3.2: Standard interni

1. Corretta gestione del campione: creazione di una soluzione

1. Prendi un becher pulito e ammassa la quantità corretta di campione in esso. Registrare la massa effettiva utilizzata. In questo esempio, una soluzione di adenina viene realizzata in un pallone volumetrico per l'uso come standard interno per l'analisi successiva. La massa di adenina è di 100 mg. Non ammassare direttamente in un matraccio volumetrico perché ha un collo lungo e l'adenina non può essere facilmente aggiunta o rimossa.
2. Aggiungere circa 25 ml di solvente (in questo caso dimetilsolfossido (DMSO)) al becher e lasciarlo mescolare per sciogliersi. In questo esempio, la soluzione finale è fatta in un matraccio volumetrico da 50 ml, quindi aggiungi solo circa 25 ml in modo che il becher possa essere risciacquato e la soluzione fatta fino al volume finale.
3. Una volta che il solido si è sciolto, versare la soluzione nel matraccio volumetrico.
4. Risciacquare il becher e la barra di agitazione con piccole quantità di solvente, circa 10 ml, e versare il risciacquo nel matraccio volumetrico. Ripeti altre due volte. Ciò consente di garantire il corretto trasferimento della soluzione.

2. Preparazione di una curva di calibrazione standard interna

1. Preparare i campioni standard desiderati per l'analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando acetonitrile e quindi l'adenina viene utilizzata come standard interno per la misurazione.
2. Per i campioni di caffeina, pesare la quantità di campione necessaria per fare 1 mg / mL di campione. Se si utilizza un matraccio volumetrico da 10 ml, ovvero 10 mg.
3. Pesare l'analita in un becher, aggiungere qualche mL di solvente (qui metanolo) per sciogliere, quindi trasferire quantitativamente al matraccio volumetrico usando 3 risciacqui.
4. Fai altri 3 standard in modo simile con 0,2, 0,5 e 2 mg / ml di caffeina.
5. Mettere 1 mL di ogni standard di caffeina in un flaconcino campione.
6. Aggiungere 0,2 mL di 2 mg/mL di standard interno di adenina a ciascun flaconcino campione.
7. Esegui l'esperimento di gascromatografia con ogni standard di caffeina. Per ogni cromatogramma, calcolare il rapporto tra le aree di picco per la caffeina rispetto allo standard.
8. Crea un grafico del rapporto area rispetto al rapporto di concentrazione. La pendenza di quel grafico è il fattore di risposta.

3. Preparazione di un campione reale con standard interno per gascromatografia

1. Preparare il campione desiderato per l'analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando l'acetrontrile.
2. Per il campione di caffè, ammassare 2 g di caffè in un becher da 100 ml. Registrare il peso esatto del caffè.
3. Aggiungere 20 ml di acetonitrile al becher.
4. Lasciare riposare per 20 minuti, mescolando frequentemente.
5. Filtrare i fondi di caffè usando una carta da filtro in un imbuto.
6. Risciacquare la carta da filtro 3x con piccole quantità di acetonitrile (5 ml).
7. Misurare il volume finale del filtrato. Dovrebbe essere di circa 35 ml.

4. Eseguire il campione e calcolare la concentrazione

1. Prendere 1 mL del campione di estratto di caffè e aggiungere 0,2 mL dello standard interno in un flaconcino. Posizionare il flaconcino nel rack del campionatore automatico.
2. Eseguire un'analisi GC del campione. Assicurarsi che le condizioni GC siano tali che la caffeina e l'adenina si sepatrino. In questo esempio, le separazioni isotermiche vengono eseguite a 200 °C.
3. Dopo l'analisi, calcolare l'area di picco sia per il picco standard interno che per il picco analita. Usando i loro rapporti, calcola la quantità di caffeina nel campione.

5. Risultati: Analisi GC della caffeina con standard interno

1. L'analisi GC della caffeina è mostrata nella Figura 1. L'adenina è usata come standard interno. Il rapporto tra le aree di picco può essere misurato e tracciato rispetto al rapporto tra le concentrazioni. La pendenza del grafico è il fattore di risposta (in questo caso 1.8).
2. La Figura 2 mostra un cromatogramma di un campione di caffè con standard interno di adenina. Il rapporto tra l'area di picco è 1,78. Utilizzando il fattore di risposta e la concentrazione nota di adenina (0,33 mg/mL), la concentrazione di caffeina nel campione sconosciuto è calcolata in 0,33 mg/mL.

Figura 1. Grafico di calibrazione utilizzando uno standard interno. Un grafico dei rapporti di area vs rapporti di concentrazione per 3 campioni standard di caffeina (1, 0,5 e 0,2 mg / mL) con 0,33 mg / mL di standard interno di adenina aggiunti a ciascuno. La pendenza della linea è 1,8, che è il fattore di risposta.

Figura 2. Cromatogramma del caffè con standard interno di adenina. Un grafico della risposta del rilevatore FID ai campioni. I tre picchi principali sono l'adenina (IS), la caffeina e l'acido palmitico.

La perdita di campione può verificarsi ogni volta che un campione viene maneggiato o trasferito, rendendo così difficile un calcolo accurato della concentrazione.

Per garantire l'accuratezza, gli effetti della perdita di campione devono essere ridotti al minimo utilizzando un'attenta preparazione del campione e limitando il numero di fasi di manipolazione e trasferimento del campione. Tuttavia, la perdita di campione può verificarsi anche a causa di errori sistematici, come la manipolazione incompleta del campione, gli effetti matrice e le variazioni nella procedura analitica.

Queste fonti di perdita possono essere spiegate aggiungendo una concentrazione nota di una specie simile, ma non identica, al composto di interesse. Questo è chiamato standard interno. Eventuali perdite di campione che si verificano rispetto allo standard interno devono essere simili per l'analita, consentendo di calcolare con precisione la concentrazione.

Questo video illustrerà l'uso di uno standard interno e di una tecnica di laboratorio adeguata per tenere conto della perdita di campione quando si determina la concentrazione di un'incognita.

Uno standard interno è una sostanza aggiunta in quantità nota a standard, campioni e bianchi durante un'analisi.

In cromatografia e spettroscopia, viene calcolato il rapporto tra il segnale per lo standard interno e l'analita. Questo rapporto, chiamato fattore di risposta, è proporzionale al rapporto tra l'analita e le concentrazioni standard.

Il fattore di risposta, R, può essere espresso dalla seguente equazione, dove A rappresenta i segnali analitici del campione e dello standard interno e C rappresenta le concentrazioni del campione e dello standard interno.

Uno standard interno può compensare sia gli errori sistematici che quelli casuali. Ad esempio, gli errori casuali, come le incongruenze durante la misurazione di un campione, saranno gli stessi sia per lo standard interno che per l'analita. Pertanto, il rapporto dei loro segnali non cambierà.

Per gli errori sistematici, come gli effetti matrice in soluzione, il rapporto non sarà influenzato fintanto che l'effetto matrice è uguale sia per lo standard che per l'analita.

Sebbene gli standard interni offrano grandi vantaggi, può essere difficile sceglierne uno adatto. Uno standard interno deve avere un segnale simile, ma non identico, all'analita. Inoltre, non può influenzare in alcun modo la misurazione dell'analita.

Infine, la concentrazione deve essere ben nota. Ciò si ottiene garantendo che lo standard interno non sia nativamente presente nel campione; quindi, l'unica fonte di esso in soluzione è la concentrazione nota aggiunta.

Nell'esperimento seguente, la concentrazione di caffeina in un campione sconosciuto sarà determinata mediante gascromatografia.

Ciò si ottiene creando una curva di calibrazione utilizzando soluzioni note di caffeina, con l'adenina come standard interno. La pendenza della curva di calibrazione è uguale al fattore di risposta.

Una volta noto il fattore di risposta, la concentrazione dell'incognita può essere calcolata dal rapporto di area del cromatogramma misurato.

Ora che hai compreso le basi degli standard interni, diamo un'occhiata alla procedura.

Per iniziare la procedura, pesare accuratamente 100 mg dello standard interno, adenina, in un becher pulito.

Quindi, scioglierlo in circa 20 ml di dimetilsolfossido e mescolare la soluzione.

Una volta che l'adenina si è sciolta, versare la soluzione in un matraccio tarato da 50 mL.

Sciacquare il becher e mescolare la barretta con 10 ml di DMSO, quindi versare il risciacquo nel pallone. Ripetere questo risciacquo due volte, per garantire un corretto trasferimento della soluzione. Riempire fino al segno di calibrazione, ottenendo uno standard interno con una concentrazione di 2 mg/mL.

Quindi, pesare 100 mg di caffeina in un becher per preparare una soluzione madre. Sciogliere la caffeina con una piccola quantità di metanolo. Quindi, utilizzare 3 risciacqui per trasferire questa soluzione in un matraccio tarato fresco da 25 mL. Questa è la soluzione madre da 4 mg/mL. Usalo per creare 3 standard di caffeina.

Quindi, aggiungere 0,2 ml di adenina standard interna, a ciascun pallone. Riempire ciascuno fino al volume finale con metanolo. Trasferire ogni soluzione in una fiala di campione.

Eseguire ogni standard di caffeina attraverso un gascromatografo. Calcola il rapporto tra le aree di picco per la caffeina rispetto allo standard adenina.

Per prima cosa, pesare 2 g di caffè in un becher da 100 ml e registrare il peso.

Quindi, aggiungi 20 ml di metanolo per estrarre la caffeina dal caffè. Lasciare mescolare la soluzione per 20 minuti.

Utilizzando un imbuto B?chner, filtrare i fondi di caffè. Sciacquare il becher con una piccola quantità di metanolo e versare questo risciacquo nell'imbuto. Ripetere il risciacquo due volte.

Misurare il volume finale del filtrato; dovrebbe essere di circa 35 ml.

Per preparare il campione per l'analisi, aggiungere 1 mL di estratto di caffè a una fiala del campione. Quindi, aggiungere 0,2 mL dello standard interno di adenina e posizionare la fiala nel rack del campionatore automatico dello strumento.

Eseguire un'analisi gascromatografica del campione, assicurandosi che le condizioni siano tali da separare la caffeina e l'adenina.

Dopo aver completato l'analisi, calcolare l'area del picco sia per lo standard interno che per l'analita.

Una volta che tutti i campioni sono stati analizzati, è possibile determinare la curva di calibrazione standard per le soluzioni di caffeina/adenina tracciando i rapporti tra le aree di picco e i rapporti delle concentrazioni. La pendenza di questa linea, che rappresenta il fattore di risposta, è stata di 1,8.

Successivamente, vengono analizzati i dati GC del campione di caffè estratto. Il rapporto tra le aree di picco è stato calcolato in 1,78. Utilizzando il fattore di risposta e la concentrazione nota dello standard interno, l'adenina, la concentrazione di caffeina nel campione sconosciuto è stata calcolata in 0,33 mg/mL.

Molti tipi diversi di reazioni, tra vari discepoli scientifici, utilizzano standard interni per ridurre al minimo gli effetti degli errori e della perdita di campioni.

Gli effetti della perdita di campione riscontrati durante la preparazione del campione possono essere ridotti al minimo utilizzando standard interni, mantenendo il loro rapporto di concentrazione quasi costante.

In questo esempio, i lipidi bioattivi sono stati estratti da cellule lisate utilizzando un processo di estrazione liquido-liquido. All'inizio dell'estrazione sono stati aggiunti standard interni per gli isotopi stabili per tenere conto degli errori durante la preparazione del campione.

Gli standard interni non sono stati fondamentali solo per la preparazione dei lipidi bioattivi, ma anche per l'analisi. I lipidi sono stati separati utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni e analizzati tramite spettrometria di massa.

Nella spettroscopia, gli standard interni possono aiutare a correggere gli errori casuali dovuti a cambiamenti nell'intensità della sorgente luminosa. Se una lampada o un'altra fonte di luce ha una potenza variabile, ciò influenzerà l'assorbimento e, di conseguenza, l'emissione di un campione. Tuttavia, il rapporto tra uno standard interno e un analita rimarrà costante, anche se la sorgente luminosa non lo fa.

Nella cromatografia, una delle maggiori fonti di errore è l'iniezione. I campionatori automatici aiutano a ridurre al minimo questo problema, ma l'errore può comunque essere dell'1-2% di deviazione standard relativa.

In questo esempio, gli standard di vapore contenenti uno standard interno sono stati analizzati utilizzando la gascromatografia per stabilire una curva di calibrazione. Una volta completata questa operazione, è stato possibile misurare il campione sconosciuto e contabilizzare le perdite dovute alla volatilità del campione.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE agli standard interni. A questo punto è necessario comprendere le procedure consigliate per ridurre al minimo la perdita di campioni, gli standard interni e i fattori di risposta.

Grazie per l'attenzione!