What is an internal standard and why is it used in analytical chemistry?

An internal standard is a substance added in a known amount to standards, samples, and blanks during analysis. It compensates for both systematic and random errors that occur during sample handling and measurement. By calculating the ratio of signals between the internal standard and analyte, called the response factor, accurate concentration calculations are possible even when sample loss occurs.

How does an internal standard help account for sample loss?

Any sample losses occurring after the internal standard is added should be similar for both the internal standard and the analyte. Since both substances experience proportional losses, their signal ratio remains constant. This allows the response factor to accurately reflect concentration ratios, making it possible to calculate analyte concentration despite sample loss during preparation and transfer steps.

What are the key requirements for choosing a suitable internal standard?

An internal standard must have a signal similar but not identical to the analyte, allowing the measurement method to distinguish between them. It cannot affect the analyte measurement and must not be natively present in the sample. The concentration must be well known, ensuring the only source in solution is the known amount deliberately added during analysis.

What is a response factor and how is it calculated?

The response factor is the ratio of analytical signals for the internal standard and analyte, which is proportional to their concentration ratio. It is calculated by plotting the ratios of peak areas versus concentration ratios from known standards. The slope of the resulting calibration curve equals the response factor, which can then be used to determine unknown analyte concentrations.

How do internal standards correct for systematic errors like matrix effects?

Matrix effects interfere with analyte measurement by affecting the signal in solution. When an internal standard experiences the same matrix effect as the analyte, the ratio of their signals remains unaffected. Performing calibrations in the same matrix as the sample ensures both substances are equally influenced, allowing the response factor ratio to accurately reflect true concentration differences.

What analytical techniques commonly use internal standards?

Internal standards are widely used in chromatography, spectroscopy, and electrochemistry. In gas chromatography, the ratio of peak areas for the internal standard and analyte is calculated. In spectroscopy, internal standards correct for random errors from variable light source intensity. These techniques rely on internal standards to minimize errors and ensure accurate quantitative analysis across diverse scientific disciplines.

How is sample preparation optimized to minimize sample loss before using an internal standard?

Sample loss is minimized by reducing the number of handling and transfer steps. Massing solids directly into the final flask eliminates unnecessary transfers. When transfers are necessary, triple rinsing glassware ensures complete sample transfer. For samples that adsorb to glass, using polypropylene tubes prevents losses. These preparation strategies work alongside internal standards to ensure accurate concentration determination.

Standard interni

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1. Corretta gestione del campione: creazione di una soluzione

Prendi un becher pulito e ammassa la quantità corretta di campione in esso. Registrare la massa effettiva utilizzata. In questo esempio, una soluzione di adenina viene realizzata in un pallone volumetrico per l'uso come standard interno per l'analisi successiva. La massa di adenina è di 100 mg. Non ammassare direttamente in un matraccio volumetrico perché ha un collo lungo e l'adenina non può essere facilmente aggiunta o rimossa.
Aggiungere circa 25 ml di solvente (in questo caso dimetilsolfossido (DMSO)) al becher e lasciarlo mescolare per sciogliersi. In questo esempio, la soluzione finale è fatta in un matraccio volumetrico da 50 ml, quindi aggiungi solo circa 25 ml in modo che il becher possa essere risciacquato e la soluzione fatta fino al volume finale.
Una volta che il solido si è sciolto, versare la soluzione nel matraccio volumetrico.
Risciacquare il becher e la barra di agitazione con piccole quantità di solvente, circa 10 ml, e versare il risciacquo nel matraccio volumetrico. Ripeti altre due volte. Ciò consente di garantire il corretto trasferimento della soluzione.

2. Preparazione di una curva di calibrazione standard interna

Preparare i campioni standard desiderati per l'analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando acetonitrile e quindi l'adenina viene utilizzata come standard interno per la misurazione.
Per i campioni di caffeina, pesare la quantità di campione necessaria per fare 1 mg / mL di campione. Se si utilizza un matraccio volumetrico da 10 ml, ovvero 10 mg.
Pesare l'analita in un becher, aggiungere qualche mL di solvente (qui metanolo) per sciogliere, quindi trasferire quantitativamente al matraccio volumetrico usando 3 risciacqui.
Fai altri 3 standard in modo simile con 0,2, 0,5 e 2 mg / ml di caffeina.
Mettere 1 mL di ogni standard di caffeina in un flaconcino campione.
Aggiungere 0,2 mL di 2 mg/mL di standard interno di adenina a ciascun flaconcino campione.
Esegui l'esperimento di gascromatografia con ogni standard di caffeina. Per ogni cromatogramma, calcolare il rapporto tra le aree di picco per la caffeina rispetto allo standard.
Crea un grafico del rapporto area rispetto al rapporto di concentrazione. La pendenza di quel grafico è il fattore di risposta.

3. Preparazione di un campione reale con standard interno per gascromatografia

Preparare il campione desiderato per l'analisi gascromatografica. In questo esempio, la caffeina viene estratta dal caffè usando l'acetrontrile.
Per il campione di caffè, ammassare 2 g di caffè in un becher da 100 ml. Registrare il peso esatto del caffè.
Aggiungere 20 ml di acetonitrile al becher.
Lasciare riposare per 20 minuti, mescolando frequentemente.
Filtrare i fondi di caffè usando una carta da filtro in un imbuto.
Risciacquare la carta da filtro 3x con piccole quantità di acetonitrile (5 ml).
Misurare il volume finale del filtrato. Dovrebbe essere di circa 35 ml.

4. Eseguire il campione e calcolare la concentrazione

Prendere 1 mL del campione di estratto di caffè e aggiungere 0,2 mL dello standard interno in un flaconcino. Posizionare il flaconcino nel rack del campionatore automatico.
Eseguire un'analisi GC del campione. Assicurarsi che le condizioni GC siano tali che la caffeina e l'adenina si sepatrino. In questo esempio, le separazioni isotermiche vengono eseguite a 200 °C.
Dopo l'analisi, calcolare l'area di picco sia per il picco standard interno che per il picco analita. Usando i loro rapporti, calcola la quantità di caffeina nel campione.

5. Risultati: Analisi GC della caffeina con standard interno

L'analisi GC della caffeina è mostrata nella Figura 1. L'adenina è usata come standard interno. Il rapporto tra le aree di picco può essere misurato e tracciato rispetto al rapporto tra le concentrazioni. La pendenza del grafico è il fattore di risposta (in questo caso 1.8).
La Figura 2 mostra un cromatogramma di un campione di caffè con standard interno di adenina. Il rapporto tra l'area di picco è 1,78. Utilizzando il fattore di risposta e la concentrazione nota di adenina (0,33 mg/mL), la concentrazione di caffeina nel campione sconosciuto è calcolata in 0,33 mg/mL.

Figura 1. Grafico di calibrazione utilizzando uno standard interno. Un grafico dei rapporti di area vs rapporti di concentrazione per 3 campioni standard di caffeina (1, 0,5 e 0,2 mg / mL) con 0,33 mg / mL di standard interno di adenina aggiunti a ciascuno. La pendenza della linea è 1,8, che è il fattore di risposta.

Figura 2. Cromatogramma del caffè con standard interno di adenina. Un grafico della risposta del rilevatore FID ai campioni. I tre picchi principali sono l'adenina (IS), la caffeina e l'acido palmitico.