Test per patogeni associati modello molecolare (PAMP)-trigger Immunità (PTI) nelle piante

Ciao, sono Suma TI del laboratorio di Greg Martin presso l'Istituto di Ricerca sulle Piante Voice Thompson. Oggi vi mostreremo un procedimento per un saggio basato sulla morte cellulare per l'immunità indotta da PAM, o PTI. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per verificare il coinvolgimento di un gene nella PTI.

Iniziamo. Avviare la procedura coltivando Nicotiana ANA fino a quando non raggiungono un'età di circa sette settimane. Quattro o cinque giorni prima dell'inizio.

Il saggio dell'immunità indotta da PAM o PTI. Potare le piante rimuovendo tutti i rami ascellari e i fiori. Provare a rimuovere i rami ascellari subito dopo la loro comparsa per rendere le piante più facili da gestire.

Dopo aver preparato le piante, procedere alla coltivazione dei batteri. Questa procedura utilizza batteri non patogeni per indurre l'immunità vegetale prima di una seconda inoculazione con batteri sfida; avviare la crescita di tutti i batteri impiegati nel saggio. Allo stesso tempo, utilizzare stocchi glicerolati congelati dei batteri pseudomonas per ciascun ceppo batterico di pseudomonas.

Spargere una piccola quantità di batteri al centro di una piastra KBM contenente l'antibiotico appropriato e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per circa 18-24 ore. Per l'agrobatterio, utilizzare una piastra fresca precedentemente preparata per avviare una coltura liquida in due millilitri di lb. Far crescere in agitazione durante la notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo.

Aggiungere da 150 a 200 microlitri di terreno liquido KBM sulle piastre contenenti i batteri pseudomonas. Distribuire i batteri su tutta la superficie della piastra. Utilizzando un contagocce sterile.

Rimettere le piastre nell'incubatrice per altre 20-24 ore. Agrobacterium. Avviare una coltura secondaria in circa 5-10 millilitri di LB contenente 20 micromolari di acetosiringone.

Coltivare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Dopo aver preparato i batteri, procedere alla preparazione delle piante per il saggio il giorno precedente l'esecuzione del saggio PTI. Dopo aver preparato i batteri, trasferire le piante in una stanza a 22-24 gradi Celsius con un'umidità relativa di circa il 35-40% e luce costante.

Successivamente, utilizzare un pennarello nero spesso per tracciare cerchi sulle foglie. Scegliere foglie ben espanse ed evitare le foglie più vecchie o quelle che risultano dure o spesse al tatto. Evitare di segnare le porzioni inferiori della foglia.

I cerchi devono avere un diametro di almeno 1,5 centimetri e se ne possono marcare da due a quattro per foglia. I cerchi devono essere ben distanziati e, preferibilmente, non devono attraversare una grossa venatura. Iniziare il saggio PTI raccogliendo i batteri utilizzati nell'induzione della PTI.

Il ceppo di Pseudomonas utilizzato dovrebbe aver formato un prato batterico indicativo di una buona crescita. Raccoglierlo dalla piastra raschiando con un bastoncino di legno sterile lungo e risospendere in circa 20-25 millilitri di soluzione di cloruro di magnesio 10 millimolare per la centrifugazione di Agrobacterium.

Coltivare per raccogliere le cellule e risospendere in circa 20-25 millilitri di cloruro di magnesio 10 millimolare più MES 10 millimolare, pH 5,6; ripetere la centrifugazione e quindi risospendere nuovamente in circa 20-25 millilitri della soluzione di cloruro di magnesio più MES. A questo punto i batteri Pseudomonas e Agrobacterium induttori sono stati risospesi.

Misurare la densità ottica di tutte e tre le colture a una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Regolare l'ODS diluendo le cellule con cloruro di magnesio per il *Pseudomonas* e con MES più cloruro di magnesio per l'*Agrobacterium*. I valori finali richiesti di OD si trovano nel protocollo scritto allegato.

Un volume totale di 25 millilitri di coltura batterica è sufficiente per inoculare circa da 40 a 50 punti. Iniziare ora il saggio infiltrando gli induttori PTI nei cerchi precedentemente segnati sulle foglie, utilizzando una siringa da un millilitro senza ago. Registrare l'ordine in cui le piante sono state infiltrate e l'ora esatta in cui è iniziata l'infiltrazione dopo l'induzione.

Procedere all'inoculazione di prova diverse ore dopo l'inoculazione induttiva. Raccogliere i ceppi batterici necessari per l'inoculazione di prova come precedentemente mostrato per i ceppi di pseudomonas induttivi. Nuovamente, misurare la DO e aggiustare la concentrazione delle colture in base al protocollo GR allegato.

Iniziare l'inoculazione di sfida sette ore dopo l'infiltrazione dell'induttore. Utilizzare le seguenti combinazioni di induttore e patogeno. Scegliere un punto sulla periferia del primo cerchio di inoculazione come centro del secondo cerchio di inoculazione.

Eseguire l'infiltrazione di sfida nello stesso ordine delle piante utilizzato per l'induzione. Se su una foglia sono presenti più punti, assicurarsi che le infiltrazioni non si sovrappongano. Infine, piastrare diluizioni seriali di tutte le colture utilizzate nel saggio su piastre di KBM o LB contenenti gli antibiotici appropriati.

Due giorni dopo l'inoculazione di sfida, è possibile iniziare a valutare la risposta di PTI. Due giorni dopo le inoculazioni di induzione e di sfida, osservare la comparsa di morte cellulare dovuta all'immunità attivata dall'effettore (ETI) nelle zone inoculate con PST DC 3000. La morte cellulare all'interno dell'area sovrapposta di infiltrazione indica un cedimento della PTI e deve essere registrata come fenotipo positivo. Da quattro a cinque giorni dopo le inoculazioni di induzione e di sfida, osservare la comparsa di morte cellulare dovuta alla malattia nelle zone inoculate con il mutante DC 3000 hopQ1 o PS back high. Cercare il cedimento della PTI, indicato dalla morte cellulare causata dalla malattia nell'area sovrapposta di infiltrazione. Continuare a osservare le piante finché quelle non compromesse per la PTI iniziano a mostrare morte cellulare nell'area sovrapposta di infiltrazione.

Le piante silenziate per FLS2 mostrano un'alterazione della PTI due giorni dopo l'inoculazione con la combinazione PFDC. La morte cellulare è osservata nella zona di sovrapposizione, indicando un cedimento del controllo della PTI in piante che non sono state silenziate per alcun gene. Sono state anche inoculate con la combinazione PFDC ed esaminate due giorni dopo aver eseguito il saggio: la morte cellulare indotta dalla sfida è visibile all'esterno, ma non all'interno, della zona di sovrapposizione, a causa di una risposta PTI normale.

Abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio basato sulla morte cellulare per l'immunità innescata da PAMP o PTI durante questa procedura. È importante ricordare di mantenere le piante nelle condizioni ambientali che raccomandiamo. Livelli più elevati di umidità avrebbero effetti negativi sulle piante e farebbero procedere il saggio più rapidamente.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.