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Biology

स्थैतिक और गतिशील तरीकों के संयोजन वाले दृष्टिकोण का उपयोग करके डेयरी बायोफिल्म के उन्मूलन के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64619
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल डेयरी उद्योग में बायोफिल्म को खत्म करने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए स्थिर और गतिशील तरीकों के संयोजन के दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग बायोफिल्म को नियंत्रित करने के लिए नए जैविक या रासायनिक योगों की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है।

Abstract

डेयरी उद्योग में बायोफिल्म की उपस्थिति प्रमुख चिंता का विषय है, क्योंकि वे प्रसंस्करण संयंत्रों में अक्सर उपयोग की जाने वाली अधिकांश क्लीन-इन-प्लेस (सीआईपी) प्रक्रियाओं के लिए उनके उच्च प्रतिरोध के कारण असुरक्षित और परिवर्तित डेयरी उत्पादों के उत्पादन का कारण बन सकते हैं। इसलिए, डेयरी उद्योग के लिए नई बायोफिल्म नियंत्रण रणनीतियों को विकसित करना अनिवार्य है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्थिर और गतिशील तरीकों के संयोजन का उपयोग करके डेयरी बायोफिल्म को खत्म करने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड्स (पेरासिटिक, परप्रोपियोनिक और पेरलैक्टिक एसिड और एक वाणिज्यिक पेरासिटिक एसिड-आधारित कीटाणुनाशक) की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना है। सभी कीटाणुनाशकों का परीक्षण न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (एमबीईसी) परख, एक स्थिर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का उपयोग करके एकल या मिश्रित बायोफिल्म में सबसे मजबूत बायोफिल्म-उत्पादक बैक्टीरिया पर किया गया था। अनुशंसित सांद्रता पर कीटाणुनाशकों के साथ 5 मिनट के संपर्क समय ने एकल और मिश्रित बायोफिल्म दोनों को सफलतापूर्वक समाप्त कर दिया। वर्तमान में रोग नियंत्रण केंद्र (सीडीसी) बायोफिल्म रिएक्टर का उपयोग करके इन टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए अध्ययन चल रहे हैं, जो सीटू स्थितियों में नकल करने के लिए एक गतिशील विधि है। इस प्रकार का बायोरिएक्टर स्टेनलेस स्टील की सतह के उपयोग को सक्षम बनाता है, जो अधिकांश औद्योगिक उपकरणों और सतहों का गठन करता है। रिएक्टर के प्रारंभिक परिणाम बायोफिल्म के खिलाफ कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता की पुष्टि करते हैं। इस अध्ययन में वर्णित संयुक्त दृष्टिकोण का उपयोग बायोफिल्म को नियंत्रित करने और सूक्ष्मजीवों को खत्म करने के लिए नए जैविक या रासायनिक योगों को विकसित करने और परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

डेयरी उद्योग कनाडा सहित दुनिया भर में एक प्रमुख औद्योगिक क्षेत्र है, जहां 10,500 से अधिक डेयरी फार्म हैं जोहर साल लगभग 90 मिलियन एचएल दूध का उत्पादन करते हैं। प्रसंस्करण संयंत्रों सहित डेयरी उद्योग में लगाए गए सख्त स्वच्छता आवश्यकताओं के बावजूद, दूध सूक्ष्मजीवों के लिए एक महान संस्कृति माध्यम का गठन करता है, और इस प्रकार, डेयरी उत्पादों में सूक्ष्मजीवों को शामिल करने की संभावना है, जिसमें खराब या रोगजनक सूक्ष्मजीव शामिल हैं। ये रोगजनक विभिन्न बीमारियों का कारण बन सकते हैं; उदाहरण के लिए, साल्मोनेला एसपी और लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेन्स क्रमशः गैस्ट्रोएंटेराइटिस और मेनिन्जाइटिस का कारण बन सकते हैं। खराब सूक्ष्मजीव गैसों, बाह्य एंजाइमों या एसिड का उत्पादन करके डेयरी उत्पादों की गुणवत्ता और ऑर्गेनोलेप्टिकगुणों को प्रभावित कर सकते हैं। दूध की उपस्थिति और रंग को भी बदला जा सकता है, उदाहरण के लिए स्यूडोमोनास एसपीपी.4 द्वारा।

इनमें से कुछ सूक्ष्मजीव स्टेनलेस स्टील सहित विभिन्न सतहों पर बायोफिल्म बना सकते हैं। इस तरह के बायोफिल्म उपकरण की सतह पर सूक्ष्मजीवों की दृढ़ता और गुणन को सक्षम करते हैं और इस प्रकार, डेयरी उत्पादों का संदूषण5. बायोफिल्म भी समस्याग्रस्त हैं क्योंकि गर्मी हस्तांतरण को बाधित करने और उपकरणों के संक्षारण में तेजी लाने की उनकी क्षमता है, जिससे उपकरणों का समय से पहले प्रतिस्थापन होता है और इस प्रकार, आर्थिक नुकसानहोता है।

क्लीन-इन-प्लेस (सीआईपी) प्रक्रियाएं खाद्य उद्योग को सूक्ष्मजीवों के विकास को नियंत्रित करने की अनुमति देती हैं। इन प्रक्रियाओं में सोडियम हाइड्रॉक्साइड, नाइट्रिक एसिड और, कभी-कभी, हाइपोक्लोरस एसिड और पेरासिटिक एसिड 7,8 युक्त सैनिटाइज़रका अनुक्रमिक उपयोग शामिल है। यद्यपि हाइपोक्लोरस एसिड सूक्ष्मजीवों के खिलाफ अत्यधिक प्रभावी है, यह प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थों के साथ भी प्रतिक्रिया करता है, जिससे विषाक्त उप-उत्पादों का निर्माणहोता है। पेरासिटिक एसिड हानिकारक उप-उत्पाद उत्पन्न नहीं करताहै 10; हालांकि, खाद्य उद्योग में बायोफिल्म के खिलाफ इसकी प्रभावशीलता अत्यधिक परिवर्तनशील10,11 है। हाल ही में, पेरप्रोपियोनिक और पेरलैक्टिक एसिड सहित अन्य पेरोक्सीसिड्स का अध्ययन उनकी रोगाणुरोधी गतिविधि के लिए किया गया है, और वे बायोफिल्म12,13 में माइक्रोबियल विकास के नियंत्रण के लिए एक अच्छा विकल्प प्रतीत होते हैं।

इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता (एमबीईसी) परख, एक स्थिर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि और रोग नियंत्रण केंद्र (सीडीसी) बायोफिल्म रिएक्टर, एक गतिशील विधि के संयोजन के साथ एक दृष्टिकोण का उपयोग करके डेयरी बायोफिल्म को खत्म करने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड्स (पेरासिटिक, परप्रोपियोनिक और परलैक्टिक एसिड और एक पेरासिटिक एसिड-आधारित कीटाणुनाशक) की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना था। शर्तों। एमबीईसी परख को इसके बाद प्रोटोकॉल में "बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट्स" के रूप में जाना जाता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम डेयरी उद्योग में माइक्रोबियल बायोफिल्म को नियंत्रित करने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता और उनके संभावित अनुप्रयोग को प्रदर्शित करते हैं।

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Protocol

इस लेख में निहित कार्य के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला की आवश्यकता होती है और पहले यूनिवर्सिटे लावल संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित (परियोजना संख्या 119689) किया गया था।

नोट: चित्रा 1 में फ्लोचार्ट स्थिर और गतिशील दृष्टिकोणों के संयोजन की पद्धति का सारांश प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग बायोफिल्म को मिटाने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।

1. सामग्री की तैयारी

  1. माइक्रोबियल आइसोलेट्स
    1. उपयोग से 15 मिनट पहले जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) चालू करें, और इसे 70% (वी / वी) अल्कोहल समाधान के साथ साफ करें।
    2. एक बार बीएससी बाँझ हो जाने के बाद, परीक्षण किए जाने वाले माइक्रोबियल आइसोलेट की एक शीशी रखें (इस अध्ययन में स्यूडोमोनास एज़ोटोफोरमैन्स या ब्रेवुंडीमोनास वेसिकुलरिस ), एक इनोकुलेटिंग लूप, 10 एमएल बाँझ ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) से भरा एक 15 एमएल ट्यूब, और एक भंवर मिक्सर। बीएससी में प्लेसमेंट से पहले, शराब के साथ सभी सामग्रियों को कीटाणुरहित करें।
    3. वोर्टेक्स माइक्रोबियल की शीशी संस्कृति को समरूप बनाने के लिए अलग करती है।
    4. माइक्रोबियल आइसोलेट के 20 μL को 15 एमएल ट्यूब में निहित बाँझ टीएसबी के 10 एमएल में स्थानांतरित करें और इसे 160 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 16-24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      वेसिकुलरिस का उपयोग रोगजनक जीवों को संभालने के लिए आवश्यक दिशानिर्देशों के अनुसार एक नियंत्रण स्तर 2 प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। हैंडलर को ठीक से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और सुरक्षा चश्मा, दस्ताने और एक कोट पहनना चाहिए।
  2. कीटाणुनाशक
    1. कार्बनिक पेरोक्सीसिड समाधान (60 एमएल) तैयार करने के लिए, 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 24 एमएल हाइड्रोजन पेरोक्साइड और 36 एमएल एसिड (एसिटिक, प्रोपियोनिक, या लैक्टिक एसिड) जोड़ें। फिर, 10 एम सल्फ्यूरिक एसिड की पूर्वनिर्धारित मात्रा जोड़ें (पेरासिटिक एसिड के लिए 655 μL, परप्रोपियोनिक एसिड के लिए 635 μL, या पर्लैक्टिक एसिड के लिए 715 μL)। मिश्रण करने के लिए फ्लास्क को धीरे से हिलाएं, और फ्लास्क को रासायनिक हुड के अंदर स्थापित 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डालें। फ्लास्क को 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, हर सुबह सौम्य मिश्रण के साथ।
      नोट: वाणिज्यिक पेरासिटिक एसिड-आधारित कीटाणुनाशक ( सामग्री की तालिका देखें) सीधे निर्माता द्वारा प्रदान किया गया था।
      चेतावनी: कीटाणुनाशकों का उपयोग रासायनिक हुड के तहत किया जाना चाहिए। प्रयोग की अवधि के लिए सुरक्षा चश्मा और दस्ताने पहने जाने चाहिए। कीटाणुनाशक के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया संबंधित सामग्री सुरक्षा डेटा शीट देखें।
    2. हाइड्रोजन पेरोक्साइड का अनुमापन करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
      1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर एक खाली 300 एमएल बीकर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और पैमाने को तारे करें। बीकर में लगभग 0.23 ग्राम कीटाणुनाशक का वजन करें और जोड़े गए सटीक वजन पर ध्यान दें। बीकर में 100 ग्राम ठंडा 1 एन सल्फ्यूरिक एसिड समाधान जोड़ें, बीकर में एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें, और इसे एक हलचल प्लेट पर रखें।
      2. समाधान को पूर्ण समरूपीकरण तक हिलाने दें। फिर, बीकर में फेरोइन संकेतक समाधान (एच2ओ में 0.1 डब्ल्यूटी%) की तीन बूंदें जोड़ें, और 0.1 एन सेरियम सल्फेट समाधान के साथ टाइटरेट करें जब तक कि समाधान सैल्मन-गुलाबी रंग से हल्के-नीले रंग में बदल न जाए। सेरियम सल्फेट समाधान की मात्रा पर ध्यान दें।
      3. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रतिशत की गणना करें:
        Equation 1 समीकरण (1)
        जहां एस सेरियम सल्फेट समाधान की मात्रा है, एन सेरियम सल्फेट समाधान (0.1 एन) की सामान्यता है, डब्ल्यू नमूने का वजन (~ 0.2300 ग्राम) है, और 0.017 = (1 मोल एच2ओ2/2 मोल सीई) × (34.0147 जी एच2 ओ 2ओ2 /1 मोल एच2ओ)2 × (1 एल / 1,000 एमएल) है।
    3. नीचे वर्णित कार्बनिक पेरोक्सीसिड्स का अनुमापन करें।
      1. बीकर में 7.5% (डब्ल्यू / वी) पोटेशियम आयोडाइड समाधान का 20 एमएल जोड़ें। 0.1 एन सोडियम थायोसल्फेट समाधान के साथ धीरे-धीरे टाइटरेट करें जब तक कि घोल का नीला रंग हल्का भूरा / नारंगी न हो जाए।
      2. बीकर में 2 एमएल स्टार्च समाधान (एच2ओ में 1 डब्ल्यूटी%) जोड़ें और 0.1 एन सोडियम थायोसल्फेट समाधान के साथ टाइटरेट करें जब तक कि समाधान काले से नारंगी में बदल न जाए। उपयोग किए गए सोडियम थायोसल्फेट समाधान की मात्रा पर ध्यान दें।
      3. निम्नलिखित सूत्र के साथ कार्बनिक पेरोक्सीसिड के प्रतिशत की गणना करें:
        Equation 2 समीकरण (2)
        जहां T सोडियम थायोसल्फेट समाधान का आयतन है, N सोडियम थायोसल्फेट समाधान (0.1 N) की सामान्यता है, W नमूने का वजन (~ 0.2300g) है, और 0.038 = (1 mol CH3COOOH/1 mol I2) × (1 mol I2/2 mol S2O3) × (76.06 g/1 mol CH3COOH) × (1 L/1,000 mL) है।
        नोट: चरण 1.2.2 और चरण 1.2.3 को दो और नमूनों के साथ तीन प्रतियों में प्रत्येक परीक्षण करने के लिए दोहराएं।

2. एकल और मिश्रित बायोफिल्म का गठन

  1. बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट्स
    1. वोर्टेक्स जीवाणु संस्कृति वाली ट्यूब (तनाव का 20 μL + TSB माध्यम का 10 mL, चरण 1.1.4 में तैयार किया गया है)। रात भर की संस्कृति के जीवाणु कोशिका गणना (सीएफयू) को निर्धारित करने के लिए ट्राइप्टिक सोया एगर (टीएसए) पर सीरियल कमजोर पड़ने और चढ़ाना करें। फिर, 100 μL संस्कृति को बाँझ TSB माध्यम के 10 mL में स्थानांतरित करें (लगभग 2 x 107 cfu / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए)।
      नोट: बायोरिएक्टर के साथ परख के लिए, माइक्रोबियल आइसोलेट के 100 μL की मात्रा को बाँझ TSB के 100 एमएल में स्थानांतरित किया जाता है।
    2. वोर्टेक्स ट्यूब। प्रत्येक जीवाणु के लिए, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके तीन प्रतियों में पतला जीवाणु संस्कृति को बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट (150 μL प्रति कुएं) में स्थानांतरित करें। नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए टीएसबी माध्यम के 150 μL को तीन नए कुओं में लोड करें। बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) को 30 डिग्री सेल्सियस पर बिना किसी हलचल के 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: मिश्रित बायोफिल्म परख के लिए, 150 μL की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक निलंबन का 75 μL जोड़ें। बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट में इसके ढक्कन में पेग होते हैं, जिस पर बायोफिल्म बनते हैं।
  2. बायोरिएक्टर
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए बायोरिएक्टर के कुछ हिस्सों को साफ और हवा से सुखाएं ( सामग्री की तालिका देखें), और नीचे वर्णित रिएक्टर तैयार करने के लिए आगे बढ़ें।
      1. सबसे पहले, फ्लैट ब्लेड को 1 एल ग्लास बीकर (बायोरिएक्टर) के अंदर रखें, जो एक चुंबकीय पट्टी द्वारा अपने धारक से जुड़ा हुआ है, और बायोरिएक्टर ढक्कन के आंतरिक हिस्से पर जुड़े प्लास्टिक बार के माध्यम से सेटअप को एक सीधी स्थिति में बनाए रखें।
      2. स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके अपने पॉलीप्रोपाइलीन रॉड पर स्टेनलेस-स्टील कूपन या स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) रखें, और उन्हें ढक्कन में छेद में डालें, उनके संरेखण पिन को पायदान में रखे बिना, नसबंदी के दौरान भाप को भागने की अनुमति दें।
      3. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सभी बायोरिएक्टर वेंट्स को कवर करें, और बाकी उपकरणों को लपेटें, अर्थात् ट्यूबिंग एल / एस 18 (आईडी = 7.9 मिमी) और एल / एस 16 (आईडी = 3.1 मिमी), ग्लास फ्लो ब्रेक, कंटेनर कैप्स, स्क्रूड्राइवर, फोर्सप्स, और 0.2 μm फिल्टर, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ।
        नोट: मध्यम कंटेनर टोपी की आंतरिक सतह पर स्थित कांटे में सिलिकॉन ट्यूबिंग ( सामग्री की तालिका देखें) डालें।
      4. बायोरिएक्टर को 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर शुष्क चक्र में स्थापित किया जाता है।
    2. बैच मोड (पहला चरण) में बायोरिएक्टर में बायोफिल्म गठन करें।
      1. बीएससी में, टयूबिंग एल / एस 18 के एक छोर को बायोरिएक्टर के आउटलेट स्पाउट से कनेक्ट करें, और बाँझपन को संरक्षित करने के लिए दूसरे छोर को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर रखें।
      2. बायोरिएक्टर ढक्कन से एक कूपन या स्लाइड धारक निकालें और इसे बाँझ 50 एमएल ट्यूब में रखें। बाद में, बायोरिएक्टर के बीकर को 300 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम के 340 एमएल के साथ उस छेद के माध्यम से भरें जो रॉड द्वारा 50 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कब्जा कर लिया गया था।
      3. बायोरिएक्टर में कल्चर माध्यम को 1 एमएल बैक्टीरियल घोल (~ 108 सीएफयू / एमएल ऑफ पी एज़ोटोफॉर्मन्स) के साथ पहले इस्तेमाल किए गए उसी छिद्र के माध्यम से 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके टीका लगाएं, और फिर रॉड को अपनी मूल स्थिति में वापस रखें। उन छड़ों को रखें जो पहले से ही ढक्कन छेद में रखे गए हैं ताकि पिन अपने संबंधित पायदान में फिट हों।
      4. सबसे छोटे व्यास के साथ ट्यूब के अंत में 0.2 μm बैक्टीरियल एयर प्यूर्ज फिल्टर रखें, जो बायोरिएक्टर के ढक्कन पर स्थित है। उसी व्यास की दूसरी ट्यूब स्थायी रूप से धातु स्क्रू कैप या सिलिकॉन प्लग के साथ प्लग की जाती है जो कसकर बंद हो जाती है।
      5. बायोरिएक्टर को 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग प्लेट पर 24 घंटे के लिए रखें और 130 आरपीएम पर हिलाएं।
        नोट: बहु-प्रजाति बायोफिल्म गठन के लिए, इनोकुलम के लिए 1 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए विभिन्न जीवाणु संस्कृतियों की समान मात्रा का उपयोग करें।
    3. निरंतर प्रवाह मोड (दूसरा चरण) में बायोरिएक्टर में बायोफिल्म गठन करें।
      1. बीएससी में 18 लीटर बाँझ आसुत जल युक्त एक कार्बोय रखें, और 100 मिलीग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1,000 मिलीग्राम / एल टीएसबी कल्चर माध्यम का 2 एल जोड़ें।
      2. कंटेनर को इसकी बाँझ टोपी के साथ कवर करें, जिससे दो ट्यूब जुड़े हुए हैं। पहला एक सिलिकॉन ट्यूब है जो टोपी के आंतरिक चेहरे पर तय किया गया है और इसका उपयोग माध्यम को पंप करने के लिए किया जाता है। दूसरी ट्यूब (एल / एस 16) बाहरी बंदरगाह से जुड़ी हुई है ताकि तरल को बायोरिएक्टर की ओर बहने की अनुमति मिल सके। मध्यम कंटेनर के ढक्कन पर दूसरी ट्यूब में 0.2 μm फ़िल्टर रखें।
      3. इस दूसरी ट्यूब को पेरिस्टालिक पंप से कनेक्ट करें और दूसरे छोर को ग्लास फ्लो ब्रेक से जोड़ें, जिसे बाद में बायोरिएक्टर ढक्कन पर बड़ी ट्यूब में डाला जाता है।
      4. बायोरिएक्टर से बहिस्त्राव एकत्र करने के लिए एक और 20 एल कार्बोय का उपयोग करें। बायोरिएक्टर आउटलेट से जुड़े ट्यूब के अंत को अपशिष्ट कंटेनर की टोपी से संलग्न करें। इस कंटेनर के ढक्कन पर उपलब्ध ट्यूब में 0.2 μm फ़िल्टर डालें।
      5. 11.3 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर पेरिस्टाल्टिक पंप शुरू करें, और सिस्टम को 24 घंटे तक चलने दें।
        नोट: बायोरिएक्टर में बायोफिल्म निर्माण के दौरान उपयोग किए जाने वाले कल्चर माध्यम या दूध की प्रवाह दर (11.3 एमएल / मिनट) 30 मिनट के निवास समय से 340 एमएल (जो रिएक्टर के भीतर तरल की मात्रा से मेल खाती है) को विभाजित करके निर्धारित की गई थी।
    4. बैक्टीरियल बायोफिल्म को पुनर्प्राप्त करें।
      1. पेरिस्टालिक पंप को बंद करें और बायोरिएक्टर को हिलाना और गर्म करना बंद करें।
      2. बायोरिएक्टर से प्रत्येक रॉड को सावधानीपूर्वक हटा दें, और प्लवक बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए पीबीएस के 40 एमएल में कूपन या स्लाइड 3x को कुल्ला करें। इसके बाद, कूपन या स्लाइड को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में छोड़ दें जिसमें एक उपयुक्त स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके 40 एमएल पीबीएस होता है। 30 सेकंड के लिए ट्यूबों को भंवर, उन्हें एक सोनिकेटर स्नान में रखे गए रैक पर स्थानांतरित करें, और ट्यूबों को 30 सेकंड के लिए 40 kHz पर सोनिकेट करें (जिसके लिए 110 W शक्ति की आवश्यकता होती है)। इस कार्रवाई को 3x दोहराएँ।
      3. बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 40 एमएल बायोफिल्म निलंबन एकत्र करें, और फिर कूपन या स्लाइड को बाँझ पीबीएस समाधान के 2 एमएल के साथ कुल्ला करें। इस कुल्ला तरल को पुनर्प्राप्त करें और इसे पहले से एकत्र किए गए बायोफिल्म निलंबन में जोड़ें।
    5. बायोफिल्म में व्यवहार्य बैक्टीरिया की गणना करें: प्राप्त बायोफिल्म निलंबन के साथ, 10 गुना सीरियल तनुकरण करें, और फिर तीन प्रतियों में टीएसए पर 10-5 और 10-6 कमजोर पड़ने के 100 μL की प्लेट करें । प्लेटों को 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। आगर प्लेटों पर मौजूद कॉलोनियों की संख्या की गणना करें, और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके एएसटीएम ई 2562-1714 के अनुसार कूपन और स्लाइड (व्यवहार्य सेसिले बैक्टीरिया) पर जीवाणु घनत्व की गणना करें:
      Equation 3 समीकरण (3)
      जहां एक्स कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या है, बी वॉल्यूम प्लेटेड (0.1 एमएल) है, वी वह मात्रा है जिसमें बायोफिल्म निलंबित है (स्टॉक समाधान), ए बायोफिल्म द्वारा कवर किए गए कूपन या स्लाइड की सतह है, और डी कमजोर पड़ने वाला कारक है।

3. बायोफिल्म के उन्मूलन के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का मात्रात्मक मूल्यांकन

  1. बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट्स
    1. 96-वेल माइक्रोप्लेट के तीन कुओं में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (1x PBS) का 200 μL जोड़ें।
    2. बायोफिल्म को धोने और प्लवक बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए बायोफिल्म माइक्रोप्लेट के ढक्कन को 10 सेकंड के लिए पीबीएस युक्त 96-वेल माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें।
    3. आवश्यक सांद्रता (जैसे, 25 पीपीएम, 50 पीपीएम, 500 पीपीएम, 1,000 पीपीएम, 5,000 पीपीएम, 10,000 पीपीएम और 25,000 पीपीएम सक्रिय पदार्थ) पर कीटाणुनाशक तैयार करें।
      नोट: बाँझ आसुत जल का उपयोग करके सभी कमजोर पड़ने को सड़न होते हैं।
    4. तीन प्रतियों में एक नई 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में कीटाणुनाशक की प्रत्येक एकाग्रता का 200 μL जोड़ें। बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट के ढक्कन को इस 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट पर स्थानांतरित करें जिसमें कीटाणुनाशक होते हैं, और वांछित एक्सपोजर समय के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. एक नई 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में डे-एंगली न्यूट्रलाइजिंग शोरबा का 200 μL जोड़ें। बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट के ढक्कन को 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट पर स्थानांतरित करें जिसमें न्यूट्रलाइजिंग शोरबा होता है। पैराफिल्म के साथ माइक्रोटिटर प्लेट को सील करें, और इसे 30 मिनट के लिए 40 किलोहर्ट्ज पर स्नान सोनिकेटर में रखें।
    6. 30 मिनट के बाद, माइक्रोटिटर प्लेट को सोनिकेटर से हटा दें और पैराफिल्म को हटा दें। 96-वेल प्लेट के पहले स्तंभ से 100 μL स्थानांतरित करें जिसमें बायोफिल्म शामिल हैं, जो एक नई 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट की पहली पंक्ति में सोनिकेशन के बाद अलग हो गए।
    7. पहली पंक्ति को छोड़कर, नए 96-वेल माइक्रोप्लेट (चरण 3.1.6 में तैयार) के कुओं में बाँझ 1x PBS का 180 μL जोड़ें। बायोफिल्म समाधान के 20 μL को पहली पंक्ति से दूसरी पंक्ति में कुओं में स्थानांतरित करें जिसमें 1x PBS का 180 μL (पंक्ति 2, कमजोर पड़ना: 10−1) होता है। फिर, दूसरी पंक्ति में निहित तरल के 20 μL को अगली पंक्ति में कुओं में स्थानांतरित करें जिसमें 1x PBS का 180 μL (पंक्ति 3, कमजोर पड़ना: 10−2) है। 10−5 और 10−7 के बीच कमजोर पड़ने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
    8. टीएसए पर कमजोर पड़ने के 100 μL को टीका लगाएं, और प्रत्येक जीवाणु के विकास के लिए आवश्यक मापदंडों के अनुसार प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    9. इनक्यूबेशन के बाद, सीएफयूएस की गणना करें और निम्नलिखित समीकरणों के साथ प्रत्येक खूंटी के लिए लॉग10 घनत्व और प्रत्येक कीटाणुनाशक एकाग्रता पर लॉग10 कमी की गणना करें:
      Equation 4 समीकरण (4)
      जहां X उस स्थान पर गिनी जाने वाली कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ हैं, B आयतन प्लेटेड (0.01 mL), V अच्छी तरह से आयतन (0.20 mL), A खूंटे की सतह का क्षेत्रफल (46.63 मिमी2) है, और D कमजोर पड़ने वाला है।
      Equation 5 समीकरण (5)
    10. स्वतंत्र दिनों में प्रत्येक प्रयोग को 3x दोहराएं।
      नोट: "बायोफिल्म को मिटाने वाले कीटाणुनाशक की न्यूनतम एकाग्रता", या एमबीईसी, सबसे कम कीटाणुनाशक एकाग्रता से मेल खाती है जो कोई जीवाणु वृद्धि नहीं दिखाती है।
  2. बायोरिएक्टर
    नोट: एएसटीएम मानक ई 2871-1915 की प्रक्रिया का पालन पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएलए 1 के साथ इस परीक्षण को करने के लिए किया जाता है।
    1. बायोरिएक्टर में कूपन पर बायोफिल्म बनाकर शुरू करें, जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है। फिर, कूपन रखने वाली रॉड को हटा दें और इसे 30 एमएल पीबीएस युक्त शंक्वाकार ट्यूब के अंदर कुल्ला करें।
    2. स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके प्रत्येक कूपन को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में छोड़ दें, और फिर नियंत्रण के लिए उपयुक्त कार्बनिक पेरोक्सीसिड समाधान या पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर शोरबा को बेअसर करने के लिए डे-एंगले के 36 एमएल जोड़ें। 30 सेकंड के लिए भंवर, और फिर एक सोनिकेटर स्नान का उपयोग करके 30 सेकंड के लिए 40 kHz पर सोनिकेट करें। बायोफिल्म निलंबन प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया 3x दोहराएं।
    3. इसी तरह, अन्य सभी छड़ों को धो लें और कूपन से बायोफिल्म को पुनर्प्राप्त करें। टीएसए माध्यम पर बायोफिल्म निलंबन और प्लेट 0.1 एमएल के सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। प्लेटों को 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, सीएफयूएस की गणना करें, और फिर प्रत्येक कूपन (समीकरण 6) के लिए बायोफिल्म घनत्व की गणना करें, एक ही रॉड से तीन कूपन के प्रत्येक सेट के लिए औसत लॉग घनत्व (एलडी), जिसमें उपचारित और नियंत्रण (समीकरण 7) शामिल हैं, और निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके कीटाणुनाशक (समीकरण 8) के लिए लॉग कमी:
      Equation 6 समीकरण (6)
      जहां एक्स कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों का माध्य है/ कूपन है, बी वॉल्यूम प्लेटेड (0.1 एमएल), वी कीटाणुनाशक या पीबीएस प्लस न्यूट्रलाइज़र (40 एमएल) की मात्रा है, और डी कमजोर पड़ने वाला है।
      Equation 7 समीकरण (7)
      Equation 8 समीकरण (8)

4. बायोफिल्म के उन्मूलन के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का गुणात्मक मूल्यांकन

नोट: कीटाणुनाशकों (चरण 3.1.1 से चरण 3.1.5) के साथ इलाज किए जाने के बाद, स्थिर विधि में बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट के खूंटे पर बनने वाले पी एज़ोटोफॉर्मन्स बायोफिल्म तैयार किए गए थे और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अवलोकन द्वारा विश्लेषण किया गया था।

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम)
    1. 96-वेल माइक्रोप्लेट के तीन कुओं में 1x PBS का 200 μL जोड़ें। ढक्कन को बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट (चरण 3.1.5) से पीबीएस युक्त 96-वेल माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें, और डे-एंगली न्यूट्रलाइजिंग शोरबा को खत्म करने के लिए इसे 10 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    2. स्टरलाइज़्ड सुई नाक प्लियर्स का उपयोग करके बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट से खूंटे को हटा दें। प्रत्येक खूंटी को एक हुड के नीचे एक खाली शीशी में रखें, और प्रत्येक शीशी में प्राथमिक फिक्सेटिव (0.1 एम ना कैकोडाइलेट बफर पीएच 7.5 में 5% ग्लूटारल्डिहाइड) जोड़ें। प्रत्येक शीशी को कैप करें और उन्हें 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन बाद, फिक्सेटिव को पिपेट के साथ डिकेंट करें, और सभी तरल कचरे को एक उपयुक्त कंटेनर में फेंक दें। प्रत्येक शीशी की टोपी को हटा दें और उन्हें 72 घंटे के लिए हवा में सूखने के लिए हुड में रखें।
    4. प्रत्येक स्टब की सपाट ऊपरी सतह पर एपॉक्सी राल ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करके एल्यूमीनियम स्टब्स (सामग्री की तालिका देखें) पर नमूने माउंट करें। फिर, सावधानी से खूंटे को बल के साथ स्टब्स पर चिपकाएं।
    5. नमूनों को ईएमएस 950x + 350s सोने के स्पटर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ 4 मिनट के लिए 2 x 10−1 बार आर्गन दबाव और 20 mA धारा पर धातुकृत करें। चांदी के पेंट के साथ सोने के संपर्क में नहीं आने वाले खूंटे के किनारे को पेंट करके उचित ग्राउंडिंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. एसईएम नियंत्रण उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस संस्करण 6.28 का उपयोग करके स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर छवियां प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। इस अध्ययन में उपयोग किया गया त्वरण वोल्टेज 15 केवी था, और आवर्धन 300x और 2,000x थे।
  2. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
    1. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के तीन कुओं में 1x PBS का 200 μL जोड़ें। ढक्कन को बायोफिल्म माइक्रोप्लेट से पीबीएस युक्त 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और डे-एंगली न्यूट्रलाइजिंग शोरबा को खत्म करने के लिए इसे 10 सेकंड के लिए छोड़ दें।
    2. 1 एमएल बाँझ पानी में 3 μL हरे फ्लोरोसेंट दाग और 3 μL लाल फ्लोरोसेंट दाग ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर फ्लोरोसेंट दाग के समाधान तैयार करें।
    3. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के एक कुएं में 200 μL धुंधला घोल जोड़ें। ढक्कन को बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट से 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें धुंधला घोल हो। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट को कवर करें, और कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    4. 96-वेल माइक्रोप्लेट के कुओं में 200 μL स्टरलाइज़्ड पानी जोड़ें। फिर, ढक्कन को बायोफिल्म माइक्रोप्लेट से पानी युक्त 96-वेल माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें, और इसे अवलोकन तक छोड़ दें।
    5. 63x/1.40 तेल DIC उद्देश्य के साथ कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके खूंटे पर गठित बायोफिल्म की कल्पना करें। संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। हरे और लाल फ्लोरोसेंट दाग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति उत्तेजना तरंग दैर्ध्य क्रमशः 482 एनएम और 490 एनएम थे।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, खूंटे को 60 मिमी पेट्री डिश में काटें और रखें और डिश को बाँझ पानी से भरें।

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Representative Results

एसईएम विश्लेषण बायोफिल्म माइक्रोप्लेट पेग (चित्रा 2 ए) पर पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए द्वारा उत्पादित बायोफिल्म की उपस्थिति को दर्शाता है। एक त्रि-आयामी बायोफिल्म संरचना देखी जा सकती है। एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए को पहले 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट्स12 का उपयोग करके एक मजबूत बायोफिल्म निर्माता (ए570 > 1.5) के रूप में पहचाना गया था।

इसके अलावा, बायोरिएक्टर का उपयोग करके स्टेनलेस-स्टील स्लाइड पर बनने वाला पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म बहुत घना प्रतीत होता है और तीन आयामी संरचना (चित्रा 2 बी) के साथ एक परिपक्व बायोफिल्म की रूपात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, गतिशील प्रणाली में इस आइसोलेट द्वारा विकसित बायोफिल्म के जीवाणुओं की गणना के परिणामों ने टीएसबी संस्कृति माध्यम और बाँझ स्किम दूध में क्रमशः 8.74 लॉग सीएफयू / सेमी2 और 7.86 लॉग सीएफयू / सेमी2 के अनुरूप महत्वपूर्ण सेल घनत्व दिखाया (चित्रा 2 सी)।

इसके अलावा, बी वेसिकुलरिस आइसोलेट के साथ प्राप्त चित्रा 3 में दिखाए गए परिणामों से पता चला है कि कुछ कारकों का बायोरिएक्टर में बायोफिल्म गठन पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। कुछ मापदंडों को बदलकर, जैसे कि बायोरिएक्टर के भीतर सरगर्मी की गति, मध्यम प्रवाह दर, मध्यम पोषक तत्व एकाग्रता, और निरंतर मोड चरण की अवधि, सेल अटैचमेंट को बढ़ाया जा सकता है, और सघन बायोफिल्म देखे जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, पोषक तत्वों की सांद्रता 100 मिलीग्राम / एल से 900 मिलीग्राम / एल (स्थिति एफ की तुलना में स्थिति ए) तक बढ़ने के परिणामस्वरूप बायोफिल्म की जीवाणु गिनती में 6.11 लॉग सीएफयू / सेमी2 से 8.71 लॉग सीएफयू / सेमी2 तक वृद्धि हुई। इसके अलावा, बायोफिल्म की महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई जब प्रवाह दर 6.0 एमएल / मिनट (स्थिति सी में) तक कम हो गई, जिसके परिणामस्वरूप इस अलगाव की वृद्धि दर के अनुरूप एक लंबा निवास समय था।

बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेटों या बायोरिएक्टर प्री-और पोस्ट-कीटाणुनाशक उपचार पर गठित बायोफिल्म के सूक्ष्म अवलोकन व्यवहार्य सेल गणना के पूरक थे। चित्रा 4 से पता चलता है कि किसी भी बायोफिल्म में आमतौर पर डेयरी पौधों में लागू कीटाणुनाशकों के संपर्क समय (5 मिनट) और सांद्रता (कार्बनिक पेरोक्सीसिड के साथ 500 पीपीएम और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ 100,000 पीपीएम) पर पता लगाने योग्य व्यवहार्य कोशिकाएं नहीं होती हैं। इन परिणामों की पुष्टि माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) द्वारा की गई थी। चित्रा 5 ए एक अनुपचारित एमबीईसी बायोफिल्म (नियंत्रण) की त्रि-आयामी संरचना को दर्शाता है, जबकि इलाज किए गए एमबीईसी बायोफिल्म (हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पेरासिटिक एसिड, पेरलैक्टिक एसिड, परप्रोपियोनिक एसिड और एक वाणिज्यिक कीटाणुनाशक तैयारी के साथ) एसईएम द्वारा निर्धारित अपनी त्रि-आयामी रचना खो देते हैं। हालांकि, हालांकि बायोफिल्म को कीटाणुनाशक के साथ इलाज किया गया था, एक स्पष्ट बायोफिल्म संरचना बनी रही, खासकर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ। फिर भी, इस मामले में, फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता धुंधला के साथ एक जीवित / मृत तकनीक का उपयोग, ने पुष्टि की कि शेष बायोफिल्म संरचना मुख्य रूप से कीटाणुनाशक उपचार के बाद बेजान थी (चित्रा 5 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: बायोफिल्म को खत्म करने के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक संयुक्त स्थिर और गतिशील दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करने वाला फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: स्यूडोमोनास एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए द्वारा बायोफिल्म गठन का विश्लेषण। (ए) बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट के खूंटे पर गठित पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (300x और 2,000x)। इस आंकड़े को अनुमति के साथ गोएट्ज़ एट अल .12 से संशोधित किया गया है (कॉपीराइट 2022 अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी)। सभी अधिकार सुरक्षित.)। स्केल सलाखों = 50 μm (300x), 100 μm (2,000x)। (बी) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (2,000x) (1) एक स्टेनलेस-स्टील स्लाइड जिसमें बायोरिएक्टर में उगाया गया पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म और (2) एक बायोफिल्म-मुक्त स्लाइड (नकारात्मक नियंत्रण) होता है। स्केल बार = 10 μm. इस आंकड़े को अनुमति के साथ निबोचा एट अल.16 से संशोधित किया गया है। (ग) एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म का जीवाणु घनत्व टीएसबी कल्चर माध्यम और बाँझ स्किम दूध में बायोरिएक्टर में बनता है और स्टेनलेस-स्टील स्लाइड से अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा उनके हटाने के बाद निर्धारित किया जाता है। डेटा को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.05) छात्र के टी-टेस्ट पर आधारित है। इस आंकड़े को अनुमति के साथ निबोचा एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सरगर्मी, प्रवाह दर, निरंतर मोड में समय और संस्कृति मीडिया (टीएसबी) की अलग-अलग परिस्थितियों में बायोरिएक्टर का उपयोग करके विकसित ब्रेवंडिमोनास वेसिकुलरिस बायोफिल्म का जीवाणु घनत्व। शर्त ए: 130 आरपीएम सरगर्मी गति, 11.8 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 100 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 24 घंटे निरंतर मोड (एएसटीएम इंटरनेशनल प्रोटोकॉल ई 2562-1714 के अनुसार स्यूडोमोनास एरुगिनोसा द्वारा बायोफिल्म के गठन के लिए);; स्थिति बी: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 11.8 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 100 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 24 घंटे निरंतर मोड; स्थिति सी: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 6.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 100 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 24 घंटे निरंतर मोड; स्थिति डी: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 6.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 100 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 48 घंटे निरंतर मोड; शर्त ई: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 6.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 300 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 48 घंटे निरंतर मोड; स्थिति एफ: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 6.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 900 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 48 घंटे निरंतर मोड; स्थिति जी: 60 आरपीएम सरगर्मी गति, 6.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, 2.7 जी / एल टीएसबी में 24 एच बैच मोड और 900 मिलीग्राम / एल टीएसबी माध्यम में 48 घंटे निरंतर मोड। डेटा को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। महत्वपूर्ण अंतर (विभिन्न अक्षर, पी < 0.05) एक-तरफ़ा एनोवा और टुकी के कई तुलना परीक्षण पर आधारित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पेरलैक्टिक एसिड, पेरप्रोपियोनिक एसिड, पेराशेटिक एसिड, या वाणिज्यिक कीटाणुनाशक के साथ उपचार से पहले और बाद में स्यूडोमोनास एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म में व्यवहार्य सेल गिनती। प्रत्येक बिंदु प्रत्येक पृथक के लिए तीन स्वतंत्र दिनों में प्राप्त तीन प्रतियों की गणना के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े को अनुमति के साथ गोएट्ज़ एट अल .12 से संशोधित किया गया है (कॉपीराइट 2022 अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी)। सभी अधिकार सुरक्षित.)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: बायोफिल्म संरचना और व्यवहार्यता का सूक्ष्म अवलोकन। (ए) हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पेराशेटिक एसिड, पेर्प्रोपियोनिक एसिड और वाणिज्यिक कीटाणुनाशक के साथ उपचार के पहले (नियंत्रण) से पहले और बाद में बायोफिल्म माइक्रोटिटर प्लेट के खूंटे पर गठित स्यूडोमोनास एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएल 1 ए बायोफिल्म के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (300x और 2,000x) उनके न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन सांद्रता (एमबीईसी) पर। स्केल बार = 10 μm. इस आंकड़े को अनुमति के साथ गोएट्ज़ एट अल .12 से संशोधित किया गया है (कॉपीराइट 2022 अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी)। सभी अधिकार सुरक्षित.)। (ख) पी. एज़ोटोफोरमैन्स पीएफएल1ए द्वारा गठित बायोफिल्म की व्यवहार्यता, जो पेरासिटिक एसिड (500 पीपीएम) के साथ उपचार से पहले (बाएं) और बाद में बायोफिल्म माइक्रोप्लेट पेग पर फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता धुंधलापन का उपयोग करती है, जिसे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (63x/1.40 तेल विभेदक हस्तक्षेप विपरीत उद्देश्य) द्वारा कल्पना की जाती है। व्यवहार्य कोशिकाएं हरे रंग की होती हैं, और मृत कोशिकाएं लाल रंग की होती हैं। स्केल बार = 20 μm। इस आंकड़े को अनुमति के साथ गोएट्ज़ एट अल .12 संशोधित किया गया है (कॉपीराइट 2022 अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी)। सभी अधिकार सुरक्षित.)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एमबीईसी परख (बायोफिल्म माइक्रोप्लेट परख) एएसटीएम17 द्वारा मानक बायोफिल्म उन्मूलन परीक्षण के रूप में मान्यता प्राप्त करने वाली पहली विधि थी। हमारे अध्ययन और अन्य लोगों ने दिखाया है कि इस परख का उपयोग करते समय दो महत्वपूर्ण कदम हैं: सोनिकेशन चरण (समय और शक्ति) और कीटाणुनाशक उपचार समय18। स्टीवर्ट और पार्कर ने अन्य मापदंडों का भी सुझाव दिया जो परख के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि माइक्रोबियल प्रजातियां, बायोफिल्म आयु, सतह क्षेत्र / 19. अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि माइक्रोप्लेट ढक्कन पर खूंटे के चारों ओर बायोफिल्म का गठन विषम हो सकता है और उपयोग किए गए बैक्टीरिया के आधार पर भिन्न होगा।

एमबीईसी विधि का उपयोग संभावित रूप से विभिन्न प्रकार के कीटाणुनाशकों के साथ किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग, जैसे एसईएम और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, क्रमशः बायोफिल्म पूर्व और बाद के कीटाणुनाशक उपचार की त्रि-आयामी संरचनाओं और व्यवहार्यता स्थिति (फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता धुंधला किट, सामग्री की तालिका देखें) का अध्ययन करने के लिए पूरक और अत्यंत उपयोगी हैं। बायोफिल्म बनाने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता का अध्ययन मुख्य रूप से निष्पादन की आसानी और गति के कारण माइक्रोटिटर प्लेटों के साथ किया गया है। हालांकि, बिना कतरनी बलों के साथ इस बंद प्रणाली का उपयोग, जैसा कि ज्यादातर स्थितियों में देखा गया है, की सीमाएं हैं। इसलिए, एक गतिशील बायोफिल्म गठन विधि का उपयोग, जैसे सीडीसी बायोरिएक्टर, बायोफिल्म माइक्रोप्लेट परख का उपयोग करके किए गए अवलोकनों की पुष्टि करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।

एएसटीएम मानकीकृत विधि14,15 और प्रकाशित अध्ययन20,21 के अनुसार, बायोरिएक्टर का उपयोग बड़े पैमाने पर बायोफिल्म विकसित करने और कीटाणुनाशकों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। यह उपकरण बायोफिल्म गठन की कुछ पर्यावरणीय स्थितियों की नकल करता है, जैसे कि उच्च कतरनी बल, विशिष्ट और नवीकरणीय पोषक तत्वों और सतह सामग्री के संदर्भ में। इस अध्ययन में, इस गतिशील प्रणाली का उपयोग करके स्टेनलेस-स्टील स्लाइड पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिपक्व पी एज़ोटोफॉर्मन्स पीएफएलए 1 स्ट्रेन बायोफिल्म प्राप्त किए गए थे। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्यूडोमोनास एरुगिनोसा का उपयोग करके एएसटीएम मानक प्रोटोकॉल पर आधारित था। हालांकि, इस मानकीकृत बायोफिल्म विधि को सभी सूक्ष्मजीवों पर लागू नहीं किया जा सकता है, भले ही उन्हें अन्य तकनीकों का उपयोग करके मजबूत बायोफिल्म उत्पादकों के रूप में दिखाया गया हो। वेसिकुलरिस के लिए यह मामला था, जिसके लिए उच्च बायोफिल्म घनत्व तक पहुंचने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जाना था।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि बायोफिल्म विकास की प्रक्रिया में कुछ परिचालन स्थितियां (या पैरामीटर) महत्वपूर्ण हैं और परीक्षण किए गए बैक्टीरिया में से प्रत्येक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए 22,23,24। उदाहरण के लिए, पोषक तत्वों की आवश्यकताओं को वरीयताऔर एकाग्रता के संदर्भ में प्रत्येक जीवाणु के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि बायोफिल्म मोटे होते हैं और बैच मोड में उगाए जाने की तुलना में बायोरिएक्टर में निरंतर पोषक तत्व आपूर्ति की स्थिति के तहत अधिक महत्वपूर्ण बायोमास होते हैं, जिसे पोषक तत्व-सीमितवातावरण माना जाता है। एक और महत्वपूर्ण पहलू निवास समय है, जिसे प्रवाह दर द्वारा नियंत्रित किया जाता है और इसे जीवाणु दोहरीकरण समय से कम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इष्टतम विकास की स्थिति प्रदान करने के लिए प्रत्येक जीवाणु के लिए तरल पदार्थ के तापमान और कतरनी मिश्रण को समायोजितकरना होगा। बैफल के आंदोलन से उत्पन्न उच्च कतरनी तनाव बायोफिल्म विकास को बढ़ावा देता है और इसकी संरचना और मोटाई को नियंत्रित करने में भूमिकानिभाता है। हालांकि, अगर सरगर्मी की गति बहुत अधिक बढ़ जाती है, तो यह बायोफिल्म की सतह के क्षरण या झुकाव का कारण बन सकती है, जिससे जीवाणु घनत्व29,30 कम हो जाता है।

बायोरिएक्टर के उपयोग की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि पोषक तत्व माध्यम के रूप में बड़ी मात्रा में तरल पदार्थ का उपयोग करने के अलावा यह महंगा और समय लेने वाला है। फिर भी, यह बायोफिल्म बनाने और अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक दोहराने योग्य और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि बनी हुई है। एक बायोरिएक्टर का उपयोग विभिन्न सामग्रियों से बने कई कूपन के एक साथ उपयोग की भी अनुमति देता है। बायोरिएक्टर को बायोफिल्म विकास के दौरान प्रयोगात्मक स्थितियों की निगरानी के लिए डिज़ाइन किया गया है, जैसे कि तापमान, सरगर्मी की गति और प्रवाह दर, और यह बाद के विश्लेषण के लिए सजातीय और प्रतिनिधि बायोफिल्म की वसूली की अनुमति देता है। कुल मिलाकर, स्थैतिक और गतिशील तरीके खाद्य और पर्यावरणीय क्षेत्रों से अलग बायोफिल्म के खिलाफ कीटाणुनाशकों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पूरक हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को कंसोर्टियम डी रेचरचे एट इनोवेशन्स एन बायोप्रोसिडेस इंडस्ट्रियल्स एयू क्यूबेक (सीआरआईबीआईक्यू) (2016-049-सी 22), एग्रोपुर, ग्रुप सानी मार्क और कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (आरडीसीपीजे 516460-17) द्वारा समर्थित किया गया था। हम पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए टेरेसा पैनिकोनी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filters  Corning 09-754-28 diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon Biosurface Technologies Corporation RD128-316
316 stainless-steel slide coupon Biosurface Technologies Corporation CBR 2128-316
96-microtiter plate Corning 07-200-89 cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
Acetic acid Sigma Aldrich 27225 store at RT
Aluminium stubs Electron Microscopy Science 75830-10 32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16220 store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance Mettler Toledo AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) Biosurface Technologies Corporation BST 02915
BioDestroy Groupe Sani Marc 09-10215 commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L Cole Parmer 06031-52
CDC biofilm reactor Biosurface Technologies Corporation CRB 90 bioreactor
Cerium (IV) sulphate Thermo Scientific 35650-K2 store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700 Zeiss LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth Millipore D3435-500G store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter  Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14121 with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP Greenfield global P016EA95 store at RT
Ferroin indicator solution Sigma Aldrich 318922-100ML store at RT
Filling/venting cap Cole Parmer RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316 fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C
Glass flow break Biosurface Technologies Corporation FB 50
Gold with silver paint  Electron Microscopy Sciences 12684-15
Heating plate set Biosurface Technologies Corporation 110V Stir Plate
Hex screwdriver Biosurface Technologies Corporation CBR 5497
Hydrogen peroxide Sigma 216763 store at 4 °C
Inoculating loops VWR 12000-812 sterile, 10 µl
Lactic acid Laboratoire MAT LU-0200 store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head Cole Parmer 77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base Innovotech 19111 Biofilm microtiter plate
Oxford agar base Thermo Scientific OXCM0856B store at 4 °C
Plastic coupon holder Biosurface Technologies Corporation CBR 2203
Plastic slide holder rod Biosurface Technologies Corporation CBR 2203-GL
Potassium iodide Fisher Chemical P410-500 store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) Wiha 26015
Propionic acid Laboratoire MAT PF-0221 store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance Cole Parmer  UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model JEOL JSM-6360LV SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.205 (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL Sarstedt 62.547.205 (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences  12300 store at -20 °C
Sodium thiosulfate Thermo Scientific AC124270010 store at RT
Sonication bath Fisher 15-336-122 5,7 L
Starch solution Anachemia AC8615 store at RT
Sulfuric acid Sigma Aldrich 258105-500ML store at RT
Tryptic soy agar BD Bacto DF0369-17-6 store at RT
Tryptic soy broth BD Bacto DF0370-17-3 store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25' Cole Parmer MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25' Cole Parmer MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing  Saint-Gobain ABW18NSF IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex Cole Parmer UZ-04724-00
Water bath  VWR 89202-970
Zen software Zeiss

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References

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जीव विज्ञान अंक 190
स्थैतिक और गतिशील तरीकों के संयोजन वाले दृष्टिकोण का उपयोग करके डेयरी बायोफिल्म के उन्मूलन के लिए कार्बनिक पेरोक्सीएसिड की प्रभावकारिता का मूल्यांकन
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Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).

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