Name: Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patosistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Impara a caratterizzare le risposte immunitarie delle piante con il saggio di infiltrazione batterica su Arabidopsis thaliana. Questo metodo ottimizzato consente la quantificazione precisa della crescita di Pseudomonas syringae.

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Ringraziamo il Dr. Shahid Mukhtar per aver criticato il manoscritto e il Dr. Xinnian Dong per il file di analisi dei dati campione. Questo lavoro è supportato da un premio NSF-CAREER (IOS-1350244) a KPM e al Dipartimento di Biologia dell'UAB.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con la diminuzione a disposizione terreni agricoli e l&#39;aumento della popolazione, i ricercatori di tutto il mondo sono sfidati con le esigenze urgenti per il miglioramento delle colture. Il rendimento può essere notevolmente influenzato da vari stress biotici e abiotici. Tra questi, l&#39;infezione patogeno è una delle principali cause di riduzione della resa delle colture, responsabile di circa il 12% delle perdite solo 45 negli Stati Uniti. Per risolvere questo problema, la ricerca massiccia è stata con...

A causa della loro natura, sessili, piante sono costantemente minacciati da una pletora di agenti patogeni che espongono diversi stili di vita e le strategie nutrizionali 1. In prima approssimazione, gli agenti patogeni biotrofici mantengono il loro ospite vivo per recuperare le sostanze nutritive, mentre agenti patogeni necrotrophic tossine attivamente segreti ed enzimi per uccidere tessuto ospite e nutrono le cellule morte 1. Un altro gruppo di agenti patogeni, hemibiotrophs chiamati, inizia il loro corso l&#39;infezione con il palco biotrofico e si sposta alla fase necrotrophic al raggiungimento di una certa soglia di accumulo patogeno 2. Al fine di difendersi efficacemente contro questi microrganismi, piante hanno sviluppato un complesso sistema immunitario innato dotato di molteplici meccanismi di sorveglianza per rilevare l&#39;attacco patogeno e innescare localizzato morte cellulare programmata 3 e sistemica la resistenza acquisita (SAR) 4. La ricerca attuale è focalizzata sulla caratterizzazione del sig essenzialenaling componenti e incrociati colloqui all&#39;interno del sistema immunitario pianta 5. Come proposto nel modello &quot;zigzag&quot; 5, il primo strato della risposta immunitaria innata pianta richiede la presenza di plasma-membrana localizzata Motivo recettori di riconoscimento (PRR) per rilevare l&#39;invasione di un microbo. PRR sono in grado di riconoscere i modelli Microbe-Associated Molecular (mAmps) e stabilire Immunità MAMP-Triggered (MTI) 6. Oltre ad indurre una upregulation trascrizionale di geni che codificano le proteine ​​PR antimicrobici 7, MTI porta ad una serie di eventi che arrestare la crescita dei patogeni, inclusa la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) e reattive di azoto specie (RNS), deposizione di callosio a parete cellulare nonché l&#39;attivazione della chinasi di segnalazione molteplici vie 8. Fino ad oggi, diversi piani di gestione pluriennali sono stati identificati per innescare MTI in Arabidopsis, compresi flg22 batterica 9 </sup&gt; (Un frammento di acido 22 aminoacidi derivato da flagellina), elf18 10 (18 aminoacidi dalla batterica fattore di allungamento Tu) e un componente strutturale della parete cellulare peptidoglicani 11. Per stabilire una infezione di successo, alcuni patogeni specializzate hanno sviluppato la capacità di proteine ​​effettrici virulenza segrete negli spazi intracellulari o intercellulari, e quindi reprimere MTI e innescare suscettibilità Effector-Triggered (ETS) 12,13. Ad esempio, effettori di virulenza possono inattivare proteine ​​Mitogen-chinasi attivata (MAPK) fosforilazione cascate di MTI per indurre lo sviluppo della malattia entro il tessuto infetto 14-16. Durante la co-evoluzione dinamica tra host e patogeni, piante anche sviluppato la strategia di contrattacco di riconoscere le proteine ​​effettrici e attenuare la virulenza patogeno molecole 17. Questo riconoscimento diretto o indiretto effettrici è mediata dalla resistenza alle malattie (R) 18 proteine. La maggior parte di torlo sono membri di NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricchi ripetizioni) della famiglia 19. La percezione di un effettore avirulent da una proteina R provoca una risposta più forte e più ampia immunitario caratterizzato come Immunità Effector-Triggered (ETI) 20. Oltre inducendo l&#39;espressione di geni di difesa 21 e la produzione di metaboliti difesa 22, ETI spesso porta ad una rapida morte cellulare programmata localizzata noto come Hypersensitive Response (HR) per limitare il patogeno di diffondersi nel tessuto adiacente 3. Oltre alla morte cellulare programmata localizzato 23, le piante sono in grado di avviare un lungo periodo e risposta immunitaria a livello di sistema denominato Systemic Acquired Resistance (SAR) 4. Su sfida con un agente patogeno biotrofico, cellule vegetali innescano la biosintesi e l&#39;accumulo di un phytohormone endogena acido salicilico (SA) e delle proteine ​​PR in entrambi i tessuti locali e sistemiche 24. Attraverso til suo processo, un elevato stato di preparazione si ottiene nelle foglie non infetti che consente il montaggio risposte di difesa veloce durante una successiva infezione da un ampio spettro di agenti patogeni 24. SA ed i suoi analoghi sintetici come benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic estere dell&#39;acido S-metil (BTH) e acido 2,6-dichloroisonicotinic (INA) sono in grado di indurre chimicamente acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI), su richiesta esterna 24. Nonexpressor di-Patogenesi correlati geni 1 (NPR1) si propone di essere uno dei recettori SA e funziona come un regolatore trascrizionale importante durante risposta di difesa SA-mediata sia nei tessuti locali e sistemiche 21,25,26. E &#39;stato definitivamente dimostrato che NPR1 è necessario per istituzione SAR e la perdita di NPR1 conduce alla drammatica suscettibilità verso Pseudomonas syringae 25. Per caratterizzare ampiamente il contributo molecolare della piantacomponenti nelle interazioni pianta-patogeno, molteplici test biologici sono stati sviluppati per misurare gli eventi di difesa specifici, tra cui i ROS scoppio 27, callosio di deposizione 28, espressione geni di difesa e l&#39;accumulo dei loro prodotti proteici 21. Mentre questi dosaggi individuali possono fornire intuizioni in una forma specifica della risposta immunitaria pianta, nessuno di essi, tuttavia, sono in grado di rappresentare la risposta di difesa completa sull&#39;intera livello di impianto. Al contrario, la quantificazione della crescita dei patogeni dopo l&#39;infezione fornisce una stima complessiva della risposta immunitaria a livello di organismi. Pertanto, lo sviluppo e l&#39;ottimizzazione di un preciso e altamente standardizzata saggio patogeno inoculazione è fondamentale per alimentare la ricerca e le scoperte sulle risposte immunitarie Arabidopsis. Pseudomonas syringae, un batterio Gram-negativi, è stato identificato come un phytopathogen in grado di causare la malattia in una vasta gamma di piante ospiti tra cui Arabidopsè 29. Poiché il sistema pianta-patogeno modello Arabidopsis - P. interazione syringae è stato ampiamente applicato per comprendere i meccanismi molecolari alla base della pianta risposte di difesa 29. Finora, oltre 50 P. patovar syringae sono stati identificati in base alla loro capacità di infettare diverse specie vegetali 30 . P. syringae pv. DC3000 pomodoro (Pst DC3000) 31 e P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sono i due ceppi virulenti più utilizzati e ampiamente caratterizzate. Oltre ad essere riconosciuto dalla pianta e innescando la risposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 sono in grado di secernere proteine ​​effettrici virulenti per sopprimere MTI e attivare ETS per favorire la crescita del 31,33 patogeno. Per sezionare funzionalmente l&#39;interazione tra Arabidopsis e P. syringae, multiplo0; metodi di infezione patogeni sono stati sviluppati sulla base del metodo di consegna patogeno. Per gli impianti di terreno coltivati, agente patogeno può essere trasportata da siringa infiltrazione, infiltrazione di vuoto, tuffo inoculazione e spruzzo inoculazione 29,34. Recentemente, piantina saggio alluvione-inoculazione è stato sviluppato per eseguire grandi schermi su colture di tessuti piastre-grown giovani piante di Arabidopsis 35. Siringa infiltrazione, come una delle soluzione più utilizzata, garantisce manualmente patogeno nel nell&#39;apoplasto attraverso le aperture dell&#39;anta naturale chiamati stomi 29. Attraverso questo approccio, gli importi uguali di P. syringae può essere infiltrato nella foglia infetta e la forza della risposta immunitaria pianta è inversamente correlato ai livelli di crescita dei patogeni. Pertanto, la quantificazione della crescita dei patogeni serve come un approccio ottimale per valutare la funzione immunitaria a livello di tutta la pianta. Inoltre, siringa infiltrazione può distinguere il tessuto locale e sistemica, che può be applicabile nel caratterizzare i meccanismi molecolari alla base SAR 36. Nel seguente protocollo, si descrive una siringa infiltrazione dosaggio ottimizzato con PSM ES4326 per lo screening mutanti di Arabidopsis per una maggiore suscettibilità alle malattie (EDS). Questo protocollo si avvarrà di due genotipi di Arabidopsis: una wild-type ecotipo Columbia-0 (Col-0) piante (controllo) e mutanti npr1-1 perdita di funzione (ipersensibili) che sarà infettato con ceppo batterico virulento Psm ES4326 37. Il mutante npr1-1 porta una mutazione puntiforme all&#39;interno della sequenza consenso ankyrin-repeat della molecola NPR1, che altera la istidina altamente conservata in tirosina e rende la proteina non funzionale 25. Inoltre, una serie di modifiche del dosaggio siringa infiltrazione sono descritte che consentono la quantificazione dei difetti negli strati specifici della risposta immunitaria, compresi MTI e STI.

<table><tbody><tr><td>MetroMix 360&nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>Vasi grandi</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 inserti</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Appartamenti senza fori</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Appartamenti con fori</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>Cupole di propagazione vinilica</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>Proteoso Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico triidrato&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 150 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>Piastra rettangolare</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 esaidrato</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bio Basic Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; </td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9992493&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di macinazione&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per la macinazione di tubi</td><td>Denville Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>Sfera di macinazione in acciaio inossidabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr> piastra <tr><td>a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>Salicilato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>Genescript</td><td>Su ordinazione</td><td></td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVVVGTIG)</td><td>Genescript</td><td>Su ordinazione</td><td></td></tr><tr><td>Perforatrice</td><td>Graffette</td><td>146308</td><td></td></tr><tr><td>Biofotometro plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad alta produttività 952000006 PowerGen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga a rotazione acustica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale (10-100 &; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale (30-300 &; micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta (20&micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pennarello indelebile Sharpie</td><td>Staples</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

batterica leaf infiltrazione assay per fine caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae</em&gt; patosistema

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In assenza di cellule immunitarie specializzate mobili, piante utilizzano il loro localizzata morte cellulare programmata e Sistemica resistenza acquisita per difendersi contro l&#39;attacco patogeno. Il contributo di uno specifico gene Arabidopsis per la risposta immunitaria impianto complessivo può essere specifico e quantitativamente valutata analizzando la crescita dei patogeni all&#39;interno del tessuto infetto. Per oltre tre decenni, il batterio Pseudomonas syringae pv hemibiotrophic. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) è stato ampiamente applicato come modello patogeno per studiare i meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria Arabidopsis. Per offrire patogeni nel tessuto foglia, sono stabilite diversi metodi di inoculazione, ad esempio, la siringa infiltrazione, tuffo inoculazione, spray, infiltrazione vuoto e inondazioni inoculazione. Il protocollo che segue descrive un metodo siringa infiltrazione ottimizzato per fornire virulenta Psm ES4326 in foglie di adultisuolo coltivato piante di Arabidopsis e schermo per una migliore precisione predisposizione alle malattie (EDS) nei confronti di questo patogeno. Inoltre, questo protocollo può essere integrato con più pre-trattamenti per sezionare ulteriormente specifici difetti immunitari all&#39;interno di diversi livelli di difesa vegetale, compresi l&#39;acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI) e Immunità MAMP-Triggered (MTI).

Il protocollo che descriviamo qui rappresenta un P. ottimizzata syringae assay siringa infiltrazione per valutare quantitativamente la risposta immunitaria in piante di Arabidopsis. Come illustrato nella figura 1, l&#39;infiltrazione siringa Psm ES4326 è seguita da estrazione patogeno e quantificazione mediante diluizioni seriali e colonie enumerazione. Come descritto al punto 3 nel testo protocollo Enhanced Malattia susce...

La quantificazione della crescita dei patogeni è un potente strumento per caratterizzare varie risposte immunitarie di Arabidopsis thaliana (di seguito: Arabidopsis). Il metodo qui descritto presenta un saggio di infiltrazione a siringa ottimizzato per quantificare il pv di Pseudomonas syringae. maculicola ES4326 crescita nelle foglie adulte di Arabidopsis.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare quantitativamente la risposta immunitaria di Arabidopsis diliana mediante un saggio di infiltrazione con siringa ottimizzato. Questo viene raggiunto innanzitutto utilizzando l'infiltrazione con siringa per somministrare manualmente batteri nella foglia attraverso le aperture naturali chiamate sada. Il secondo passaggio consiste nell'ottenere dischetti di tessuto fogliare infetto dopo lo sviluppo dei sintomi della malattia.Successivamente, i batteri vengono estratti dai dischetti fogliari mediante omogeneizzazione ad alto rendimento. L'ultimo passaggio consiste nella diluizione in serie e nell'allestimento su piastre per il conteggio batterico al fine di enumerare le colonie. In definitiva, la crescita batterica all'interno di ciascun disco fogliare può essere correlata all'intensità relativa della risposta immunitaria della pianta.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunità vegetale, ad esempio identificando geni che partecipano alle risposte difensive contro lo stress biotico. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente una quantificazione precisa della crescita del patogeno nel tessuto vegetale infetto, aiutando a evitare errori sperimentali dovuti al campionamento di foglie con stato di sviluppo diverso. Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte immunitarie vegetali a un'infezione causata da un patogeno batterico virulento, ed è applicabile anche ad altri sistemi, come le risposte immunitarie innescate da acido salicilico o da pattern molecolari associati a microrganismi.Generalmente, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà a inoculare i batteri nella foglia senza causare danni al tessuto. La procedura seguente sarà dimostrata dalla ricercatrice postdottoranda Hindu e dalle studentesse universitarie Shalu e Yali. Presto dal mio laboratorio, nel presente video verrà illustrato il saggio per la valutazione della maggiore suscettibilità alla malattia.Prima dell'esperimento, preparare le piastre con terreno King's B o KB: preparare un litro di terreno solido KB come descritto nel testo del protocollo e lasciarlo raffreddare su un agitatore magnetico. Quando il terreno ha raggiunto una temperatura tiepida al tatto, aggiungere glicerolo all'80%, solfato di magnesio uno molare e streptomicina al terreno, quindi versare il terreno in due piastre KB di dimensioni diverse. La piastra di Petri più piccola funge da piastra principale per la coltura batterica, mentre quella più grande funge da piastra per il conteggio dei batteri.Conservare le piastre a quattro gradi Celsius per due giorni prima dell'inoculo per saggio. PSM ES 43 26. Prelevare batteri da una coltura su piastra KB strep partendo da un ceppo batterico conservato a meno 80 gradi Celsius in glicerolo e incubare a 28 gradi Celsius per 24-48 ore il giorno successivo.Avviare la coltura liquida in un tubo sterile con quattro millilitri di mezzo liquido KB contenente 50 microgrammi per millilitro di streptomicina. Agitare a 250 giri al minuto a 28 gradi Celsius per tutta la notte. Le piante di Arabidopsis per l'esperimento vengono coltivate in condizioni descritte nel testo del protocollo nello stesso giorno in cui viene avviata la coltura batterica liquida.Contrassegnare i petali delle foglie numero cinque e sei con un pennarello opaco e impermeabile per facilitare l'identificazione del tessuto infetto al momento del campionamento. Per favorire l'apertura degli stomi e facilitare l'ingresso della soluzione patogena nell'acqua fogliare, innaffiare bene le piante immergendo il contenitore dalla base per 20 minuti.Dopo 20 minuti, eliminare l'acqua in eccesso. Viene effettuata l'infezione delle piante di arabidopsis. Il giorno successivo all'avvio della coltura liquida.Trasferire la coltura batterica in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 9.600 g per due minuti. A temperatura ambiente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet batterico con un millilitro di cloruro di magnesio sterile a 10 millimolare; diluire la sospensione batterica con nove millilitri di cloruro di magnesio a 10 millimolare in una provetta centrifuga da 50 millilitri. Dopo aver misurato la densità ottica dei batteri, diluire i batteri con cloruro di magnesio a 10 millimolare fino a un valore finale di OD 600 pari a 0,0002.Per il saggio di infezione da EDS. Viene utilizzata una siringa da un millilitro con ago bluntopunta senza ago, comunemente nota come siringa per insulina, per l'infiltrazione. Riempire la siringa con 0,5-0,6 millilitri della soluzione batterica diluita per un controllo molto migliore durante il processo di infiltrazione; non riempire la siringa alla sua capacità massima.Esponi la superficie inferiore della foglia sulla parte superiore del dito indice, quindi, con l'aiuto del pollice, regola delicatamente la posizione della foglia. Posiziona la siringa verticalmente contro la superficie della foglia per garantire una distribuzione uniforme della pressione e ridurre i danni alla foglia. Cerca di evitare l'area della nervatura centrale durante l'infiltrazione.Spingere lentamente lo stantuffo per infiltrare la soluzione batterica. L'ingresso del liquido nel mesofillo fogliare sarà visibile grazie al colore più scuro della foglia; infiltrare l'intera superficie della foglia anche se ciò richiede più tentativi. Al termine dell'infiltrazione, asciugare delicatamente la foglia con carta assorbente per rimuovere l'eccesso di soluzione patogena.Ispezionare visivamente il tessuto fogliare infetto per verificare eventuali danni. Lasciare le piante infiltrate asciugare per uno o due ore, quindi riposizionarle nelle loro condizioni di crescita originali. Spruzzare con acqua una cupola trasparente e coprire le piante infette per due ore.Quindi rompere la cupola per creare un'apertura di due o tre pollici e lasciarla aperta per il resto dell'esperimento di infezione, che di solito dura tre giorni. Un giorno prima di quantificare la crescita del patogeno, preriscaldare le piastre di terreno KB di dimensioni 150 millimetri per 15 millimetri.Asciugare le piastre mantenendole a temperatura ambiente per circa 24 ore. Elaborare il tessuto infetto dopo la comparsa della sclerosi, indicata dall'ingiallimento del tessuto infetto nei genotipi suscettibili, ma prima dello sviluppo di lesioni necrotiche. Per ogni genotipo, preparare sei tubi da macero.Posizionare una sfera di acciaio inox e aggiungere 500 microlitri di cloruro di magnesio sterile 10 millimolare in ciascun tubo. Successivamente, staccare la foglia infetta dalla pianta ed estrarre un disco fogliare con un perforatore a un foro, utilizzando pinzette in modo casuale; inserire due dischi fogliari provenienti da due piante diverse in ciascun tubo di macerazione. Chiudere ermeticamente i tubi ed omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore ad alto rendimento alla velocità massima per 10 minuti.Ripetere questo processo se necessario fino a quando il tessuto non è ben omogeneizzato e le soluzioni diventano verdi a causa del rilascio di clorofilla dalle foglie infette durante l'attesa. Per l'omogeneizzazione, riempire ogni pozzetto delle prime sei righe di una piastra da coltura a 96 pozzetti con 180 microlitri di cloruro di magnesio 10 millimolare. Trasferire 20 microlitri della sospensione di tessuto macinato in ciascun pozzetto della prima riga della piastra a 96 pozzetti e mescolare aspirando e dispensando ripetutamente il liquido con una pipetta.Se piccoli frammenti di tessuto ostruiscono la punta, tagliarne via due o tre millimetri per facilitare l'acquisizione del volume corretto della soluzione, in modo da garantire spazio sufficiente per la goccia nella parte superiore della piastra; posizionare i tessuti di genotipi diversi in righe alternative. Per preparare una diluizione seriale decimale, trasferire 20 microlitri di sospensione di tessuto nella seconda riga e ripetere questa procedura fino alla sesta diluizione. Utilizzando punte di pipetta divise, trasferire 20 microlitri della soluzione dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra KB di 150 millimetri per 15 millimetri.Lavorare partendo dalla sospensione più diluita fino a quella più concentrata, in modo da non dover cambiare i puntali della pipetta tra una diluizione e l'altra. Far asciugare la piastra a temperatura ambiente con il coperchio leggermente aperto. Una volta che non si osserva più liquido sulla superficie della piastra, chiudere il coperchio, capovolgere la piastra e incubarla a temperatura ambiente.Incubare le piastre da 40 a 60 ore fino a quando le colonie diventano visibili. Verificare che i batteri sulle piastre riflettano la prevedibile diminuzione logaritmica di dieci volte nelle unità formanti colonie.Conta i batteri prima che crescano eccessivamente e le colonie si fondano. Determina il numero di batteri nella diluizione più bassa che non presenta colonie sovrapposte. Di solito, la diluizione preferita da contare conterrà tra 10 e 50 colonie, e può variare tra replicati tecnici.Per calcolare i livelli di proliferazione batterica, determinare il numero di unità formanti colonie per disco fogliare utilizzando questa formula, in cui R è il numero della riga e T è il numero di batteri all'interno di ciascun replicato tecnico. I dati vengono quindi utilizzati per produrre un grafico. Ogni punto dati è rappresentato come media di sei replicati tecnici su scala logaritmica.I barretti aerobici rappresentano l'intervallo di confidenza del 95% della media del danno da malattia potenziato. La suscettibilità nei confronti di P-S-M-E-S 43 26 è stata valutata mediante infezione con un inocolo avente un OD 600 di 0,0002. I risultati mostrano che i mutanti altamente suscettibili NPR one dash one presentano una crescita del patogeno di circa 2,5 log, ovvero 300 volte maggiore rispetto alle piante di tipo selvatico Columbia zero.L'assay di infiltrazione con siringa può essere modificato per valutare diversi strati della risposta immunitaria. Per valutare l'immunità indotta dall'acido salicilico, viene utilizzata l'applicazione esterna di salicilato di sodio per attivare la risposta immunitaria, la quale viene quantificata attraverso la crescita del patogeno. La perdita di NPR1, che funge da recettore dell'acido salicilico e principale co-regolatore trascrizionale dei geni bersaglio dipendenti dall'acido salicilico, porta a insensibilità all'applicazione esogena del derivato dell'acido salicilico.Per caratterizzare l'immunità innescata dai pattern molecolari associati ai microrganismi, le piante sono state pretrattate con due induttori noti. Le piante selvatiche Columbia zero trattate con FLAG 22 hanno mostrato una riduzione di un logaritmo, ovvero 10 volte, nella popolazione batterica, mentre le piante mutanti FLS due non sono state in grado di innescare l'effetto di restrizione della crescita batterica. Analogamente, le piante mutanti EFR si sono dimostrate insensibili al pretrattamento con L 18.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la risposta immunitaria di Arabidopsis mediante il saggio di infiltrazione con siringa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare lo sviluppo della malattia e prelevare il tessuto dopo la comparsa dei sintomi. Pseudomonas pathovar tomato DC3000 è un patogeno emibiotrofico.Pertanto, il campionamento deve essere effettuato prima della transizione nella fase neurotrofica. Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi ematica Western possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quale specifico percorso di segnalazione immunitaria sia alterato. Non dimenticare che stai lavorando con batteri viventi.Sebbene Pseudomona Senge non sia patogeno per l'uomo, si prega di ricordare di smaltire correttamente i materiali monouso contaminati e le piante infette durante l'esecuzione di questa procedura.

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