Summary
I denne protokollen ble en kneartrosemodell utarbeidet ved hjelp av den modifiserte Videman-metoden, og operasjonsprosedyrene og forholdsreglene for akurotomi er detaljert. Effektiviteten av akupantomi har blitt demonstrert ved å teste de mekaniske egenskapene til quadriceps femoris og sene og de mekaniske og morfologiske egenskapene til brusk.
Abstract
Knæartrose (KOA) er en av de vanligste sykdommene i ortopedisk avdeling, noe som alvorlig reduserer livskvaliteten til mennesker med KOA. Blant flere patogene faktorer er den biomekaniske ubalansen i kneleddet en av hovedårsakene til KOA. Akupotomologi mener at gjenoppretting av den mekaniske balansen i kneleddet er nøkkelen til behandling av KOA. Kliniske studier har vist at akupantomi effektivt kan redusere smerte og forbedre knemobiliteten ved å redusere vedheft, kontraktur i bløtvev og stresskonsentrasjonspunkter i muskler og sener rundt kneleddet.
I denne protokollen brukte vi den modifiserte Videman-metoden for å etablere en KOA-modell ved å immobilisere venstre baklem i en rett posisjon. Vi har skissert operasjonsmetoden og forholdsregler knyttet til akubotomi i detalj og evaluert effekten av akupantomi i forbindelse med teorien om "Modulerende muskler og sener for å behandle beinforstyrrelser" gjennom påvisning av de mekaniske egenskapene til quadriceps femoris og sene, samt bruskmekanikk og morfologi. Resultatene viser at akupantomi har en beskyttende effekt på brusk ved å justere de mekaniske egenskapene til det myke vevet rundt kneleddet, forbedre bruskspenningsmiljøet og forsinke bruskdegenerasjon.
Introduction
Knæartrose (KOA) er den hyppigste formen for slitasjegikt, ofte anerkjent som en helleddssykdom preget av leddbruskdegenerasjon, som manifesterer seg klinisk som smerte, hevelse og begrenset bevegelse av de berørte leddene. Ifølge nyere epidemiologisk statistikk rapporteres KOA å ha påvirket 654,1 millioner individer globalt som var 40 år eller eldre innen 2020. Prevalensen og forekomsten av KOA stiger med alderen, er høyest hos middelaldrende og eldre voksne, og rammer flere kvinner enn menn2. Utbredelsen av KOA vil sannsynligvis øke på grunn av den aldrende befolkningen og fedmeepidemien over hele verden, noe som utgjør en økende trussel mot global folkehelse. Alder, kjønn, fedme, traumer og andre kompliserte risikofaktorer forbundet med KOA har alle direkte innvirkning på knestabilitet, noe som gjør en biomekanisk ubalanse i kneleddene til en av de viktigste årsakene til KOA3.
Under normale fysiologiske forhold er kneleddet i en tilstand av mekanisk balanse, noe som sikrer at de mekaniske belastningene i leddet fordeles jevnt på brusk. Enhver mekanisk ubalanse i kneleddet kan føre til unormal stress i brusk, noe som resulterer i bruskdegenerasjon og utbruddet av KOA4. Muskel-senesystemet er det viktigste dynamiske systemet som opprettholder den mekaniske balansen i kneleddet. Den koordinerte bevegelsen av ekstensor- og flexormuskel-senesystemet kan jevnt fordele belastningen som genereres av bevegelsen på bruskoverflaten, og unngå metabolsk ubalanse av lokale bruskspenninger utover den fysiologiske belastningen som resulterer i brusktap5. Redusert muskelstyrke er hovedårsaken til intramuskulær bevegelsesforstyrrelse og bruskskade, som kan oppstå før symptomatisk KOA.
KOA kan også indusere artrogen muskelhemming (AMI), manifestert som muskelsvakhet og redusert muskelstyrke rundt kneet6. Blant disse musklene fungerer quadriceps femoris-gruppen som den eneste kneekstensoren, en viktig struktur for å opprettholde stabiliteten i kneleddet. Studier har vist at en reduksjon i quadriceps tverrsnittsareal og muskelstyrke er signifikant og positivt korrelert med KOA-progresjon7. Nedgangen i quadriceps styrke påvirker gangmønsteret, knestabiliteten, bevegelsesmønstre og mange andre funksjoner. Videre svekker nedgangen i muskelstyrke senefunksjonen, manifestert som en reduksjon i senestivhet, elastisk modul og andre biomekaniske egenskaper8. Ved langvarig belastningsreparasjon kan endringer som vedheft og kontraktur forekomme i muskler og sener i kneleddet, skade deres mekaniske egenskaper, forårsake leddstabilitet og til slutt danne en ond syklus av patologiske endringer i KOA. Det er derfor avgjørende for KOA-behandling å forbedre de mekaniske egenskapene til muskel-senesystemet og gjenopprette den felles mekaniske balansen.
Blant årsakene til KOA er biomekanisk ubalanse den viktigste induserende faktoren for knesmerter, dysfunksjon, inflammatoriske lesjoner og bruskdegenerasjon9. Derfor er nøkkelen til behandling av KOA å gjenopprette den biomekaniske balansen i kneleddet. Akupotomologi mener at etiologien og patogenesen til KOA er "mekanisk ubalanse". Når de mekaniske egenskapene til det myke vevet rundt kneet endres unormalt, mister kneleddet sin mekaniske balanse, og det unormale mekaniske stressmiljøet i leddet akselererer degenerasjon, noe som forårsaker inflammatorisk stimulering for ytterligere å forverre bløtvevsadhesjonene, kontrakturene og ytterligere nedgang i leddstabiliteten. Denne onde sirkelen utvikler seg etter hvert til KOA. Ved å løsne bløtvevsadhesjoner og kontrakturer, samt redusere stresskonsentrasjonen i muskler og sener, forbedrer akubotomi sammen med teorien om "Modulating Muscles and Tendons to Treat Bone Disorders" bløtvevsmekanikken og "modulerer muskler og sener", som balanserer den mekaniske belastningen i leddet, effektivt lindrer bruskdegenerasjon og "behandler beinforstyrrelser"10. Når det gjelder valg av dyremodeller, basert på formålet med denne studien, utarbeidet vi KOA-modellen ved den modifiserte Videman-metoden for immobilisering av venstre baklemmer.
Dette papiret beskriver etableringen av KOA-modellen ved hjelp av den modifiserte Videman-metoden for immobilisering av venstre bakre lemmer, og metoden for drift og forholdsregler for akupotomi. Vi demonstrerer effektiviteten av akupantomi ved å teste de mekaniske egenskapene til quadriceps femoris og sene og oppdage endringer i leddbruskstress og morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av Animal Ethics Committee ved Beijing University of Chinese Medicine (nr. BUCM-4-2022010101-1097). I denne protokollen ble 24 6 uker gamle mannlige New Zealand-kaniner plassert under en spesifikk tilstand, nemlig 20-25 ° C, 50-60% fuktighet og en 12 t lys / 12 t mørk sirkadisk syklus, med fri tilgang til en vanlig chow diett. Kaninene ble bedøvet og ofret ved å kombinere dypbedøvelse og luftembolisering. Smerte er en av de typiske patologiske egenskapene til KOA og er også en av nøkkelindikatorene som brukes til å evaluere dyremodeller av KOA og intervensjonsmetoder, slik at smertestillende midler ikke brukes under modellforberedelse.
1. KOA-kaninmodellen
- Bedøve kaniner med 3% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) intravenøst ved ørekanten. For å bekrefte riktig nivå av anestesi, se etter en betydelig svekket eller fraværende hornhinnerefleks og fraværet av smerte ved klemming av huden med hemostatisk tang. Under anestesi, tilsett 2-3 dråper smøremiddel til kaninens øyne hvert 15. minutt for å forhindre at kaninens øyne tørker ut.
- Etter anestesi, fest hver kanin i den bakre posisjonen, og trekk venstre bakben i en helt forlenget stilling.
- Fest venstre bakre lem av hver kanin i forlenget stilling.
- Som det første laget, bruk medisinsk tape for å dekke kaninens hud fra lysken til ankelleddet.
- Som det andre laget, pakk 36 mm bredt, dobbeltsidig skumbånd over det medisinske båndet og pakk deretter en polymerbandasje fra lysken til ankelleddet. Sørg for at kneleddet er 180° rett og ankelleddet er dorsiflexed med 60°.
- Som det tredje laget, immobiliser leddene med små skinner på forsiden og baksiden av kne- og ankelleddene, og vikle stålnett rundt det ytterste laget for å beskytte mot bitt. Utsett kaninens tær for å observere om blodsirkulasjonen er normal.
- Immobiliser dyrene i 6 uker for å etablere KOA-modellen (figur 1).
MERK: 1) Under modellforberedelse, inspiser formene annenhver dag. Hvis noen muggsopp er løs eller løsrevet, bedøve kaninene og immobiliser venstre bakre lemmer i en utvidet stilling. 2) Legg beskyttelsesmatter på bunnen av burene for å forhindre at kaninens lemmer setter seg fast og forårsaker skade.
2. Akupantomi intervensjon
MERK: Før starten av akupantomiintervensjon, bedøv kaninene med 3% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) ved intravenøs injeksjon med øremargin.
- Bestem behandlingspunktene.
- Barber av pelsen på kneleddet på kaninens venstre bakre lem.
- Palpere kanin kneleddet mediale femorale muskel sene innsetting, rectus femoral sene innsetting, biceps femoris sene innsetting, og gåsefot bursa. Merk patologiske indurations av lokale muskler med en steril hudmarkør. Desinfiser kneleddet tre ganger med vekslende runder med medisinsk iodophor og 75% medisinsk alkohol.
- Drift av akuplastomi
- Hold akupantomibladet parallelt med kjøreretningen parallelt med senen og lemmens lengdeakse.
- Bruk tommelen på venstre hånd til å trykke ned på huden som kommer inn i markørpunktet og beveg deg sideveis slik at blodkar og nerver skilles på den ventrale siden av tommelen.
- Med akupantomihåndtaket i høyre hånd, trykk raskt ned med en liten kraft slik at akupantomibladet umiddelbart passerer gjennom huden. Sakte fremme akupantomi bladet til den lokale muskel indurations og gjøre langsgående kutt og svinger lateralt.
- Etter at akupantomioperasjonen er fullført, desinfiser kneleddet igjen og påfør et båndhjelp.
- Utfør denne operasjonen én gang i uken i 4 uker (figur 2).
MERK: 1) Hvis det ikke er indurasjon eller ledningslignende vev berørt ved seneinnsetting av vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris eller anserine bursa, bør akubotominålen brukes til å frigjøre seninnsettingene direkte. 2) Under akupantomiintervensjon, ikke immobiliser venstre bakre lemmer av kaniner i akupantomigruppen og modellgruppen i forlengelsesposisjon.
3. Elastisk modul av quadriceps femoris
MERK: 1) Dette eksperimentet brukte sanntids skjærbølgeelastografi (SWE) ultralyddiagnostisk instrument for å måle den elastiske modulen av quadriceps femoris in vivo i hver gruppe kaniner. 2) Testeren bør være en erfaren sonographer i ultralyd deteksjon. Ved måling bør ultralydsonden plasseres forsiktig på quadriceps hudoverflate for å unngå lokal muskelspenning. Målinger må tas når dyret er i rolig tilstand, uten kamp eller aktivitet. Hvis dyret er aktivt, vent til det er rolig før du utfører testen.
- Barber pelsen for å eksponere huden i quadriceps-regionen på venstre baklem.
- Bruk konvensjonell todimensjonal ultralyd for å lokalisere quadriceps musculo-abdomen og bestemme interesseområdet (ROI), satt til en dybde på 1-2 cm.
- Start SWE-modus for inspeksjon.
- Sett interesseområdet jevnt til et sirkulært område med en diameter på 2 mm og interesseområdet til ~ 0,5-1 cm dypt fra overflaten av huden.
- Bruk ultralyddiagnostisk instrument for å generere en akustisk strålingskraftimpuls for å stimulere muskelvevet og oppnå vevselastografi.
- Vent i 2-3 s for at bildet skal stabilisere seg og fryse deretter bildet. Aktiver Q-BOX-funksjonen til instrumentet for å måle Youngs modul av quadriceps-muskelen.
- Vent til systemet automatisk beregner maksimums-, minimums- og gjennomsnittsverdiene (enhet: KPa) for Youngs modul for avkastningen. Velg tre avkastninger på samme dybde for tre målinger og ta gjennomsnittsverdien for statistisk analyse.
MERK: Testeren skal være en erfaren sonograf i ultralyddeteksjon. Ved måling bør ultralydsonden plasseres forsiktig på quadriceps hudoverflate for å unngå lokal muskelspenning. Målinger må tas når dyret er i rolig tilstand, uten kamp eller aktivitet. Hvis dyret er aktivt, vent til det er rolig før du utfører testen.
4. Måling av sammentrekningskraften til quadriceps femoris
MERK: Etter måling av sammentrekningskraften til quadriceps femoris, ble kaninene avlivet av luftemboli under anestesi.
- Bedøv kaninene med 3 % pentobarbitalnatrium (30 mg/kg) intravenøst ved ørekanten. For å bekrefte at riktig nivå av anestesi er nådd, se etter en betydelig svekket eller fraværende hornhinnerefleks og fraværet av smerte ved klemming av huden med hemostatisk tang. Under anestesi, tilsett 2-3 dråper smøremiddel til kaninens øyne hvert 15. minutt for å forhindre at kaninens øyne tørker ut.
- Utsett quadriceps-musklene og fest spenningstransduseren.
- Klipp huden under patellaen, langs langsgående akse av lemmen oppover til lårets underside, og fortsett å kutte huden oppover med 3-4 cm. Fjern forsiktig huden og fasciaen, og utsett muskelen. Klipp patellarligamentet og skill forsiktig quadriceps fra iliac-krysset, og hold quadriceps i forbindelse med iliacium.
- Ligat de kirurgiske suturene ved seneovergangen mellom patella og quadricepsmuskelen. Strekk muskelen til sin fulle lengde i sin naturlige tilstand og fest den deretter til spenningstransduseren. Hold ligeringslinjen på muskelen i en rett linje med ligeringslinjen på krafttransduseren.
- Fest strekktransduseren til braketten. Koble signalinnsamlingslinjen på spenningstransduseren til prosessoren for biosignalinnsamlingssystemet.
- Mål kontraktil ytelse av quadriceps muskelen.
- Sett elektrodene parallelt med quadriceps abdomen og unngå kontakt mellom elektrodene.
- Trykk på oscilloskopknappen. Juster posisjonen til krafttransduseren på braketten for å opprettholde grunnlinjen ved null. Velg stimuleringsparametrene til stimulatoren med en bølgebredde på 5 ms og en forsinkelse på 10 ms.
- Bruk en enkelt stimulus først og juster gradvis stimulusintensiteten fra null med en økning på 0,1 V hver gang. Vær oppmerksom på endringene i muskelkontraksjonskurven og sammentrekningsamplituden til maksimal enkelt sammentrekningsamplitude (Pt) av quadriceps er bestemt. Registrer det for påfølgende statistikk.
- Bruk en klyngestimulus, og bruk stimulusamplituden som induserer maksimal enkelt sammentrekningsamplitude som grunnlinje for kontinuerlig å stimulere muskelen og gradvis øke stimulusfrekvensen. Vær oppmerksom på endringene i muskelkontraksjonskurven til den maksimale sammentrekningsamplituden (Pt) til quadriceps er bestemt. Registrer det for påfølgende statistikk.
MERK: 1) Etter hver muskelkontraksjon skal muskelen gis 30 s for å slappe av med muskelbufferløsningen dryppet kontinuerlig på muskelen. 2) Under operasjonen, bedøm anestesistatusen ved å overvåke kaninens øyelokkrefleks, respirasjonsrytme, muskelavslapping og hudklemrespons.
5. Den mekaniske ytelsen til quadriceps-senen
- Forbehandling: På testdagen måler du lengden, bredden og tykkelsen på quadriceps-senen med en vernier-tykkelse, og installerer en spesiell antiskli klemme i utmattelsestestmaskinen. Gjenta lasting og lossing 15x for forbehandling.
- Stressavslapningstest: Bruk sensoren fra 0 N til 100 N, strekk den med en hastighet på 5 mm / min til den når ønsket lengde, og begynn deretter å samle inn data. Sett datamaskinens datainnsamlingstid fra t (0), samle inn data hver 0,1 s, som varer i 1,800 s. Etter å ha nådd den angitte tiden, registrer data og kurver.
- Strekkprøve: Bruk sensoren fra 0 N til 100 N og strekk den med en hastighet på 5 mm/min til maksimal belastning til prøven trekkes fra hverandre. Etter testen, beregne maksimal forskyvning, ultimate belastning og stivhet av prøven.
6. Felles kontaktflatetrykk og trykk per arealenhet av brusken
- Fest lårbens- og tibiaprøvene på begge sider i rett stilling på armaturen og utfør en forspenningstest. Mål det omtrentlige området for kneleddet, kutt det trykkfølsomme papiret i samme form og forsegl det med plastfolie.
- Plasser det forseglede trykkfølsomme papiret mellom tibia- og lårbensleddene, og utfør en trykktest på kneleddet med et trykk på 5 mm/min og et maksimalt trykk på 50 N. Oppretthold trykket i 2 minutter til det når 50 N når det trykkfølsomme papiret er stabilt farget.
- Etter 2 minutter fjerner du det trykkfølsomme papiret, fester den fargede overflaten på et ark i A4-størrelse og tar bilder med skalaen satt til side.
- Last opp bildet til datamaskinen. Bruk den refererte programvaren for områdemåling og flersegmentmåling for uregelmessige tall. Mål trykket på innsiden og utsiden av leddene i lårbenet og tibia og registrer resultatene.
7. Safranin O/Fast Green-farging av kneleddbrusk
- Etter slutten av akupantomiintervensjonen, ta brusk-subkondrale beinkompleksvev og legg dem inn i paraffin. Skjær de forberedte vevvoksblokkene i skiver og klargjør lysbilder. Deparaffiniser de preparerte vevslysbildene med miljøavvoksingsløsning (I) og miljøavvoksingsløsning (II) i 15 minutter hver; dypp dem deretter suksessivt i xylen og vannfri etanol (1: 1), vannfri etanol (I), 95% etanol, 85% etanol og 75% etanol, 2-5 minutter hvert trinn; Og til slutt, suge dem i destillert vann i 15 min.
- Utfør farging.
- Beis lysbildene med Fast Green-løsning i 1 min. Under denne prosessen, ta lysbildene ut av løsningen og observer dem under mikroskopet til vevet er farget mørkegrønn.
- Fargeseparasjon: Skyll overflødig Fast Green-oppløsning med ultrarent vann. Bløtlegg lysbildene raskt i 1% eddiksyreoppløsning i 5 - 10 sekunder. Skyll igjen lysbildet med ultrarent vann.
- Beis lysbildene i Safranine O-løsning i 10-15 min til brusken er farget rød.
- Dehydrer og klargjør vevet, forsegl glasslysbildene og observer dem under mikroskopet.
- Bløtlegg lysbildene i 75% etanol, 85% etanol, 95% etanol og 100% etanol i 3 - 5 sekunder etter hverandre.
- Dypp lysbildene i miljøavvoksingsløsning (I) og miljøavvoksingsløsning (II) i 10 minutter suksessivt. Ta ut lysbildene og slipp det nøytrale harpiksholdige mediet på forsiden av lysbildene, unngå vevet. Plasser kanten av dekkglasset på lysbildet og legg det sakte ned for å dekke det nøytrale balsamet. Fjern luften og unngå luftbobler. Tørk av ekstra xylen og nøytral balsam, og la den stå over natten ved romtemperatur.
- Observer lysbildene under mikroskopet og ta bilder. For hver gruppe velger du seks prøver av kaninknebrusk og velger tilfeldig fire forskjellige visningsfelt for hver prøve for evaluering. Skår bruskhistologien til hver gruppe i henhold til Mankin-metoden (tabell 1).
8. Statistisk analyse
- Ekspress data som gjennomsnitt ± standardavvik (
± s). - Utføre enveis variansanalyse (ANOVA) og LSDs test for å bestemme statistisk signifikans av multiple gruppesammenligninger.
- Vurder forskjeller statistisk signifikante når P < 0,05.
± s).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentelle resultater av mekaniske egenskaper av quadriceps femoris og sene
For å evaluere effekten av akupotomologi på de mekaniske egenskapene til quadriceps femoris hos kaniner med KOA, brukte vi henholdsvis sanntids skjærbølgeelastisk ultralydavbildning og en muskelspenningstransduser. Sammenlignet med kontrollgruppen ble Youngs modul av quadriceps femoris i KOA-gruppen redusert (P < 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen var Youngs akurotomigruppemodul økt (P < 0,05, figur 3A). Med hensyn til sammentrekningsevnen til quadriceps femoris, sammenlignet med kontrollgruppen, ble enkeltkontraksjonsamplitude og tetanisk kontraksjonsamplitude av quadriceps femoris signifikant redusert i KOA-gruppen (P < 0,05, P < 0,01). Sammenlignet med KOA-gruppen var enkeltkontraksjonsamplitude og tetanisk kontraksjonsamplitude av quadriceps femoris i akupantomigruppen signifikant økt (P < 0,05, P < 0,01, figur 3B,C). Disse resultatene viser at akupantomi kan forbedre Youngs modul og muskelkontraktilitet av quadriceps femoris hos kaniner med KOA.
For å evaluere effekten av akupantomi på de mekaniske egenskapene til quadricepssenen hos kaniner med KOA, gjennomførte vi en strekktest og en stressrelaksasjonstest på quadriceps-senen. Når det gjelder strekkegenskapene til quadricepssenen, sammenlignet med kontrollgruppen, ble den endelige belastningen og maksimal forskyvning av quadricepssenen i KOA-gruppen signifikant redusert (P < 0,01, P < 0,01), mens stivheten i quadricepssenen i KOA-gruppen viste en nedadgående trend (P > 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen var endelig belastning og maksimal forskyvning av quadricepssenen i akurotomigruppen signifikant redusert (P < 0,01, P < 0,01), og stivheten i quadricepssenen i akupantomigruppen viste en oppadgående trend (P > 0,05, figur 4A-C). Når det gjelder stressrelaksasjonshastigheten, sammenlignet med kontrollgruppen, ble stressrelaksasjonshastigheten til quadricepssenen i KOA-gruppen redusert (P < 0,05). Sammenlignet med KOA-gruppen var stressrelaksasjonsraten av quadriceps-senen i akurotomigruppen økt (P < 0,05, figur 4D). Disse resultatene viser at akupantomi kan forbedre strekk- og stressavslappingsegenskapene til quadricepssenen hos kaniner med KOA.
Eksperimentelle resultater av trykk og trykk per arealenhet på bruskkontaktflaten og bruskmorfologien
Når det gjelder maksimalt trykk på bruskkontaktflaten, sammenlignet med kontrollgruppen, var det ingen signifikant forskjell i maksimalt trykk på bruskkontaktflaten i KOA-gruppen (P > 0,05), men det var en nedadgående trend. Sammenliknet med KOA-gruppen var det ingen signifikant forskjell i maksimalt trykk på bruskkontaktflaten i akurotomigruppen (P > 0,05), men det var en oppadgående trend (figur 5A). Når det gjelder trykket per arealenhet på bruskkontaktflaten, sammenlignet med kontrollgruppen, var det ingen signifikant forskjell i maksimalt trykk per arealenhet i KOA-gruppen (P > 0,05), men det var en nedadgående trend. Sammenlignet med kontrollgruppen var det ingen signifikant forskjell i maksimalt trykk per arealenhet i akurotomigruppen (P > 0,05), men det var en oppadgående trend (figur 5B). Disse resultatene viser at akupantomiintervensjonen hadde en tendens til å øke maksimalt trykk og trykk per arealenhet av bruskkontaktflaten, noe som indikerer positive effekter på bruskstressmiljøet.
For å evaluere effekten av akupantomi på bruskmorfologi brukte vi Safranin O-Fast Green-farging. I kontrollgruppen var bruskoverflaten glatt; kondrocyttene i alle lag var ordnet pent og ordnet; de overfladiske kondrocytene ble arrangert i en spindelform; de midterste og dype lagene av kondrocytter ble arrangert i et kolonnearrangement; Tidevannslinjen var klar og fullstendig; og det var ingen pannusdannelse (figur 6A). I KOA-gruppen var overflaten av brusk grov eller det var peeling defekter; antall overfladiske kondrocytter ble redusert; kondrocytthierarki og arrangement var uordnet; mellomlagskondrocytene viste tegn på dehydrering, sammentrekning og nekrose; Chondrocyte clustering ble observert; tidevannslinjer ble uskarpe eller forvrengt brudd ble sett; Gjentatte tidevannslinjer kunne sees i enkelte områder; blodkar kan ha passert gjennom tidevannslinjen inn i det ikke-forkalkede laget brusk; eller det var pannusdannelse (figur 6B). I akurotomigruppen var overflatelaget av brusk relativt glatt; strukturen av kondrocytter var normal; arrangementet av kondrocytter i alle lag var relativt pent; tidevannslinjen var klar eller av og til var det gjentatte tidevannslinjer; det var ingen pannusdannelse (figur 6C). Når det gjaldt bruskmorfologiske skår, sammenlignet med kontrollgruppen, var brusksken i KOA-gruppen signifikant økt (P < 0,01). Sammenlignet med KOA-gruppen var brusksken i akurotomigruppen signifikant redusert (P < 0,01, figur 6D). Disse resultatene viser at bruskintegriteten til kaniner med KOA ble skadet, og at akuplastomiintervensjon kunne forsinke degenerasjonen av brusk og ha en beskyttende effekt på brusk.
Figur 1: Modifisert Videman-metode for å etablere en modell for kneartrose. (A) Materialer som kreves for etablering av KOA-modellen. (B) Bruk medisinsk trykkfølsom tape for å dekke venstre baklem på kaniner. (C) Fest polymerbandasjer rundt venstre bakben på kaniner. (D,E) Bruk skinner til å immobilisere kaninens kne- og ankelledd. (F) Pakk netting for å forhindre at kaninene gnager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Akubotomiintervensjonsoperasjonsmetode. (A) Hudforberedelse ved kneleddet av kaninens venstre baklem. (B) Velg innsettingspunkter og bruk en kirurgisk hudmarkør for å markere posisjonene. (C) Bruk medisinsk jodofor til å desinfisere. (D) Trykk og separer for å unngå nerver og blodårer. (E) Pierce akuplastomi og operere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mekaniske egenskaper til quadriceps femoris. (A) Analyse av Youngs modul av quadriceps femoris; (B) analyse av enkel sammentrekningsamplitude av quadriceps femoris; (C) analyse av tetanisk kontraksjonsamplitude av quadriceps femoris. Verdier betyr ± SD. N = 6 per gruppe. Sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe: *P < 0,05 og **P < 0,01; sammenlignet med tilsvarende modellgruppe: #P < 0,05 og ##P < 0,01. Forkortelse: KOA = knet artrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mekaniske egenskaper til quadricepssenen. (A) Analyse av den ultimate belastningen av quadriceps-senen; (B) analyse av maksimal forskyvning av quadriceps-senen; (C) analyse av stivheten i quadricepssenen; (D) stressavslapping av quadriceps senen. Verdier betyr ± SD. N = 6 per gruppe. Sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe: *P < 0,05 og **P < 0,01; sammenlignet med tilsvarende modellgruppe: #P < 0,05 og ##P < 0,01. Forkortelse: KOA = knet artrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Trykk på bruskens kontaktflate. (A) Analyse av maksimalt trykk på bruskkontaktflaten; (B) analyse av trykket per arealenhet av bruskkontaktflaten. Verdier betyr ± SD. N = 6 per gruppe. Forkortelse: KOA = knet artrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Farging av brusk med Safranin O-Fast green og markin score på brusk. (A) kontrollgruppe, (B) modellgruppe, (C) akurotomigruppe, (D) analyse av markinscore for brusk. Verdier betyr ± SD. N = 6 per gruppe. Sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe: **P < 0,01; sammenlignet med tilsvarende modellgruppe: ##P < 0,01. Skalastenger = 50 μm (A-C). Forkortelse: KOA = knet artrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Jeg. Struktur | III. Farging | ||
| en. Normal | 0 | en. Normal | 0 |
| b. Uregelmessigheter på overflaten | 1 | b. Liten reduksjon | 1 |
| c. Pannus og overflateuregelmessigheter | 2 | c. Moderat reduksjon | 2 |
| d. Spalter til overgangssone | 3 | d. Alvorlig reduksjon | 3 |
| e. Spalter til radial sone | 4 | e. Ingen fargestoff notert | 4 |
| f. Spalter til forkalket sone | 5 | ||
| g. Fullstendig uorganisering | 6 | ||
| II. Celler | IV. Tidemarks integritet | ||
| en. Normal | 0 | en. Intakt | 0 |
| b. Diffus hypercellularitet | 1 | b. Krysset av blodårer | 1 |
| c. Kloning | 2 | ||
| d. Hypocellularitet | 3 | ||
Tabell 1: Modifisert Mankin-score.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En hensiktsmessig dyremodell er en av nøkkelfaktorene for å oppnå eksperimentelle mål og avklare et bestemt vitenskapelig spørsmål. Denne studien var basert på teoriene om "Zongjin kontrollerende bein og smørende ledd" og "mekanisk ubalanse" i akupotomologi, med sikte på å forklare den vitenskapelige konnotasjonen bak behandlingen av KOA ved å "modulere muskler og sener for å behandle beinforstyrrelser" i akupantomibehandling. Med andre ord forbedrer akubotomi det unormale mekaniske miljøet i brusk ved å regulere de mekaniske egenskapene til det myke vevet rundt kneet for å forsinke degenerasjonen og beskytte brusk. KOA dyremodeller er generelt klassifisert i to kategorier: spontane og induserte modeller. Spontane KOA-modeller er mindre brukt på grunn av relativt lang modelleringsvarighet og større begrensninger. Induserte KOA-modeller kan etableres ved kirurgiske tilnærminger (f.eks. modifisert Hulth-metode, meniskektomi, ruptur av fremre korsbånd, intraartikulær injeksjon og leddimmobilisering). Kirurgiske metoder, inkludert kutting av mediale kollaterale ligament, fremre korsbånd, fjerning av mediale menisk og andre strukturer, brukes til å destabilisere kneleddet, noe som vil føre til intern mekanisk ubalanse og direkte friksjon mellom leddflatene, og derved indusere KOA11. Denne typen modell er mer egnet for studier av traumatisk leddgikt. Den intraartikulære injeksjonen leverer medisin til kneleddshulen for å indusere betennelse, metabolske forstyrrelser i kondrocytter og toksiske reaksjoner av kondrocytter i felleshulen, og utvikler dermed KOA mens den har liten effekt på leddspenning12. Leddimmobilisering utvikler og forverrer leddbruskdegenerasjon ved å begrense bevegelsen av kneleddet som forårsaker atrofi av muskler og leddbånd rundt kneet, noe som resulterer i endringer i leddspenning, og etablerer dermed en KOA-modell12.
Den modifiserte Videman-metoden er en felles immobiliseringsmetode, som er mer i tråd med den patologiske prosessen med KOA forårsaket av svakhet i de menneskelige knemusklene, som sett ved bruk av atrofi av knemuskler og leddbånd ved å immobilisere kneet i en overforlenget stilling, noe som resulterer i endringer i leddspenning og bruskdegenerasjon. Sammenlignet med kirurgiske metoder som forårsaker leddinstabilitet som resulterer i KOA, er den modifiserte Videman-metoden mer i tråd med den naturlige patogenesen til KOA der seneskade er den første fasen, etterfulgt av senen og beinsykdommen; Det er derfor mer egnet for denne studien13. Siden effekten av akupantomi ved behandling av KOA i tidlig stadium eller mellomstadium er tydeligere, er støpetiden 6 uker, noe som stemmer overens med de patologiske endringene i mellomstadiet KOA. I prosessen med modellinduksjon kan langvarig overstrekksbremsing føre til misbruk av atrofi av musklene rundt kneleddet, og ubehaget i venstre bakre lem fører ofte til at kaniner gnaver modellapparater. Siden modellapparater kan være løse, er det nødvendig å regelmessig kontrollere tettheten til kanin-type enheten og forsterke dem i tide. I tillegg er det nødvendig å alltid være oppmerksom på kaninens blodtilførsel, hevelse, hudlesjoner og fordøyelseskanalsymptomer, og fjern modellapparatene om nødvendig. Siden kaninene er i anestesitilstand under denne prosessen, er det nødvendig å holde kaninene varme og ta hensyn til kaninens tilstand i sanntid til kaninene våkner.
Akupantomi innebærer en skalpellfunksjon i tillegg til den eksisterende akupunkturnålen, ved hjelp av begrepet akupunktur for å trenge inn i kroppen, med kuttende og separerende effekter som er bedre enn en akupunkturnål, samtidig som det gir langt mindre traumer til menneskekroppen enn en skalpell14. Akupotomologi mener at årsaken til KOA er den mekaniske ubalansen på grunn av bløtvevskader rundt kneleddet. Derfor er nøkkelen til å behandle KOA med akupantomi å gjenopprette den mekaniske balansen i kneleddet. Når det gjelder valg av behandlingspunkter, er akupantomi på den ene siden basert på teorien om meridianer og sener og tar smertefull lokalitet som akupunkt. På den annen side styres akuplastomi av moderne anatomi og biomekanikk og mener at bløtvevskader rundt kneleddet forårsaker vedheft og sammentrekning, noe som ødelegger den mekaniske balansen i kneleddet og produserer høye stresspunkter i leddet. Derfor blir vevsadhesjon, sammentrekning og høyspenningspunkter ofte tatt som behandlingspunkter15,16.
Den biomekaniske analysen av bløtvev viser at festepunktene i sener og bein stort sett er der bløtvevsspenninger er konsentrert, også kalt stresskonsentrasjon, og hvor patologiske produkter som sammenvoksninger, kontrakturer og snorlignende knuter lett produseres17. I tillegg har klinisk praksis vist at ømme punkter funnet ved palpasjon ofte overlapper festepunktene til sener og bein. Derfor valgte denne studien seneinnsetting av vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris og anserine bursa. Selv om akupantomi forårsaker mindre traumer i vevet, er det fortsatt en metode for invasiv intervensjon. Under intervensjonen er det nødvendig å følge fire-trinns prosedyren for akupotomi: plassering, retning, trykking-frigjøring og punktering. I tillegg må brukerne være forsiktige med graden av avslapning og behandlingsfrekvens for hvert tiltak. Det anbefales å frigjøre hvert behandlingspunkt 2-3 ganger en gang i uken for å forhindre overdreven skade på vevet. Etter at akupantomiintervensjonen er fullført, desinfiseres kneleddet på kaninens venstre bakben igjen og band-hjelpemidler påføres akubotomiinngangspunktet.
Stabile kneledd er en forutsetning for å opprettholde mekanisk balanse og utføre normale fysiologiske bevegelser18. Muskler og sener - viktige faktorer for å opprettholde kneleddstabilitet - er viskoelastiske vevstrukturer som bestemmer de forskjellige mekaniske egenskapene til muskler i sammentrekning og passiv trekk, som er viktige komponenter i musklenes mekaniske egenskaper og sikrer normal motorfunksjon av muskler. Elastisitetsmodulen, en indikator på de mekaniske egenskapene til bløtvev, er positivt korrelert med endringer i den mekaniske funksjonen til quadriceps femoris19. Fysiologisk inkluderer skjelettmuskulær sammentrekning to former: enkelt sammentrekning og tetanisk sammentrekning. Den førstnevnte er den grunnleggende enheten av muskelaktivitet, mens sistnevnte hovedsakelig produserer jevn bevegelse av skjelettmuskler. Derfor brukes maksimal amplitude av enkel og tetanisk sammentrekning ofte til å evaluere muskelkontraktil funksjon.
Disuse skjelettmuskulaturatrofi fører til redusert tetanisk sammentrekning og maksimal frivillig sammentrekning, noe som indikerer en reduksjon i muskelkontraktil evne20. Nedgangen i muskelstyrke kan skade funksjonen til sener, manifestert som en reduksjon i senenes viskoelastisitet og en reduksjon i seners evne til å motstå deformasjon8. Under patologiske forhold kan stressavslapping og strekkegenskaper av sener reduseres, noe som fører til at kneleddet mister balanse og akselererer utviklingen av KOA. Derfor, i denne studien, ble den elastiske modulen, amplitude av enkelt sammentrekning, amplitude av tetanisk sammentrekning av quadriceps, strekkegenskaper av quadriceps-senen som ultimate belastning, maksimal forskyvning, stivhet, samt stressavslapping av quadriceps-senen valgt for å evaluere effekten av akupantomi på de mekaniske egenskapene til quadriceps. Stress- og trykktesten av bruskens lagerområde og Safranin O/Fast Green-fargingen av kneleddbrusken ble brukt for å evaluere om akurotomibehandlingen bedret de mekaniske egenskapene til quadriceps femoris og utøvde en beskyttende effekt på brusk. De eksperimentelle resultatene viser at akupantomi kombinert med teorien om "modulerende muskler og sener for å behandle beinforstyrrelser" kan forbedre stressmiljøet i brusk, forsinke bruskdegenerasjon og ha en beskyttende effekt på brusk ved å modulere de mekaniske egenskapene til muskler og sener av quadriceps.
Det er visse begrensninger for dette eksperimentet. På den ene siden evaluerte vi ikke feiljustering av kneet og dets effekt på biomekaniske ubalanser i kneet. På den annen side valgte denne studien den modifiserte Videman-metoden for venstre bakbensforlengelsesimmobilisering for KOA-modellering for å belyse rollen som akupantomi i å forsinke bruskdegenerasjon ved å modulere de mekaniske egenskapene til bløtvev rundt kneet. Imidlertid har rollen som akubotomi i kneartrose forårsaket av traumatiske faktorer, som ligament og meniskrifter, ikke blitt undersøkt. I tillegg er akupantomiintervensjon en slags lukket, minimalt invasiv kirurgi. I denne studien ble både palpasjons- og akuplastomiintervensjoner utført uten å eksponere det syke vevet i ikke-direkte synsforhold. For å redusere virkningen av subjektive faktorer på de eksperimentelle resultatene, ble både palpasjon og akupantomiintervensjon utført av samme personell. Således, selv om det er visse begrensninger, påvirker de ikke påliteligheten av konklusjonene fra denne studien.
Oppsummert beskriver denne artikkelen i detalj KOA-modellinduksjonen med den modifiserte Videman-metoden (venstre hindlimb forlengelse immobilisering) og akupantomiintervensjonen. Det viser også analysen av mekanismen for akupantomibehandling for KOA gjennom eksperimenter på quadriceps' elastiske modul og kontraktile funksjon, de mekaniske egenskapene til quadricepssenen, kraften og trykket i lagerområdet til leddbrusken og Safranin O / Fast Green-fargingen av kneleddbrusk. Studier av akupantomiens mekanisme for å forbedre de biomekaniske egenskapene til bløtvev kan gi ny innsikt i behandlingen av KOA og andre sportsrelaterte systemiske skader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No.82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
- Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigolo, B.
- Cui, A. Y., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29-30, 100587 (2020).
- Miyauchi, A., et al. Alleviation of murine osteoarthritis by deletion of the focal adhesion mechanosensitive adapter, Hic-5. Sci Rep. 9 (1), 15770 (2019).
- Wright, T. Biomechanical factors in osteoarthritis: the effects of joint instability. HSS J. 8 (1), 15-17 (2012).
- Patsika, G., Kellis, E., Kofotolis, N., Salonikidis, K., Amiridis, I. G. Synergetic and antagonist muscle strength and activity in women with knee osteoarthritis. J Geriatr Phys Ther. 37 (1), 17-23 (2014).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. X.
- Henriksen, M., Christensen, R., Danneskiold-Samsøe, B., Bliddal, H. Changes in lower extremity muscle mass and muscle strength after weight loss in obese patients with knee osteoarthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 64 (2), 438-442 (2012).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55 (1), 44-51 (2013).
- Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthr Cartil. 21 (1), 10-15 (2013).
- Ma, S. N., et al. Effect of acupotomy on FAK-PI3K signaling pathways in KOA rabbit articular cartilages. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4535326 (2017).
- Yu, P., et al. Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis. China Medical Herald. 16 (27), 41-44 (2019).
- Li, L. H., et al. Research progress of rabbit knee osteoarthritis model. Journal of Jiangxi University of Chinese Medicine. 31 (4), 108-113 (2019).
- Zhang, W., Gao, Y., Guo, C. Q., Khattab, I. Z. A., Mokhtari, F. Effect of acupotomy versus electroacupuncture on ethology and morphology in a rabbit model of knee osteoarthritis. J Tradit Chin Med. 39 (2), 229-236 (2019).
- An, X. Y., et al. Chondroprotective effects of combination therapy of acupotomy and human adipose mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis rabbits via the GSK3 beta-cyclin D1-CDK4/CDK6 signaling pathway. Aging Dis. 11 (5), 1116-1132 (2020).
- Guo, C. Q., Liu, N. G. Analysis on the distribution features of Ashi points in Jingjin disorders. Journal of Basic Chinese Medicine. 17 (8), 899-900 (2011).
- Guo, C. Q., et al. Effects of acupotomy therapy on tenderness point around knee joint in patients with knee osteoarthritis: a randomized controlled clinical trial. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 33 (3), 3-5 (2010).
- Zhao, Y., Dong, F. H., Zhang, K. Analysis of soft tissues mechanical changes and treatment of meridian tendon pain. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. (9), 705-707 (2008).
- Zhang, L. P., Cheng, F., Liu, D. Y., Zhu, L. G. Application progress of biomechanics in knee osteoarthritis. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 34 (7), 1644-1647 (2016).
- Thomas, A. C., Sowers, M., Karvonen-Gutierrez, C., Palmieri-Smith, R. M. Lack of quadriceps dysfunction in women with early knee osteoarthritis. J Orthop Res. 28 (5), 595-599 (2010).
- Li, L., et al. Effects of unloaded muscle atrophy on contractile characteristics of hind-limb skeletal muscles in mice. Space Med Med Eng. 25 (5), 322-325 (2012).
