Test per patogeni associati modello molecolare (PAMP)-trigger Immunità (PTI) nelle piante

Una morte saggio basato su cellule di PTI in piante di Nicotiana benthamiana è descritto.

Ciao, sono Suma TI del laboratorio di Greg Martin presso il Voice Thompson Institute for Plant Research. Oggi vi mostreremo una procedura per un test basato sulla morte cellulare per l'immunità innescata da PAM o PTI. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per cercare il coinvolgimento di un gene nella PTI.

Quindi iniziamo. Inizia la procedura coltivando la Nicotiana ANA fino a quando non hanno circa sette settimane. Quattro o cinque giorni prima dell'inizio.

Il PAM ha attivato l'immunità o il test PTI. Taglia le piante per rimuovere tutti i rami ascellari e i fiori. Prova a rimuovere i rami ascellari subito dopo la loro comparsa per rendere le piante più gestibili.

Dopo aver preparato le piante, procedere alla crescita dei batteri. Questa procedura utilizza batteri non patogeni per l'induzione dell'immunità delle piante prima di una seconda inoculazione con batteri sfidanti, avviando la crescita di tutti i batteri utilizzati nel test. Allo stesso tempo, utilizzare gambi di glicerolo congelati dei batteri pseudomonas per ogni gambo batterico di pseudomonas.

Stendere una piccola quantità di batteri al centro di una piastra KBM contenente l'antibiotico appropriato e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per circa 18-24 ore. Per l'agrobatterio, utilizzare una piastra fresca precedentemente preparata per avviare una coltura liquida in due millilitri di libbra. Coltiva durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione il giorno successivo.

Aggiungere da 150 a 200 microlitri di KBM liquido alle piastre dei batteri pseudomonas. Distribuire i batteri su tutto il piatto. Usando un greter sterile.

Rimetti le piastre nell'incubatrice per altre 20-24 ore. Quattro agrobatteri. Iniziare una coltura secondaria in circa 5-10 millilitri di LB contenente 20 micromolari di acetone.

Coltiva la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Dopo aver preparato i batteri, procedere alla preparazione delle piante per il test il giorno prima di condurre il test PTI. Dopo aver preparato i batteri, sposta le piante in una stanza a 22-24 gradi Celsius con circa il 35-40% di umidità relativa e luce costante.

Quindi, usa un pennarello nero spesso per segnare i cerchi sulle foglie. Scegli foglie ben espanse ed evita foglie più vecchie o foglie dure o spesse al tatto. Evitare di segnare le parti inferiori della foglia.

I cerchi hanno un diametro di almeno 1,5 centimetri e si possono segnare da due a quattro cerchi per foglia. I cerchi devono essere ben distanziati e preferibilmente non attraversare una grande vena. Iniziare il test PTI raccogliendo i batteri utilizzati nell'induzione del PTI.

Le specie di pseudomonas utilizzate dovrebbero aver formato un prato batterico indicativo di una buona crescita. Raccoglietele dal piatto raschiandole via con un lungo bastoncino di legno sterile e risospendetele in circa 20-25 millilitri di 10 millimolari. Soluzione di cloruro di magnesio per centrifuga di agrobacterium.

La coltura per raccogliere le cellule e sospendere in circa 20-25 millilitri di cloruro di magnesio 10 millimolare più 10 millimolari. MES pH 5,6, ripetere la centrifugazione e di nuovo, sospendere in circa 20-25 millilitri di cloruro di magnesio più soluzione MES. Ora che i batteri pseudomonas e agrobacterium che inducono sono risospesi.

Misura la densità ottica di tutte e tre le colture a una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Regolare l'ODS diluendo le cellule con cloruro di magnesio per lo pseudomonas e MES più cloruro di magnesio per l'agrobatterio. I valori OD finali richiesti si trovano nel protocollo scritto allegato.

Un volume totale di 25 millilitri di coltura batterica è sufficiente per inoculare circa 40-50 punti. Ora inizia il test infiltrando gli induttori PTI nei cerchi pre-marcati sulle foglie usando una siringa da un millilitro senza ago. Annota l'ordine in cui le piante sono state infiltrate e l'ora esatta in cui è iniziata l'infiltrazione dopo l'induzione.

Procedere all'inoculazione di provocazione diverse ore dopo l'inoculazione di induzione. Raccogliere i ceppi batterici necessari per l'inoculazione di provocazione, come precedentemente dimostrato per i ceppi di pseudomonas induttori. Anche in questo caso, misurare l'OD e regolare la concentrazione delle colture secondo il protocollo GR allegato.

Iniziare l'inoculazione di provocazione sette ore dopo l'infiltrazione dell'induttore. Utilizzare le seguenti combinazioni di sfidanti induttori. Scegli un punto alla periferia del primo cerchio di inoculazione come centro del secondo cerchio di inoculazione.

Eseguire l'infiltrazione di sfida nello stesso ordine di impianti in cui si verifica l'induzione. Se ci sono più macchie su una foglia, assicurati che le infiltrazioni non si sovrappongano. Infine, diluizione seriale su piastra di tutte le colture utilizzate nel saggio su piastre KBM o LB contenenti gli antibiotici appropriati.

Due giorni dopo l'inoculazione di provocazione, si può iniziare a valutare la risposta PTI due giorni dopo l'induzione e le inoculazioni di provocazione, cercare la comparsa di morte cellulare dovuta all'immunità attivata dall'effettore o ETI nei punti che sono stati sfidati con PST DC 3000 la morte cellulare all'interno dell'area di infiltrazione sovrapposta indica una rottura di PTI e dovrebbe essere valutata come fenotipo positivo quattro o cinque giorni dopo l'induzione e la provocazione le inoculazioni cercano la comparsa di morte cellulare dovuta alla malattia nei punti che sono stati sfidati con il mutante DC 3000 hop Q1 o PS di nuovo alto. Cerca la rottura del PTI che è indicata dalla morte cellulare dovuta alla malattia nell'area sovrapposta di infiltrazione. Continuare ad osservare le piante fino a quando quelle che non sono compromesse per PTI iniziano a mostrare la morte cellulare nell'area di sovrapposizione dell'infiltrazione.

Gli impianti silenziati per FLS due sono compromessi per PTI due giorni dopo l'inoculazione con la combinazione PFDC. La morte cellulare è osservata nell'area di sovrapposizione, indicando la rottura delle piante di controllo PTI che non sono state silenziate per nessun gene. Sono stati anche inoculati con la combinazione PFDC ed esaminati due giorni dopo aver condotto il test, la morte cellulare a causa della provocazione è stata osservata all'esterno ma non all'interno dell'area di sovrapposizione a causa di una normale risposta PTI.

Ti abbiamo appena mostrato come eseguire un test basato sulla morte cellulare per l'immunità innescata da pant o PTI durante l'esecuzione di questa procedura. È importante ricordarsi di mantenere le piante nelle condizioni ambientali che consigliamo. Livelli più elevati di umidità influenzerebbero negativamente le piante e farebbero procedere il saggio più rapidamente.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.