence de biofilms produits par P. azotoformans PFl1A sur les chevilles de microplaques du biofilm (figure 2A). Une structure de biofilm tridimensionnelle peut être observée. Le P. azotoformans PFl1A a déjà été identifié comme un puissant producteur de biofilm (A570 > 1,5) en utilisant des plaques de microtitrage à 96 puits12.

De plus, le biofilm PFl1A de P. azotoformans qui s’est formé sur une lame en acier inoxydable à l’aide du bioréacteur semblait très dense et présentait les caractéristiques morphologiques d’un biofilm mature à structure tridimensionnelle (figure 2B). De plus, les résultats des numérations bactériennes des biofilms développés par cet isolat dans le système dynamique ont montré des densités cellulaires significatives correspondant à 8,74 log UFC/cm2 et 7,86 log UFC/cm2 dans le milieu de culture du BST et le lait écrémé stérile, respectivement (figure 2C).

De plus, les résultats présentés à la figure 3 obtenus avec l’isolat de B. vesicularis ont montré que certains facteurs peuvent avoir une influence importante sur la formation du biofilm dans le bioréacteur. En faisant varier certains paramètres, tels que la vitesse d’agitation dans le bioréacteur, le débit du milieu, la concentration en nutriments du milieu et la durée de l’étape du mode continu, la fixation des cellules peut être améliorée et des biofilms plus denses peuvent être observés. Par exemple, l’augmentation de la concentration d’éléments nutritifs de 100 mg/L à 900 mg/L (condition A par rapport à la condition F) a entraîné une augmentation du nombre de bactéries des biofilms de 6,11 log UFC/cm 2 à 8,71 log UFC/cm2. De plus, une croissance significative des biofilms a été observée lorsque le débit a été réduit à 6,0 mL/min (dans la condition C), ce qui a entraîné un temps de séjour plus long compatible avec le taux de croissance de cet isolat.

Les observations microscopiques des biofilms formés sur les plaques de microtitrage du biofilm ou le traitement pré- et post-désinfectant du bioréacteur étaient complémentaires au nombre de cellules viables. La figure 4 montre qu’aucun des biofilms ne contenait de cellules viables détectables au moment du contact (5 min) et aux concentrations (500 ppm avec les peroxyacides organiques et 100 000 ppm avec le peroxyde d’hydrogène) des désinfectants habituellement appliqués dans les usines laitières. Ces résultats ont été confirmés par microscopie (Figure 5). La figure 5A montre la structure tridimensionnelle d’un biofilm MBEC non traité (témoin), tandis que les biofilms MBEC traités (avec du peroxyde d’hydrogène, de l’acide peracétique, de l’acide perlactique, de l’acide perpropionique et une préparation désinfectante commerciale) perdent leur conformation tridimensionnelle, telle que déterminée par MEB. Cependant, bien que les biofilms aient été traités avec un désinfectant, une structure apparente du biofilm est restée, en particulier avec du peroxyde d’hydrogène. Néanmoins, l’utilisation d’une technique vivante/morte, dans ce cas, la microscopie confocale (CM) avec coloration de viabilité fluorescente, a confirmé que la structure restante du biofilm était principalement sans vie après un traitement désinfectant (Figure 5B).

Figure 1
Figure 1 : Organigramme représentant une approche statique et dynamique combinée pour évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse de la formation du biofilm par Pseudomonas azotoformans PFl1A. (A) Micrographies électroniques à balayage (300x et 2 000x) du biofilm PFl1A de P. azotoformans formé sur des chevilles de la plaque de microtitrage du biofilm. Cette figure a été modifiée à partir de Goetz et al.12 avec permission (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tous droits réservés.). Barres d’échelle = 50 μm (300x), 100 μm (2 000x). (B) Micrographies électroniques à balayage (2 000x) de (1) une lame en acier inoxydable contenant un biofilm PFl1A de P. azotoformans cultivé dans le bioréacteur et (2) une lame sans biofilm (témoin négatif). Barre d’échelle = 10 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Niboucha et al.16 avec permission. (C) Densité bactérienne des biofilms PFl1A de P. azotoformans formés dans le bioréacteur dans le milieu de culture du BST et le lait écrémé stérile et déterminée après leur élimination par ultrasons des lames en acier inoxydable. Les données sont présentées sous forme d’écart-type moyen ± (n = 3). La différence significative (p < 0,05) est basée sur le test t de Student. Cette figure a été modifiée à partir de Niboucha et al.16 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Densité bactérienne des biofilms de Brevundimonas vesicularis développés à l’aide du bioréacteur dans diverses conditions d’agitation, de débit, de temps en mode continu et de milieux de culture (BST). Condition A : vitesse d’agitation de 130 tr/min, débit de 11,8 mL/min, mode continu de 24 h dans un milieu BST de 100 mg/L (conformément au protocole international E2562-1714 de l’ASTM pour la formation de biofilms par Pseudomonas aeruginosa); Condition B : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 11,8 mL/min, mode continu de 24 h dans un milieu BST de 100 mg/L; Condition C : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 6,0 mL/min, mode continu de 24 h dans un milieu BST de 100 mg/L; Condition D : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 6,0 mL/min, mode continu de 48 h dans un milieu BST de 100 mg/L; Condition E : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 6,0 mL/min, mode continu de 48 h dans un milieu BST de 300 mg/L; Condition F : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 6,0 mL/min, mode continu de 48 h dans un milieu BST de 900 mg/L; Condition G : vitesse d’agitation de 60 tr/min, débit de 6,0 mL/min, mode batch de 24 h en 2,7 g/L BST et mode continu de 48 h en milieu BST de 900 mg/L. Les données sont présentées sous forme d’écart-type moyen ± (n = 3). Les différences significatives (lettres différentes, p < 0,05) sont basées sur l’ANOVA unidirectionnelle et le test de comparaison multiple de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Numération cellulaire viable dans les biofilms PFl1A de Pseudomonas azotoformans avant et après traitement au peroxyde d’hydrogène, à l’acide perlactique, à l’acide perpropionique, à l’acide peracétique ou à un désinfectant commercial. Chaque point représente la moyenne des comptes triples obtenus sur trois jours indépendants pour chaque isolat. Les données sont présentées sous forme d’écart-type moyen ± (n = 3). Cette figure a été modifiée à partir de Goetz et al.12 avec permission (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tous droits réservés.). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Observation microscopique de la structure et de la viabilité du biofilm. (A) Micrographies électroniques à balayage (300x et 2 000x) d’un biofilm PFl1A de Pseudomonas azotoformans formé sur les chevilles de la plaque de microtitrage du biofilm avant (témoin) et après traitement avec du peroxyde d’hydrogène, de l’acide peracétique, de l’acide perlactique, de l’acide perpropionique et du désinfectant commercial à leurs concentrations minimales d’éradication du biofilm (MBEC). Barre d’échelle = 10 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Goetz et al.12 avec permission (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tous droits réservés.). (B) Viabilité d’un biofilm formé par P. azotoformans PFl1A en utilisant une coloration de viabilité de cellule fluorescente sur la cheville de microplaque du biofilm avant (à gauche) et après (à droite) le traitement à l’acide peracétique (500 ppm), visualisée par microscopie confocale à balayage laser (objectif de contraste d’interférence différentielle d’huile 63x/1,40). Les cellules viables sont colorées en vert et les cellules mortes sont colorées en rouge. Barre d’échelle = 20 μm. Cette figure a été modifiée Goetz et al.12 avec permission (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tous droits réservés.). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le test MBEC (essai sur microplaque de biofilm) a été la première méthode à être reconnue comme un test standard d’éradication du biofilm par l’ASTM17. Notre étude et d’autres ont montré qu’il y a deux étapes critiques lors de l’utilisation de ce test: l’étape de sonication (temps et puissance) et le temps de traitement désinfectant18. Stewart et Parker ont également suggéré d’autres paramètres qui pourraient influencer le résultat du test, tels que l’espèce microbienne, l’âge du biofilm, le rapport surface/volume, etc. 19. Enfin, il est important de noter que la formation de biofilms autour des chevilles sur les couvercles des microplaques peut être hétérogène et variera selon les bactéries utilisées.

La méthode MBEC peut potentiellement être utilisée avec différents types de désinfectants. L’utilisation de techniques de microscopie, telles que la MEB et la microscopie confocale, est complémentaire et extrêmement utile pour étudier les structures tridimensionnelles et l’état de viabilité (kits de coloration de viabilité cellulaire fluorescente, voir Tableau des matériaux) des biofilms pré- et post-traitement désinfectant, respectivement12. La capacité des bactéries à former des biofilms a été principalement étudiée avec des plaques de microtitrage en raison de la facilité et de la rapidité d’exécution. Cependant, l’utilisation de ce système fermé sans forces de cisaillement, telle qu’observée dans la plupart des situations, a des limites. Par conséquent, l’utilisation d’une méthode dynamique de formation de biofilm, telle que le bioréacteur CDC, est fortement recommandée pour confirmer les observations faites à l’aide du test sur microplaque de biofilm.

Selon la méthode normalisée ASTM14,15 et les études publiées20,21, le bioréacteur est largement utilisé pour cultiver des biofilms et pour évaluer l’efficacité des désinfectants. Ce dispositif imite certaines conditions environnementales de formation de biofilm, telles que la force de cisaillement élevée, les nutriments spécifiques et renouvelables et les matériaux de surface. Dans cette étude, des biofilms de souche PFlA1 matures reproductibles de P. azotoformans ont été obtenus sur des lames en acier inoxydable à l’aide de ce système dynamique. Le protocole présenté ici était basé sur le protocole standard ASTM utilisant Pseudomonas aeruginosa. Cependant, cette méthode normalisée de biofilm ne peut pas être appliquée à tous les micro-organismes, même s’il a été démontré qu’ils sont de puissants producteurs de biofilm en utilisant d’autres techniques. Ce fut le cas pour B. vesicularis, pour lequel le protocole a dû être optimisé afin d’atteindre une densité de biofilm plus élevée.

Des études antérieures ont démontré que certaines conditions opérationnelles (ou paramètres) sont cruciales dans le processus de développement du biofilm et doivent être adaptées à chacune des bactéries testées22,23,24. Par exemple, les besoins nutritionnels doivent être ajustés pour chaque bactérie en fonction de la préférence et de la concentration25. De plus, il a été démontré que les biofilms sont plus épais et ont une biomasse plus importante dans des conditions d’approvisionnement continu en nutriments dans le bioréacteur que lorsqu’ils sont cultivés en mode batch, qui est considéré comme un environnement pauvreen nutriments 26. Un autre aspect important est le temps de séjour, qui est contrôlé par le débit et doit être ajusté afin qu’il soit plus court que le temps de doublement bactérien. De plus, la température et le mélange de cisaillement du fluide doivent être ajustés pour chaque bactérie afin d’offrir des conditions de croissance optimales27. La forte contrainte de cisaillement créée par le mouvement du déflecteur favorise le développement du biofilm et joue un rôle dans le contrôle de sa structure et de son épaisseur28. Cependant, si la vitesse d’agitation est trop augmentée, cela peut provoquer une érosion ou une desquamation de la surface du biofilm, ce qui entraîne une réduction de la densité bactérienne29,30.

L’utilisation d’un bioréacteur présente certaines limites, telles que le fait qu’il est coûteux et prend beaucoup de temps en plus d’utiliser un grand volume de fluides comme milieu nutritif. Néanmoins, il reste une méthode hautement reproductible et reproductible pour former et étudier des biofilms. L’utilisation d’un bioréacteur permet également l’utilisation simultanée de plusieurs coupons faits de matériaux différents. Le bioréacteur est conçu pour surveiller les conditions expérimentales pendant la croissance du biofilm, telles que la température, la vitesse d’agitation et le débit, et il permet la récupération de biofilms homogènes et représentatifs pour une analyse ultérieure. Globalement, les méthodes statiques et dynamiques sont complémentaires pour étudier in vitro l’efficacité des désinfectants contre les biofilms isolés des secteurs alimentaire et environnemental.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le Consortium de recherche et innovations en bioprocédés industriels au Québec (CRIBIQ)(2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RDCPJ516460-17). Nous remercions Teresa Paniconi pour la critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filters  Corning 09-754-28 diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon Biosurface Technologies Corporation RD128-316
316 stainless-steel slide coupon Biosurface Technologies Corporation CBR 2128-316
96-microtiter plate Corning 07-200-89 cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
Acetic acid Sigma Aldrich 27225 store at RT
Aluminium stubs Electron Microscopy Science 75830-10 32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16220 store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance Mettler Toledo AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) Biosurface Technologies Corporation BST 02915
BioDestroy Groupe Sani Marc 09-10215 commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L Cole Parmer 06031-52
CDC biofilm reactor Biosurface Technologies Corporation CRB 90 bioreactor
Cerium (IV) sulphate Thermo Scientific 35650-K2 store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700 Zeiss LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth Millipore D3435-500G store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter  Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14121 with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP Greenfield global P016EA95 store at RT
Ferroin indicator solution Sigma Aldrich 318922-100ML store at RT
Filling/venting cap Cole Parmer RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316 fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C
Glass flow break Biosurface Technologies Corporation FB 50
Gold with silver paint  Electron Microscopy Sciences 12684-15
Heating plate set Biosurface Technologies Corporation 110V Stir Plate
Hex screwdriver Biosurface Technologies Corporation CBR 5497
Hydrogen peroxide Sigma 216763 store at 4 °C
Inoculating loops VWR 12000-812 sterile, 10 µl
Lactic acid Laboratoire MAT LU-0200 store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head Cole Parmer 77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base Innovotech 19111 Biofilm microtiter plate
Oxford agar base Thermo Scientific OXCM0856B store at 4 °C
Plastic coupon holder Biosurface Technologies Corporation CBR 2203
Plastic slide holder rod Biosurface Technologies Corporation CBR 2203-GL
Potassium iodide Fisher Chemical P410-500 store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) Wiha 26015
Propionic acid Laboratoire MAT PF-0221 store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance Cole Parmer  UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model JEOL JSM-6360LV SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.205 (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL Sarstedt 62.547.205 (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences  12300 store at -20 °C
Sodium thiosulfate Thermo Scientific AC124270010 store at RT
Sonication bath Fisher 15-336-122 5,7 L
Starch solution Anachemia AC8615 store at RT
Sulfuric acid Sigma Aldrich 258105-500ML store at RT
Tryptic soy agar BD Bacto DF0369-17-6 store at RT
Tryptic soy broth BD Bacto DF0370-17-3 store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25' Cole Parmer MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25' Cole Parmer MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing  Saint-Gobain ABW18NSF IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex Cole Parmer UZ-04724-00
Water bath  VWR 89202-970
Zen software Zeiss

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References

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Biologie numéro 190
Evaluation de l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms laitiers à l’aide d’une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques
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Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).

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