Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patosistema

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare quantitativamente la risposta immunitaria di Arabidopsis diliana attraverso un test di infiltrazione a siringa ottimizzato. Ciò si ottiene utilizzando prima l'infiltrazione a siringa per erogare manualmente i batteri nella foglia attraverso le aperture naturali chiamate sada. Il secondo passo consiste nell'ottenere dischi di tessuto fogliare infetto dopo lo sviluppo dei sintomi della malattia.

Successivamente, i batteri vengono estratti dai dischi fogliari attraverso l'omogeneizzazione ad alto rendimento. La fase finale è la diluizione seriale e l'individuazione su piastre di conteggio batterico per enumerare le colonie. In definitiva, la crescita batterica all'interno di ogni diss fogliare può essere correlata alla forza relativa della risposta immunitaria della pianta.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità delle piante, come l'identificazione dei geni che contribuiscono alle risposte di difesa contro lo stress biotico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che consente una quantificazione precisa della crescita dei patogeni nel tessuto vegetale infetto e aiuta a evitare errori sperimentali causati dal campionamento di foglie con stato di sviluppo variabile. Questo metodo può fornire informazioni sulla risposta immunitaria delle piante a un'infezione con un patogeno batterico virulento e può anche essere applicato ad altri sistemi come l'acido salicilico o i modelli molecolari associati ai microbi che hanno innescato risposte immunitarie.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a rilasciare i batteri nella foglia senza danneggiare i tessuti. A dimostrare la seguente procedura saranno studiosi indù post-dottorato e studenti laureati shalu e yali. Presto dal mio laboratorio, il test per una maggiore suscettibilità alla malattia sarà dimostrato in questo video.

Prima dell'esperimento, preparare le piastre di terreno King's B o KB, preparare un litro di terreno solido KB come descritto nel testo del protocollo e lasciarlo raffreddare su una piastra di agitazione magnetica. Quando il terreno si è raffreddato per toccare all'80% glicerolo, un molare di solfato di magnesio e streptomicina al terreno, versare due diverse dimensioni di piastre KB. La piastra di Petri più piccola funge da piastra primaria per la coltura dei batteri e la più grande piastra di Petri per animali domestici funge da piastra per il conteggio dei batteri.

Conservare le piastre a quattro gradi Celsius due giorni prima della serie di analisi. PSM ES 43 26. I batteri provengono da uno stock di glicerolo negativo a 80 gradi Celsius su una piastra di coltura per batteri streptococco KB e incubano a 28 gradi Celsius per 24-48 ore il giorno successivo.

Iniziare la coltura liquida in una provetta sterile con quattro millilitri di terreno kb liquido contenente 50 microgrammi per millilitro di streptomicina. Agitare una 250 giri/min a 28 gradi Celsius durante la notte. Le piante di Arabidopsis per l'esperimento vengono coltivate nelle condizioni descritte nel testo del protocollo lo stesso giorno in cui viene avviata la coltura batterica liquida.

Segna i petali delle foglie numero cinque e sei con un pennarello smussato e impermeabile per una facile identificazione del tessuto infetto al momento del campionamento. Per migliorare l'apertura di STA e facilitare l'ingresso della soluzione patogena nell'acqua fogliare. Le piante si piantano bene immergendo l'appartamento dal basso per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, scolare l'acqua in eccesso. Viene effettuata l'infezione delle piante di arabidopsis. Il giorno successivo all'inizio della coltura liquida.

Trasferire la coltura batterica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 9.600 g per due minuti. A temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico con un millilitro di cloruro di magnesio sterile da 10 millimolari, diluire la sospensione batterica con nove millilitri di cloruro di magnesio da 10 millimolari in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Dopo aver misurato la densità ottica dei batteri, diluire i batteri con 10 millimolari di cloruro di magnesio fino a un OD finale di 600 di 0,0002.

Per il test di infezione EDS. Per l'infiltrazione viene utilizzata una siringa senza ago con estremità smussata da un millilitro, comunemente nota come siringa da insulina. Riempire la siringa con 0,5-0,6 millilitri di soluzione batterica diluita per un controllo molto migliore durante il processo di infiltrazione, non riempire la siringa alla sua piena capacità.

Esporre la superficie inferiore della foglia sulla parte superiore del dito indice, quindi con l'aiuto del pollice, regolare delicatamente la posizione della foglia. Posizionare la siringa verticalmente contro la superficie fogliare per garantire una distribuzione uniforme della pressione e ridurre i danni alle foglie. Cerca di evitare l'area della nervatura centrale durante l'infiltrazione.

Spingere lentamente lo stantuffo per infiltrarsi nella soluzione batterica. L'ingresso del liquido nel mesofillo fogliare sarà visualizzato come indicato dal colore più scuro della foglia, si infiltrerà nell'intera superficie della foglia anche se richiede più tentativi. Una volta completata l'infiltrazione, tamponare delicatamente la foglia con un panno assorbente per rimuovere la soluzione patogena in eccesso.

Ispezionare visivamente il tessuto fogliare infetto per verificare che non sia danneggiato. Lasciare asciugare le piante infiltrate per una o due ore, riportare le piante alle loro condizioni di crescita originali. Spruzzare una cupola trasparente con acqua e coprire le piante infette per due ore.

Quindi rompi la cupola per generare un'apertura di due o tre pollici e lasciala accesa per tutto il resto dell'esperimento di infezione, che di solito è di tre giorni. Un giorno prima di quantificare la crescita del patogeno. Asciugare preventivamente le piastre di supporto KB da 150 mm x 15 mm.

Asciugate i piatti tenendoli a temperatura ambiente per circa 24 ore. Elaborare il tessuto infetto dopo l'emergere della sclerosi indicata dall'ingiallimento del tessuto infetto nei genotipi sensibili, ma prima dello sviluppo di lesioni necrotiche. Per ogni genotipo, preparare sei provette di macinazione.

Posizionare una sfera di macinazione in acciaio inossidabile e aggiungere 500 microlitri di cloruro di magnesio sterile da 10 millimolari in ciascun tubo. Quindi, stacca la foglia infetta dalla pianta e perfora un disco fogliare con un punzone di carta a un foro usando una pinza in modo casuale, posiziona due dischi fogliari di due piante diverse in ciascun tubo di macinazione. Sigillare le provette, omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore ad alta produttività alla massima velocità per 10 minuti.

Ripetere questo processo, se necessario, fino a quando il tessuto non è ben omogeneizzato e le soluzioni diventano verdi a causa del rilascio di clorofilla dalle foglie infette durante l'attesa. Per l'omogeneizzazione, riempire ogni pozzetto nelle prime sei file di una piastra di coltura a 96 pozzetti con 180 microlitri di cloruro di magnesio da 10 millimolari. Trasferire 20 microlitri di sospensione di tessuto macinato in ciascun pozzetto della prima fila della piastra a 96 pozzetti e mescolare pipettando ripetutamente il liquido su e giù.

Se piccoli frammenti di tessuto ostruiscono la punta, tagliarla di due o tre millimetri per aiutare ad acquisire il volume corretto della soluzione per fornire spazio sufficiente per la gocciolina sulla parte superiore della piastra, spazio il tessuto di diversi genotipi in file alternative. Per preparare una diluizione seriale decuplicata, trasferire 20 microlitri di sospensione tissutale nella seconda fila e ripetere questa procedura fino alla sesta diluizione. Utilizzando i puntali per pipette divisi, trasferire 20 microlitri di soluzione dalla piastra a parete 96 sulla piastra KB da 150 mm per 15 mm.

Lavorare dalla sospensione più diluita a quella più concentrata, in modo che non sia necessario sostituire i puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra. Asciugare il piatto a temperatura ambiente con il coperchio incrinato. Una volta che non si osserva più liquido sulla superficie della piastra, chiudere il coperchio e incubare la piastra a temperatura ambiente.

Incubare le piastre per 40-60 ore fino a quando le colonie diventano visibili. Conferma che i batteri sulle piastre riflettono il prevedibile decuplo. Calo delle unità formanti colonie.

Conta i batteri prima che crescano troppo e le colonie si fondano. Determinare il numero di batteri nella diluizione più bassa che non ha colonie sovrapposte. Di solito la diluizione preferita da contare conterrà tra le 10 e le 50 colonie, e può variare tra le repliche tecniche.

Per calcolare i livelli di proliferazione batterica, determinare il numero di unità formanti colonie per disco fogliare utilizzando questa formula dove R è il numero della fila e T è il numero dei batteri all'interno di ciascuna replica tecnica. I dati vengono quindi utilizzati per produrre un grafico. Ogni punto dati è rappresentato come la media di sei repliche tecniche su scala logaritmica.

Gli aerobar rappresentano l'intervallo di confidenza del 95% della media della malattia potenziata. La suscettibilità contro P-S-M-E-S 43 26 è stata valutata mediante infezione con un inoculo con un OD 600 di 0,0002. I risultati mostrano che i mutanti NPR one dash one altamente suscettibili hanno circa 2,5 log o 300 volte più crescita di agenti patogeni rispetto alle piante selvatiche Columbia zero.

Il test di infiltrazione con siringa può essere modificato per valutare diversi livelli di risposta immunitaria. Per valutare l'immunità attivata dall'acido salicilico, viene utilizzata l'applicazione esterna di salicilato di sodio per innescare la risposta immunitaria, che viene quantificata dalla crescita del patogeno. La perdita di NPR R one, che funziona come recettore dell'acido salicilico e la principale co-regolazione trascrizionale dei geni bersaglio dipendenti dall'acido salicilico, porta all'insensibilità all'applicazione esogena del derivato dell'acido salicilico.

Per caratterizzare l'immunità innescata dal pattern molecolare associato ai microbi, le piante sono state pretrattate con due trigger noti. FLAG 22 e L 18, le piante Columbia zero wild type trattate con FLAG 22 hanno sostenuto una riduzione di un log o 10 volte della popolazione batterica, mentre le due piante mutanti FLS non sono riuscite a innescare l'effetto di restrizione della crescita batterica. Allo stesso modo, le piante mutanti EFR erano insensibili al pretrattamento con L 18.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la risposta immunitaria dell'opsys arabo attraverso il test di infiltrazione della siringa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare lo sviluppo della malattia e di campionare il tessuto dopo l'insorgenza del corsis. Lo pseudomona pather cul cola S phos 3, 2, 6 è un patogeno emiatrofico.

Pertanto, il campionamento deve essere condotto prima della transizione allo stadio neurotrofico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi del sangue occidentale per rispondere a ulteriori domande, come quale particolare via di segnalazione immunitaria è disturbata. Non dimenticare che stai lavorando con batteri vivi.

Sebbene Pseudomona Senge non sia patogeno per l'uomo, ricordarsi di smaltire correttamente i materiali di consumo contaminati e le piante infette durante l'esecuzione di questa procedura.