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Analytical Chemistry

Standard interni

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Internal Standards

3.1: Sample Preparation for Analytical Characterization

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

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09:18 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton – Università della Virginia

L’obiettivo di molte analisi chimiche è un’analisi quantitativa, in cui viene determinata la quantità di una sostanza in un campione. Per calcolare con precisione la concentrazione di uno sconosciuto da un campione, è fondamentale un’attenta preparazione del campione. Ogni volta che un campione viene maneggiato o trasferito, parte del campione può andare perso. Esistono tuttavia strategie per ridurre al minimo la perdita di campioni. Esistono anche strategie per far fronte alla perdita del campione e fare ancora misurazioni accurate della concentrazione.

Per ridurre al minimo la perdita di campioni, l’ideale è ridurre al minimo il numero di passaggi di gestione e trasferimento del campione. Ad esempio, la massa di un campione solido direttamente in un pallone in cui verrà realizzata una soluzione riduce una fase di trasferimento. Se è necessario trasferire da un pallone all’altro e si sta facendo una diluizione, il triplo risciacquo della vetreria aiuta a garantire che tutto il campione venga trasferito. Altre strategie sono più specifiche per il campione. Ad esempio, i campioni che assorbono al vetro, come le proteine, potrebbero essere gestiti meglio in tubi monouso in polipropilene. I tubi non sono idrofili, quindi se una piccola quantità di campione deve essere pipettata in acqua, è meglio aver già aggiunto l’acqua al tubo, in modo che il campione possa essere pipettato direttamente nel solvente. Potrebbe essere meglio concentrarsi, piuttosto che asciugare completamente un campione, a causa delle perdite da insolubilità dopo la reidratazione.

Un’altra fonte di perdita del campione è attraverso manipolazioni incomplete del campione. Ad esempio, se viene utilizzata una procedura di derivatizzazione e la derivatizzazione è incompleta, l’intera quantità di campione non viene osservata. Errori come questo sono errori sistematici e possono essere risolti correggendo il problema, ad esempio modificando la procedura di derivatizzazione. Un’altra causa di errore sistematico nelle misurazioni sono gli effetti della matrice. Questi possono interferire con la misurazione di determinate sostanze e l’esecuzione di calibrazioni nella stessa matrice del campione può ridurre questo effetto.

L’analisi quantitativa viene in genere eseguita utilizzando standard esterni o interni. Per gli standard esterni, viene effettuata una curva di calibrazione misurando diverse concentrazioni note dell’analita di interesse. Quindi, l’esempio viene eseguito separatamente dallo standard. Per gli standard interni, lo standard si trova nello stesso campione dell’analita di interesse, consentendo di eseguire la misurazione contemporaneamente. Tipicamente, viene aggiunta una specie diversa chiamata standard interno e viene calcolato il rapporto tra la risposta per quello standard interno e l’analita. L’idea è che il rapporto della risposta, chiamato fattore di risposta, sia proporzionale alla loro concentrazione. Mentre il metodo deve essere in grado di distinguere tra l’analita di interesse e lo standard interno, eventuali perdite di campione che si verificano dopo l’aggiunta dello standard interno dovrebbero essere simili per entrambe le sostanze e quindi il rapporto della risposta rimane lo stesso. Un caso speciale di utilizzo di standard interni è il metodo delle aggiunte standard, in cui quantità crescenti di analita vengono aggiunte alla soluzione e la quantità originale di analita viene retro-calcolata. Gli standard interni possono essere utilizzati in cromatografia, elettrochimica e spettroscopia.

Principles

Uno standard interno è una sostanza aggiunta in quantità costante a un campione, in bianco e standard in un’analisi. Uno standard interno può compensare errori sia sistematici che casuali. Ad esempio, se ci sono fluttuazioni dello strumento che causano errori casuali nella misurazione, queste fluttuazioni dovrebbero essere le stesse sia per lo standard interno che per l’analita e quindi il rapporto tra i segnali non cambia. Per errori sistematici, come gli effetti matriciali del solvente, finché l’effetto è uguale sia per lo standard che per l’analita, il rapporto è di nuovo inalterato.

Lo svantaggio degli standard interni è che è difficile trovare uno standard interno adatto. Lo standard interno deve avere un segnale simile all’analita, ma abbastanza diverso da poter essere distinto dallo strumento. Inoltre, lo standard interno non dovrebbe essere presente nella matrice del campione, in modo che lo standard aggiunto sia l’unica fonte dello standard. Occasionalmente, un costituente principale di un campione che è costante in concentrazione può essere usato come standard interno invece di uno standard aggiunto, ma la concentrazione deve essere ben nota per quel costituente. Lo standard interno non dovrebbe inoltre sopprimere o migliorare il segnale dell’analita.

Nella cromatografia, una delle maggiori fonti di errore è spesso l’iniezione. Se vengono utilizzate iniezioni manuali, possono esserci errori nel caricare correttamente la siringa. I volumi sono tipicamente piccoli (~ 1 μL), quindi ci sono incertezze nell’iniettare in modo riproducibile questo piccolo volume, spesso un paio di percentuali di deviazione standard relativa (RSD). Nella gascromatografia (GC), il campione viene iniettato in una porta riscaldata e l’evaporazione dalla punta dell’ago può provocare variazioni di volume iniettato. I campionatori automatici aiutano sia con l’errore nel caricamento della siringa che con l’errore nell’iniezione rapida per evitare l’evaporazione in GC, ma l’errore può ancora essere dell’1-2% RSD. Con la cromatografia, l’area del picco viene generalmente utilizzata al posto dell’altezza del picco, poiché i picchi diventano più ampi e più corti con il tempo, ma l’area del picco è costante. Pertanto, per gli standard interni, i rapporti delle aree di picco vengono utilizzati nella cromatografia anziché nelle altezze dei picchi.

Per una calibrazione con uno standard interno, viene calcolato un fattore di risposta. Il fattore di risposta (R) è il rapporto dei picchi rispetto al rapporto delle concentrazioni dove X è l’analita e IS è lo standard interno.

Per la cromatografia viene utilizzata l’area (A). Il fattore di risposta può essere calcolato da un grafico di calibrazione di A_X/ A_IS vs C_X/ C_IS, dove il fattore di risposta è la pendenza e l’intercetta y è assunta come 0. Una volta che il fattore di risposta è noto per gli standard, la risposta dell’ignoto può essere calcolata dal rapporto di area misurato dall’esperimento.

Procedure

1. Corretta gestione del campione: creazione di una soluzione

Prendi un becher pulito e ammassa la quantità corretta di campione in esso. Registrare la massa effettiva utilizzata. In questo esempio, una soluzione di adenina viene realizzata in un pallone volumetrico per l’uso come standard interno per l’analisi successiva. La massa di adenina è di 100 mg. Non ammassare direttamente in un matraccio volumetrico perché ha un collo lungo e l’adenina non può essere facilmente aggiunta o rimossa.
Aggiungere circa 25 ml di solvente (in questo caso dimetilsolfossido (DMSO)) al becher e lasciarlo mescolare per sciogliersi. In questo esempio, la soluzione finale è fatta in un matraccio volumetrico da 50 ml, quindi aggiungi solo circa 25 ml in modo che il becher possa essere risciacquato e la soluzione fatta fino al volume finale.
Una volta che il solido si è sciolto, versare la soluzione nel matraccio volumetrico.
Risciacquare il becher e la barra di agitazione con piccole quantità di solvente, circa 10 ml, e versare il risciacquo nel matraccio volumetrico. Ripeti altre due volte. Ciò consente di garantire il corretto trasferimento della soluzione.

2. Preparazione di una curva di calibrazione standard interna

Preparare i campioni standard desiderati per l’analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando acetonitrile e quindi l’adenina viene utilizzata come standard interno per la misurazione.
Per i campioni di caffeina, pesare la quantità di campione necessaria per fare 1 mg / mL di campione. Se si utilizza un matraccio volumetrico da 10 ml, ovvero 10 mg.
Pesare l’analita in un becher, aggiungere qualche mL di solvente (qui metanolo) per sciogliere, quindi trasferire quantitativamente al matraccio volumetrico usando 3 risciacqui.
Fai altri 3 standard in modo simile con 0,2, 0,5 e 2 mg / ml di caffeina.
Mettere 1 mL di ogni standard di caffeina in un flaconcino campione.
Aggiungere 0,2 mL di 2 mg/mL di standard interno di adenina a ciascun flaconcino campione.
Esegui l’esperimento di gascromatografia con ogni standard di caffeina. Per ogni cromatogramma, calcolare il rapporto tra le aree di picco per la caffeina rispetto allo standard.
Crea un grafico del rapporto area rispetto al rapporto di concentrazione. La pendenza di quel grafico è il fattore di risposta.

3. Preparazione di un campione reale con standard interno per gascromatografia

Preparare il campione desiderato per l’analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando l’acetrontrile.
Per il campione di caffè, ammassare 2 g di caffè in un becher da 100 ml. Registrare il peso esatto del caffè.
Aggiungere 20 ml di acetonitrile al becher.
Lasciare riposare per 20 minuti, mescolando frequentemente.
Filtrare i fondi di caffè usando una carta da filtro in un imbuto.
Risciacquare la carta da filtro 3x con piccole quantità di acetonitrile (5 ml).
Misurare il volume finale del filtrato. Dovrebbe essere di circa 35 ml.

4. Eseguire il campione e calcolare la concentrazione

Prendere 1 mL del campione di estratto di caffè e aggiungere 0,2 mL dello standard interno in un flaconcino. Posizionare il flaconcino nel rack del campionatore automatico.
Eseguire un’analisi GC del campione. Assicurarsi che le condizioni GC siano tali che la caffeina e l’adenina si sepatrino. In questo esempio, le separazioni isotermiche vengono eseguite a 200 °C.
Dopo l’analisi, calcolare l’area di picco sia per il picco standard interno che per il picco analita. Usando i loro rapporti, calcola la quantità di caffeina nel campione.

5. Risultati: Analisi GC della caffeina con standard interno

L’analisi GC della caffeina è mostrata nella Figura 1. L’adenina è usata come standard interno. Il rapporto tra le aree di picco può essere misurato e tracciato rispetto al rapporto tra le concentrazioni. La pendenza del grafico è il fattore di risposta (in questo caso 1.8).
La Figura 2 mostra un cromatogramma di un campione di caffè con standard interno di adenina. Il rapporto tra l’area di picco è 1,78. Utilizzando il fattore di risposta e la concentrazione nota di adenina (0,33 mg/mL), la concentrazione di caffeina nel campione sconosciuto è calcolata in 0,33 mg/mL.

Figura 1. Grafico di calibrazione utilizzando uno standard interno. Un grafico dei rapporti di area vs rapporti di concentrazione per 3 campioni standard di caffeina (1, 0,5 e 0,2 mg / mL) con 0,33 mg / mL di standard interno di adenina aggiunti a ciascuno. La pendenza della linea è 1,8, che è il fattore di risposta.

Figura 2. Cromatogramma del caffè con standard interno di adenina. Un grafico della risposta del rilevatore FID ai campioni. I tre picchi principali sono l’adenina (IS), la caffeina e l’acido palmitico.

La perdita del campione può verificarsi ogni volta che un campione viene gestito o trasferito, rendendo così difficili i calcoli accurati della concentrazione.

Per garantire l’accuratezza, gli effetti della perdita del campione devono essere ridotti al minimo utilizzando un’attenta preparazione del campione e limitando il numero di passaggi di manipolazione e trasferimento del campione. Tuttavia, la perdita del campione può verificarsi anche a causa di errori sistematici, come la manipolazione incompleta del campione, gli effetti della matrice e le variazioni nella procedura analitica.

Queste fonti di perdita possono essere spiegate aggiungendo una concentrazione nota di una specie simile, ma non identica, al composto di interesse. Questo è chiamato uno standard interno. Eventuali perdite di campione che si verificano allo standard interno dovrebbero essere simili per l’analita, consentendo di calcolare con precisione la concentrazione.

Questo video illustrerà l’uso di uno standard interno e di una tecnica di laboratorio appropriata per tenere conto della perdita del campione nel determinare la concentrazione di uno sconosciuto.

Uno standard interno è una sostanza aggiunta in quantità nota a standard, campioni e spazi vuoti durante un’analisi.

In cromatografia e spettroscopia, viene calcolato il rapporto tra il segnale per lo standard interno e l’analita. Questo rapporto, chiamato fattore di risposta, è proporzionale al rapporto tra l’analita e le concentrazioni standard.

Il fattore di risposta, R, può essere espresso dalla seguente equazione, dove A rappresenta i segnali analitici del campione e dello standard interno e C rappresenta le concentrazioni del campione e dello standard interno.

Uno standard interno può compensare errori sia sistematici che casuali. Ad esempio, gli errori casuali, come le incoerenze durante la misurazione di uncampione,saranno gli stessi sia per lo standard interno che per l’analita. Pertanto, il rapporto tra i loro segnali non cambierà.

Per gli errori sistematici, come gli effetti della matrice in soluzione, il rapporto non sarà influenzato finché l’effetto matrice è uguale sia per lo standard che per l’analita.

Mentre gli standard interni offrono grandi vantaggi, può essere difficile sceglierne uno adatto. Uno standard interno deve avere un segnale simile, ma non identico, all’analita. Inoltre non può influenzare in alcun modo la misurazione dell’analita.

Infine, la concentrazione deve essere ben nota. Ciò si ottiene assicurando che lo standard interno non sia nativamente presente nel campione; pertanto, l’unica fonte di esso in soluzione è la concentrazione nota aggiunta.

Nel seguente esperimento, la concentrazione di caffeina in un campione sconosciuto sarà determinata mediante gascromatografia.

Ciò si ottiene creando una curva di calibrazione utilizzando soluzioni di caffeina conosciute, con l’adenina come standard interno. La pendenza della curva di calibrazione è uguale al fattore di risposta.

Una volta che il fattore di risposta è noto, la concentrazione dell’ignoto può essere calcolata dal suo rapporto di area del cromatogramma misurato.

Ora che hai capito le basi degli standard interni, diamo un’occhiata alla procedura.

Per iniziare la procedura, pesare accuratamente 100 mg dello standard interno, l’adenina, in un becher pulito.

Quindi, scioglierlo in circa 20 ml di dimetilsolfossido e mescolare la soluzione.

Una volta che l’adenina si è dissolta, versare la soluzione in un matraccio volumetrico da 50 ml.

Risciacquare il becher e mescolare la barra con 10 ml di DMSO e versare il risciacquo nel matraccio. Ripetere questo risciacquo due volte, per garantire il corretto trasferimento della soluzione. Riempire fino al segno di calibrazione, risultando in uno standard interno con una concentrazione di 2 mg/ml.

Quindi, pesare 100 mg di caffeina in un becher per preparare una soluzione stock. Sciogliere la caffeina con una piccola quantità di metanolo. Quindi, utilizzare 3 risciacqui per trasferire questa soluzione in un matraccio volumetrico fresco da 25 ml. Questa è la soluzione stock da 4 mg/ml. Usalo per creare 3 standard di caffeina.

Quindi, aggiungere 0,2 ml dello standard interno, adenina, a ciascun pallone. Riempire ciascuno fino al volume finale con metanolo. Trasferire ogni soluzione in un flaconcino campione.

Eseguire ogni standard di caffeina attraverso un gascromatografo. Calcola il rapporto tra le aree di picco per la caffeina rispetto allo standard di adenina.

Per prima cosa, pesare 2 g di caffè in un becher da 100 ml e registrare il peso.

Quindi, aggiungere 20 ml di metanolo per estrarre la caffeina dal caffè. Lasciare mescolare la soluzione per 20 minuti.

Utilizzando un imbuto Büchner, filtrare i fondi di caffè. Risciacquare il becher con una piccola quantità di metanolo e versare questo risciacquo nell’imbuto. Ripetere il risciacquo due volte.

Misurare il volume finale del filtrato; dovrebbe essere di circa 35 ml.

Per preparare il campione per l’analisi, aggiungere 1 mL di estratto di caffè a un flaconcino campione. Quindi, aggiungere 0,2 mL dello standard interno di adenina e posizionare il flaconcino nel rack dell’auto-campionatore dello strumento.

Eseguire un’analisi gascromatografica del campione, assicurandosi che le condizioni siano tali che la caffeina e l’adenina siano separate.

Dopo aver completato l’analisi, calcolare l’area di picco sia per lo standard interno che per l’analita.

Una volta analizzati tutti i campioni, è possibile determinare la curva di calibrazione standard per le soluzioni di caffeina / adenina tracciando i rapporti delle aree di picco rispetto ai rapporti delle concentrazioni. La pendenza di questa linea, che rappresenta il fattore di risposta, era 1,8.

Successivamente, vengono analizzati i dati GC dal campione di caffè estratto. Il rapporto tra le aree di picco è stato calcolato in 1,78. Utilizzando il fattore di risposta e la concentrazione nota dello standard interno, l’adenina, la concentrazione di caffeina nel campione sconosciuto è stata calcolata in 0,33 mg/ml.

Molti diversi tipi di reazioni, attraverso vari discepoli scientifici, utilizzano standard interni per ridurre al minimo gli effetti degli errori e della perdita di campioni.

Gli effetti della perdita di campioni riscontrati durante la preparazione del campione possono essere ridotti al minimo utilizzando standard interni, mantenendo il loro rapporto di concentrazione quasi costante.

In questo esempio, i lipidi bioattivi sono stati estratti da cellule lizzate utilizzando un processo di estrazione liquido-liquido. All’inizio dell’estrazione sono stati aggiunti standard interni di isotopi stabili per tenere conto degli errori durante la preparazione del campione.

Gli standard interni non erano solo critici per la preparazione dei lipidi bioattivi, ma anche per l’analisi. I lipidi sono stati separati utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni e analizzati tramite spettrometria di massa.

In spettroscopia, gli standard interni possono aiutare a correggere errori casuali dovuti a cambiamenti nell’intensità della sorgente luminosa. Se una lampada o un’altra sorgente luminosa ha una potenza variabile, influenzerà l’assorbimento e, di conseguenza, l’emissione di un campione. Tuttavia, il rapporto tra uno standard interno e l’analita rimarrà costante, anche se la sorgente luminosa non lo fa.

Nella cromatografia, una delle maggiori fonti di errore è l’iniezione. I campionatori automatici aiutano a ridurre al minimo questo, ma l’errore può ancora essere una deviazione standard relativa dell’1-2%.

In questo esempio, gli standard di vapore contenenti uno standard interno sono stati analizzati utilizzando la gascromatografia per stabilire una curva di calibrazione. Una volta completato, il campione sconosciuto poteva quindi essere misurato e le perdite dovute alla volatilità del campione contabili.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE agli standard interni. È ora necessario comprendere le procedure consigliate per ridurre al minimo la perdita di campioni, gli standard interni e i fattori di risposta.

Grazie per l’attenzione!

Applications and Summary

Gli standard interni sono utilizzati in molti campi, tra cui la spettroscopia e la cromatografia. In spettroscopia, gli standard interni possono aiutare a correggere errori casuali dovuti a cambiamenti nell’intensità della sorgente luminosa. Se una lampada o un’altra sorgente luminosa ha una potenza variabile, influenzerà l’assorbimento e, di conseguenza, l’emissione di un campione. Tuttavia, il rapporto tra uno standard interno e l’analita rimarrà costante, anche se la sorgente luminosa non lo fa. Un esempio di questo è l’utilizzo del litio (Li) come standard interno per l’analisi del sodio in un campione di sangue mediante spettroscopia di fiamma. Li è chimicamente simile al sodio, ma non si trova nativamente nel sangue.

Per la cromatografia, gli standard interni sono spesso utilizzati sia nella gascromatografia che nella cromatografia liquida. Per le applicazioni con spettrometria di massa come rivelatore, lo standard interno può essere un analita etichettato isotopicamente, in modo che il peso molecolare (MW) sia diverso dall’analita di interesse. Gli standard interni sono comunemente usati nelle analisi farmaceutiche o ambientali.

Transcript

Sample loss can occur every time a sample is handled or transferred, thereby making accurate calculations of concentration difficult.

To ensure accuracy, the effects of sample loss must be minimized using careful sample preparation and by limiting the number of sample handling and transfer steps. However, sample loss can also occur due to systematic errors, such as incomplete sample manipulation, matrix effects, and variations in analytic procedure.

These sources of loss can be accounted for by adding a known concentration of a species similar, but not identical, to the compound of interest. This is called an internal standard. Any sample losses that occur to the internal standard should be similar for the analyte, allowing for the concentration to be accurately calculated.

This video will illustrate the use of an internal standard and proper lab technique to account for sample loss when determining the concentration of an unknown.

An internal standard is a substance added in a known amount to standards, samples, and blanks during an analysis.

In chromatography and spectroscopy, the ratio of the signal for the internal standard and the analyte is calculated. This ratio, called the response factor, is proportional to the ratio of the analyte and standard concentrations.

Response factor, R, can be expressed by the following equation, where A represents the analytical signals of the sample and internal standard and C represents the concentrations of the sample and internal standard.

An internal standard can compensate for both systematic and random errors. For example, random errors—such as inconsistencies when measuring a sample—will be the same for both the internal standard and the analyte. Therefore, the ratio of their signals will not change.

For systematic errors, such as matrix effects in solution, the ratio will be unaffected as long as the matrix effect is equal for both the standard and the analyte.

While internal standards provide great benefit, it can be difficult to choose one that is suitable. An internal standard must have a signal that is similar, but not identical, to the analyte. It also cannot affect the measurement of the analyte in any way.

Finally, the concentration must be well known. This is achieved by ensuring that the internal standard is not natively present in the sample; thus, the only source of it in solution is the known concentration added.

In the following experiment, the concentration of caffeine in an unknown sample will be determined by gas chromatography.

This is achieved by creating a calibration curve using known caffeine solutions, with adenine as the internal standard. The slope of the calibration curve is equal to the response factor.

Once the response factor is known, the concentration of the unknown can be calculated from its measured chromatogram area ratio.

Now that you understand the basics of internal standards, let’s take a look at the procedure.

To begin the procedure, accurately weigh 100 mg of the internal standard, adenine, into a clean beaker.

Next, dissolve it in roughly 20 mL of dimethyl sulfoxide, and mix the solution.

Once the adenine has dissolved, pour the solution into a 50-mL volumetric flask.

Rinse the beaker and stir bar with 10 mL of DMSO, and pour the rinse into the flask. Repeat this rinse twice, to ensure proper solution transfer. Fill to the calibration mark, resulting in an internal standard with a concentration of 2 mg/mL.

Next, weigh 100 mg of caffeine into a beaker to prepare a stock solution. Dissolve the caffeine with a small amount of methanol. Then, use 3 rinses to transfer this solution to a fresh 25 mL volumetric flask. This is the 4 mg/mL stock solution. Use it to create 3 caffeine standards.

Next, add 0.2 mL of the internal standard, adenine, to each flask. Fill each to the final volume with methanol. Transfer each solution to a sample vial.

Run each caffeine standard through a gas chromatograph. Calculate the ratio of peak areas for the caffeine versus the adenine standard.

First, weigh 2 g of coffee into a 100-mL beaker, and record the weight.

Next, add 20 mL of methanol to extract the caffeine from the coffee. Allow the solution to stir for 20 min.

Using a Büchner funnel, filter out the coffee grounds. Rinse the beaker with a small amount of methanol, and pour this rinse into the funnel. Repeat the rinse twice.

Measure the final volume of the filtrate; it should be approximately 35 mL.

To prepare the sample for analysis, add 1 mL of the coffee extract to a sample vial. Then, add 0.2 mL of the adenine internal standard, and place the vial into the instrument’s auto-sampler rack.

Run a gas chromatography analysis of the sample, ensuring that the conditions are such that the caffeine and adenine are separate.

After completing the analysis, compute the peak area for both the internal standard and the analyte.

Once all the samples have been analyzed, the standard calibration curve can be determined for the caffeine/adenine solutions by plotting the ratios of the peak areas versus the ratios of the concentrations. The slope of this line, which represents the response factor, was 1.8.

Next, the GC data from the extracted coffee sample is analyzed. The ratio of the peak areas was calculated to be 1.78. Using the response factor and the known concentration of the internal standard, adenine, the concentration of caffeine in the unknown sample was calculated to be 0.33 mg/mL.

Many different types of reactions, across various scientific disciples, utilize internal standards to minimize the effects of errors and sample loss.

The effects of sample loss encountered during sample preparation can be minimized using internal standards, keeping their concentration ratio nearly constant.

In this example, bioactive lipids were extracted from lysed cells using a liquid-liquid extraction process. Stable isotope internal standards were added at the beginning of extraction to account for errors during sample preparation.

Internal standards were not only critical for the preparation of the bioactive lipids, but also for the analysis. The lipids were separated using high-performance liquid chromatography, and analyzed via mass spectrometry.

In spectroscopy, internal standards can help correct for random errors due to changes in light source intensity. If a lamp or other light source has variable power, it will affect the absorption and consequently, emission of a sample. However, the ratio of an internal standard to analyte will stay constant, even if the light source does not.

In chromatography, one of the largest sources of error is the injection. Auto-samplers help minimize this, but error can still be 1–2% relative standard deviation.

In this example, vapor standards containing an internal standard were analyzed using gas chromatography to establish a calibration curve. Once this was complete, the unknown sample could then be measured and the losses due to volatility of the sample accounted for.

You’ve just watched JoVE’s introduction to internal standards. You should now understand best practices for minimizing sample loss, internal standards, and response factors.

Thanks for watching!