Enumerazione delle alghe tramite metodo di coltivazione
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Panoramica
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz
Le alghe sono un gruppo altamente eterogeneo di microrganismi che hanno un tratto comune, vale a dire il possesso di pigmenti fotosintetici. Nell’ambiente, le alghe possono causare problemi ai proprietari di piscine crescendo nell’acqua. Le alghe possono anche causare problemi nelle acque superficiali, come laghi e bacini idrici, a causa delle fioriture algali che rilasciano tossine. Più recentemente, le alghe vengono valutate come nuove fonti di energia attraverso i biocarburanti algali. Le alghe blu-verdi sono in realtà batteri classificati come cianobatteri. I cianobatteri non solo fotosintetizzano, ma hanno anche la capacità di fissare il gas di azoto dall’atmosfera. Altre alghe sono eucariotiche, che vanno da organismi unicellulari a organismi multicellulari complessi, come le alghe. Questi includono le alghe verdi, gli euglenoidi, i dinoflagellati, le alghe brune dorate, le diatomee, le alghe brune e le alghe rosse. Nei suoli, le popolazioni algali sono spesso 106 per grammo. Questi numeri sono inferiori ai numeri corrispondenti per batteri, actinomiceti e funghi, soprattutto perché la luce solare richiesta per la fotosintesi non può penetrare molto al di sotto della superficie del suolo.
Poiché le alghe sono fototrofiche, ottenendo energia dalla fotosintesi e carbonio per la biomassa dall’anidride carbonica, possono essere coltivate in mezzi di crescita costituiti interamente da nutrienti inorganici e senza un substrato di carbonio organico. La mancanza di substrato organico preclude la crescita di batteri eterotrofi. Utilizzando un mezzo di crescita inorganico, le alghe originariamente presenti nel suolo o nell’acqua possono essere quantificate con il metodo del numero più probabile (MPN). Il metodo MPN si basa sulla successiva diluizione di un campione, in modo tale che le alghe stesse siano diluite fino all’estinzione. La presenza di alghe in qualsiasi diluizione è determinata da un segno positivo di crescita nel mezzo, che è tipicamente una melma verde di alghe che deriva dalla fotosintesi. L’uso di tubi replicati ad ogni diluizione e una valutazione statistica del numero di tubi positivi per la crescita in una data diluizione consente di calcolare il numero di alghe presenti nel campione originale. Le tabelle MPN sono state sviluppate e pubblicate specifiche per un particolare progetto MPN, incluso il numero di repliche utilizzate ad ogni diluizione.
Procedura
- Pesare un campione di 10 g di terreno che è stato raccolto umido dal campo o che ha aggiunto acqua in modo che rimanga umido per 2-3 giorni. Si noti che il terreno dovrebbe essere umido ma non saturo.
- Preparare una serie di diluizione 10 volte aggiungendo i 10 g di terreno in 95 ml di soluzione di Bristol modificata (Figura 1). Per creare la soluzione di Bristol modificata, sciogliere quanto segue in 1.000 ml di acqua: 0,25 g NaNO3, 0,025 g CaCl2, 0,075 g MgSO–4 · 7H2O, 0,075 g K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl e 0,5 mg FeCl3.
- Continua la serie di diluizioni con l’aggiunta di 1 mL di Sospensione A a 9 mL della Soluzione bristol e ulteriori diluizioni sequenziali.
- Inoculare 5 tubi replicati contenenti ciascuno 9 mL di Soluzione di Bristol Modificata con 1 mL ciascuna delle diluizioni da 10-2 a 10-6 (Tabella 1).
- Incubare i tubi tappati per un massimo di 4 settimane in un’area esposta alla luce solare.
- Osservare i tubi per la crescita algale una volta ogni 7 giorni. I tubi con crescita algale appaiono verdi.
Figura 1. Come realizzare una serie di diluizione 10 volte.
| Tubo | Diluizione |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
Tabella 1. Tubi e diluizioni.
Le alghe sono organismi fotosintetici che vivono in una varietà di ambienti. Le alghe che vivono nel suolo possono essere coltivate in laboratorio e la loro concentrazione enumerata utilizzando semplici calcoli.
Le alghe sono un gruppo altamente eterogeneo di organismi che hanno un tratto comune, vale a dire il possesso di pigmenti fotosintetici, comunemente clorofilla. La stragrande maggioranza delle alghe sono microscopiche, tuttavia, la definizione esatta del gruppo è controversa e include anche le alghe, che sono tipicamente macroscopiche.
Nell’ambiente, le alghe possono causare problemi nelle acque superficiali come laghi o bacini idrici, formando fioriture algali che esauriscono i nutrienti dell’acqua, bloccando la luce che passa oltre la superficie dell’acqua e rilasciando tossine. La capacità di enumerare le alghe nei campioni consente agli scienziati di valutare la salute di un ecosistema e il potenziale rischio di crescita eccessiva delle alghe.
Le popolazioni algali nei suoli si verificano frequentemente a circa diecimila cellule per grammo. Questi numeri sono in genere inferiori alle corrispondenti concentrazioni di batteri, funghi o actinomiceti, poiché le alghe richiedono la luce solare per la fotosintesi, che non può penetrare molto al di sotto della superficie del suolo.
Questo video illustrerà come colturare le alghe dal suolo in laboratorio e come enumerare la concentrazione di alghe nel campione di terreno di partenza.
Le alghe hanno effetti benefici sugli ecosistemi. Le alghe blu-verdi, o cianobatteri, hanno la capacità di fissare il gas azoto dall’atmosfera, rendendole utili per aumentare l’azoto del suolo in ambienti semi-aridi e anche come potenziale strumento per la produzione di biocarburanti.
Altre alghe sono eucariotiche e vanno da organismi unicellulari a complessi organismi multicellulari, come le alghe. Questi includono alghe verdi, euglenoidi, dinoflagellati e diatomee, alghe brune e alghe rosse.
Le alghe sono fototrofiche, ottenendo energia dalla fotosintesi e carbonio per la biomassa dall’anidride carbonica. Di conseguenza, possono essere coltivati in mezzi costituiti interamente da nutrienti inorganici, senza un substrato di carbonio organico aggiunto. Questa mancanza di substrato organico impedisce la crescita di batteri eterotrofi, che dipendono dal carbonio organico esterno per la crescita.
Per la coltura delle alghe per l’enumerazione, i campioni di terreno vengono diluiti in serie dieci volte a 10-6 g di terreno per ml e coltivati in terreni di crescita. Per ogni diluizione vengono effettuate diverse repliche. Vengono quindi incubati in un’area ben illuminata per un massimo di 4 settimane per consentire la crescita delle algali.
La presenza di alghe in qualsiasi diluizione è determinata da un segno positivo di crescita nel mezzo, che apparirà tipicamente come una melma verde. Infine, vengono consultate tabelle MPN sviluppate empiricamente progettate per la crescita algale, consentendo all’utente di determinare la concentrazione algale originale in base alla crescita delle repliche di diluizione. Il metodo MPN si basa sulla diluizione seriale dei campioni in modo tale che le alghe siano diluite fino all’estinzione, il che significa che a una certa diluizione, non ne consegue alcuna crescita algale.
Ora che abbiamo familiarità con i concetti alla base della coltivazione e dell’enumerazione delle alghe dai campioni, diamo un’occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.
Per iniziare l’esperimento, prima pesare 10 grammi di terreno umido che è stato raccolto umido dal campo o è stato reidratato e rimasto umido per 2 o 3 giorni. Il terreno dovrebbe ma non saturo.
Quindi, preparare una serie di diluizione dieci volte aggiungendo prima i 10 grammi di terreno a 95 ml di soluzione di Bristol modificata, o MBS. Etichettare questo come sospensione A.
Dopo aver agitato vigorosamente, continuare la serie di diluizione aggiungendo 1 mL di sospensione A a 9 mL di MBS in una provetta. Continua questa serie di diluizione dieci volte altre 4 volte per dare diluizioni fino a 10-6 g per ml.
Successivamente, inoculare 5 tubi replicati, ciascuno contenente 9 mL di MBS con 1 mL di ciascuna delle diluizioni da 10-1 a 10-5. Ciò si traduce in 5 tubi di replica per ogni diluizione da 10-2 a 10-6. Tappare i tubi liberamente.
Infine, incubare i tubi per ben 4 settimane in un’area esposta alla luce solare. Osservare i tubi per la crescita algale una volta ogni 7 giorni. I tubi che mostrano la crescita delle algali appariranno verdi.
L’analisi del numero più probabile, o MPN, è un metodo matematico comunemente usato per enumerare i microrganismi cresciuti dalla diluizione di un substrato iniziale concentrato. Tenendo conto dei fattori di diluizione delle soluzioni e del numero di tubi che mostrano segni positivi di crescita ad ogni diluizione, il numero più probabile di organismi per grammo di campione di terreno originale può essere calcolato utilizzando una tabella MPN e una formula semplice.
Per calcolare MPN, alla più alta diluizione con il maggior numero di tubi a replica positiva viene assegnata l’etichetta di p1, in questo caso, le repliche del tubo C. Al contrario, alcuni dei tubi di D & E sono negativi senza segni di crescita algale.
Il numero di tubi nelle due diluizioni successive che mostrano una crescita positiva sono etichettati come p2 e p3. Qui, p2 = D e p3 = E.
Il valore per p1 può essere trovato guardando verso il basso la prima colonna nella tabella MPN. Lo stesso dovrebbe essere fatto con la colonna p2. Infine, il valore di p3,attraverso la parte superiore, viene utilizzato per intersecare i due definiti da p1 e p2, per dare un valore del numero più probabile di organismi per mL.
Successivamente, per calcolare la concentrazione di organismi per grammo nel campione di terreno originale, questo valore è diviso per la concentrazione di terreno nella diluizione a cui è stato assegnato p2. La seguente equazione viene utilizzata per definire il numero effettivo di organismi per grammo di suolo.
L’enumerazione delle algali e l’analisi MPN hanno una vasta gamma di applicazioni, alcune delle quali sono esplorate qui.
Questo metodo di coltivazione dell’enumerazione delle algali può essere utilizzato in una varietà di impostazioni. Può essere applicato a fiumi o laghi per determinare i livelli di alghe e valutare i rischi di fioriture algali dannose. In alternativa, può essere utilizzato per valutare la pulizia e la sicurezza delle acque più direttamente utilizzate dagli esseri umani, tra cui piscine, fontane d’acqua o altre fonti di acqua potabile. Idealmente, nei campioni di acqua potabile e nelle piscine, non sono presenti alghe.
L’analisi MPN per l’enumerazione può essere applicata anche ad altri microrganismi non algali. Ad esempio, la qualità dell’acqua può essere valutata utilizzando organismi indicatori come coliformi o E. coli. Qui, i campioni possono essere coltivati con mezzi contenenti sostanze chimiche che vengono alterate per produrre colore o fluorescenza in presenza degli organismi indicatori. Eseguendo più piccole repliche di questo esperimento in singole cellule, con campioni diluiti a una concentrazione nota, il rapporto tra cellule positive può essere riferito a una tabella MPN per l’organismo indicatore specifico e la concentrazione iniziale nei campioni determinata.
Le alghe possono anche essere coltivate per applicazioni commerciali. Ad esempio, alcuni tipi di biofertilizzanti utilizzano alghe blu-verdi, che possono agire come simbionti con le piante, aiutando il loro fissaggio e l’utilizzo di azoto, che è particolarmente utile per aiutare la crescita delle colture in aree con terreno povero. Allo stesso modo, le alghe possono essere coltivate per biocarburanti o come fonte di cibo ricco di nutrienti per il bestiame.
Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla cultura e all’enumerazione delle algali. Ora dovresti capire come diluire i campioni di terreno per la crescita delle alghe, come colturare le alghe in laboratorio e come enumerare la concentrazione algale dei tuoi campioni di partenza. Grazie per l’attenzione!
Risultati
La Figura 2 è un esempio di risultati rappresentativi.
p1 è scelto per essere il numero di tubi replicati della più alta diluizione (meno concentrati nel terreno) che ha il maggior numero di tubi positivi. Qui, le repliche del tubo B non contano, perché quelle del tubo C provengono da una diluizione più elevata. Al contrario, il numero di tubi del tubo D che mostrano un segno positivo di crescita è inferiore a quelli del tubo C. Quindi, p1 = 5.
p2 e p3 sono scelti per essere il numero di tubi nelle prossime due diluizioni più elevate che mostrano un segno positivo di crescita. Quindi, p2 = 3 e p3 = 1.
Il valore per p1 può essere trovato guardando verso il basso la prima colonna nella Tabella 2. Lo stesso viene fatto nella colonna p2. Quindi, il valore di p3 (attraverso la parte superiore) interseca i due definiti dai valori di p1 e p2. In questo esempio, il valore è 1,1 organismi per ml.
Dividete questo valore per la concentrazione di terreno nella diluizione a cui avete assegnato p2. In questo esempio, questo è tube D.
Quindi, in questo esempio, c’erano 1,1 x 104 cellule di alghe per g di terreno. Questo valore è abbastanza tipico del numero di alghe presenti nel suolo.
Figura 2. Risultato ipotetico di un esperimento di enumerazione delle alghe. I tubi ombreggiati indicano la presenza di alghe. I tubi non ombreggiati rappresentano l’assenza di alghe.
| Numero più probabile per i valori indicati di p3 | |||||||
| p1 | p2 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0 0 0 0 0 0 |
0 1 2 3 4 5 |
— 0.018 0.037 0.056 0.075 0.094 |
0.018 0.036 0.055 0.074 0.094 0.11 |
0.036 0.055 0.074 0.093 0.11 0.13 |
0.054 0.073 0.092 0.11 0.13 0.15 |
0.072 0.091 0.11 0.13 0.15 0.17 |
0.090 0.11 0.13 0.15 0.17 0.19 |
| 1 1 1 1 1 1 |
0 1 2 3 4 5 |
0.020 0.040 0.061 0.083 0.11 0.13 |
0.040 0.061 0.082 0.1 0.13 0.16 |
0.060 0.081 0.10 0.13 0.15 0.17 |
0.080 0.10 0.12 0.15 0.17 0.19 |
0.10 0.12 0.15 0.17 0.19 0.22 |
0.12 0.14 0.17 0.19 0.22 0.24 |
| 2 2 2 2 2 2 |
0 1 2 3 4 5 |
0.045 0.068 0.093 0.12 0.15 0.17 |
0.068 0.092 0.12 0.14 0.17 0.20 |
0.091 0.12 0.14 0.17 0.20 0.23 |
0.12 0.14 0.17 0.20 0.23 0.26 |
0.14 0.17 0.19 0.22 0.25 0.29 |
0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.32 |
| 3 3 3 3 3 3 |
0 1 2 3 4 5 |
0.078 0.11 0.14 0.17 0.21 0.25 |
0.11 0.14 0.17 0.21 0.24 0.29 |
0.13 0.17 0.20 0.24 0.28 0.32 |
0.16 0.20 0.24 0.28 0.32 0.37 |
0.20 0.23 0.27 0.31 0.36 0.41 |
0.23 0.27 0.31 0.35 0.40 0.45 |
| 4 4 4 4 4 4 |
0 1 2 3 4 5 |
0.13 0.17 0.22 0.34 0.41 |
0.17 0.21 0.26 0.33 0.40 0.48 |
0.21 0.26 0.32 0.39 0.47 0.56 |
0.25 0.31 0.38 0.45 0.54 0.64 |
0.30 0.36 0.44 0.52 0.62 0.72 |
0.36 0.42 0.5 0.59 0.69 0.81 |
| 5 5 5 5 5 5 |
0 1 2 3 4 5 |
0.23 0.33 0.49 0.79 1.3 2.4 |
0.31 0.46 0.7 1.1 1.7 3.5 |
0.43 0.64 0.95 1.4 2.2 5.4 |
0.58 0.84 1.2 1.8 2.8 9.2 |
0.76 1.1 1.5 2.1 3.5 16 |
0.95 1.3 1.8 2.5 4.3 — |
Tabella 2. Numeri più probabili da utilizzare con il disegno sperimentale in questo esercizio.
Applications and Summary
La metodologia MPN è utile, perché consente la stima di una popolazione funzionale basata su un’attribuzione correlata al processo. Nell’esempio, il processo funzionale era la fotosintesi intrapresa dalle alghe, che consentiva la crescita in assenza di carbonio organico. Ciò ha permesso di enumerare le popolazioni algali totali nel suolo.
MPN viene anche utilizzato per stimare il numero di un particolare tipo di agenti patogeni microbici nell’acqua, come la Salmonella, utilizzando la resistenza della Salmonella al verde malachite.
Un’ulteriore applicazione è la stima dei funghi micorrizici inoculando le diluizioni del suolo su un ospite vegetale e cercando la colonizzazione delle radici da parte dei funghi.
Trascrizione
Algae are photosynthetic organisms that live in a variety of environments. Soil dwelling algae can be cultured in the laboratory, and their concentration enumerated using simple calculations.
Algae are a highly heterogeneous group of organisms that have one common trait, namely the possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. The vast majority of algae are microscopic, however, the exact definition of the group is controversial, and also includes seaweeds, which are typically macroscopic.
In the environment, algae can cause problems in surface waters such as lakes or reservoirs, forming algal blooms that deplete the water nutrients, blocking light passing beyond the water surface, and releasing toxins. The ability to enumerate algae in samples allows scientists to evaluate the health of an ecosystem, and the potential risk of algal overgrowth.
Algal populations in soils frequently occur at around ten thousand cells per gram. These numbers are typically lower than corresponding concentrations of bacteria, fungi, or actinomycetes, as algae require sunlight for photosynthesis, which cannot penetrate far below the soil surface.
This video will illustrate how to culture algae from soil in the laboratory, and how to enumerate the concentration of algae in the starting soil sample.
Algae have beneficial effects on ecosystems. Blue-green algae, or cyanobacteria, have the ability to fix nitrogen gas from the atmosphere, making them useful in increasing soil nitrogen in semi-arid environments and also as a potential tool for biofuel production.
Other algae are eukaryotic, and range from single-celled to complex multicellular organisms, like seaweeds. These include green algae, euglenoids, dinoflagellates and diatoms, brown algae, and red algae.
Algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon for biomass from carbon dioxide. As a result, they can be grown in media consisting entirely of inorganic nutrients, without an added organic carbon substrate. This lack of organic substrate prevents the growth of heterotrophic bacteria, which are dependent on external organic carbon for growth.
To culture algae for enumeration, soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL, and cultured in growth media. Several replicates are made for each dilution. They are then incubated in a well-lit area for up to 4 weeks to allow algal growth.
The presence of algae in any dilution is determined by a positive sign of growth in the medium, which will typically appear as a green slime. Finally, empirically developed MPN tables designed for algal growth are consulted, enabling the user to determine the original algal concentration based on growth in dilution replicates. The MPN method relies on the serial dilution of samples such that the algae are diluted to extinction, meaning that at some dilution, no algal growth ensues.
Now that we are familiar with the concepts behind growing and enumerating algae from samples, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.
To begin the experiment, first weight out 10 grams of moist soil that has either been collected moist from the field, or been rehydrated and remained moist for 2 to 3 days. The soil should but not saturated.
Next, prepare a ten-fold dilution series by adding the 10 grams of soil first to 95 mL of Modified Bristol’s solution, or MBS. Label this as suspension A.
After shaking vigorously, continue the dilution series by adding 1 mL of suspension A to 9 mL of MBS in a test tube. Continue this ten-fold dilution series another 4 times to give dilutions up to 10-6 g per mL.
Next, inoculate 5 replicate tubes, each containing 9 mL of MBS with 1 mL of each of the dilutions 10-1 to 10-5. This results in 5 replicates tubes for each dilution from 10-2 to 10-6. Cap the tubes loosely.
Finally, incubate the tubes for a full 4 weeks in an area exposed to sunlight. Observe the tubes for algal growth once every 7 days. Tubes exhibiting algal growth will appear green.
Most Probable Number, or MPN, analysis is a commonly used mathematical method to enumerate microorganisms grown from dilution of a concentrated initial substrate. By taking into account the dilution factors of the solutions, and the number of tubes which show positive signs of growth at each dilution, the most probable number of organisms per gram of original soil sample can be calculated using an MPN table and simple formula.
To calculate MPN, the highest dilution with the highest number of positive replicate tubes is assigned the label of p1, in this case, the replicates of tube C. In contrast, some of the tubes from D & E are negative with no signs of algal growth.
The number of tubes in the next two higher dilutions that show positive growth are labeled as p2 and p3. Here, p2 = D and p3 = E.
The value for p1 can be found by looking down the first column in the MPN table. The same should be done with the p2 column. Finally, the value of p3, across the top, is used to intersect the two defined by p1 and p2, to give a value of the most probable number of organisms per mL.
Next, to calculate the concentration of organisms per gram in the original soil sample, this value is divided by the concentration of soil in the dilution to which p2 was assigned. The following equation is used to define the actual number of organisms per gram of soil.
Algal enumeration and MPN analysis have a wide range of applications, some of which are explored here.
This culturing method of algal enumeration can be used in a variety of settings. It can be applied to rivers or lakes to determine algal levels, and assess the risks of harmful algal blooms. Alternatively, it can be used to assess the cleanliness and safety of waters more directly used by humans, including swimming pools, water fountains, or other drinking water sources. Ideally, in potable water samples and swimming pools, there are no algae present.
The MPN analysis for enumeration can also be applied to other non-algal microorganisms. For example, water quality can be assessed using indicator organisms such as coliforms or E. coli. Here, samples can be cultured with media containing chemicals that are altered to produce color or fluorescence in the presence of the indicator organisms. By performing multiple small replicates of this experiment in individual cells, with samples diluted to a known concentration, the ratio of positive cells can be referenced to an MPN table for the specific indicator organism, and the starting concentration in the samples determined.
Algae may also be cultured for commercial applications. For example, some types of biofertilizer utilize blue-green algae, which can act as symbionts with plants, aiding their fixture and take-up of nitrogen, which is particularly useful in aiding crop growth in areas with poor soil. Similarly, algae can be grown for biofuels, or as a source of nutrient rich food for livestock.
You’ve just watched JoVE’s introduction to algal culture and enumeration. You should now understand how to dilute soil samples for algal growth, how to culture algae in the laboratory, and how to enumerate the algal concentration of your starting samples. Thanks for watching!