Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare il segnale di localizzazione dei plasmodesmi nelle proteine bersaglio. Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave con lo studio delle connessioni intercellulari delle piante, identificando il pensiero critico nei segnali che dirigono le proteine verso i plasmodesmi, che a loro volta facilitano il trasporto da cellula a cellula di grandi molecole. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la procedura è affidabile e può essere facilmente adattata per la scoperta di sequenze di segnale di localizzazione dei plasmodesmi nella maggior parte delle proteine mirate ai plasmodesmi.

La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale in quanto la semina, la filtrazione e la preparazione per le fasi di osservazione confocale sono difficili da apprendere con la tipica pubblicazione cartacea. Pianta i semi di Nicotiana benthamiana in terreno umido e ad alta densità. Durante la crescita, tenerli in una camera ambientale controllata a 20-25 gradi Celsius e meno di 16 ore di luce al giorno, che contiene circa 75 micromoli di fotoni per metro quadrato al secondo.

Dopo che il diametro dell'u. fil raggiunge il mezzo centimetro, trasferisci con cura le piantine in vasi più grandi e continua la loro crescita nella stessa camera nelle stesse condizioni. Mantieni le piante fino a quando non raggiungono lo stadio di quattro-otto foglie entro quattro settimane.

A questo punto, le foglie più grandi dovrebbero avere un diametro compreso tra quattro e sei centimetri. Per una facile identificazione e analisi, scegliere un sistema di espressione e marcare in modo fluorescente ogni proteina espressa come descritto nel protocollo di testo allegato. Preparare un plasmide a base di pPZP-RCS2 come descritto e aggiungerne un microgrammo in una coltura da 100 microlitri di cellule competenti di Agrobacterium tumefaciens.

Incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, congelare le cellule in azoto liquido per un minuto. Quindi, scaldare le celle a 28 gradi Celsius per 15 minuti e poi aggiungere un millilitro di LB di terreno alla miscela di celle competente.

Dopo aver aggiunto il mezzo LB, riposizionare le celle a 28 gradi Celsius per due ore. Quindi, centrifuga le celle a 3.000 volte G per un minuto. Risospendere il pellet cellulare in 0,2 millilitri di terreno LB e piastrarli su piastre di agar LB selettive per antibiotici.

Far crescere le cellule sulle piastre a 28 gradi Celsius per 48 ore fino a quando le singole colonie sono visibili. Quindi, raccogliere e impiattare diverse colonie individuali su piastre fresche di agar LB e far crescere le cellule a 28 gradi Celsius per 48 ore. Successivamente, prelevare una piccola quantità di batteri da ciascuna piastra per l'analisi e utilizzare la Colony PCR per confermare la presenza dei costrutti binari specifici di interesse.

Aggiungere ogni colonia di agrobatterio con il costrutto di interesse a cinque millilitri di terreno LB integrato con gli antibiotici appropriati. Far crescere le cellule durante la notte a 28 gradi Celsius. Quindi, centrifugare le celle a 3.000 volte G.Risospendere il pellet a un OD600 di 0,5 in tampone di agroinfiltrazione.

Incubare la sospensione per due ore a temperatura ambiente e quindi caricare l'inoculo in una siringa di plastica da un millilitro. Tenendo una foglia di N.Benthamiana completamente matura con un dito guantato sulla faccia adassiale, premere l'ugello della siringa contro l'epidermide inferiore della foglia. Quindi, introdurre lentamente l'agrobatterio nel mezzo di infiltrazione iniettando il terreno.

Mantenere la pianta infiltrata fino a quando non deve essere osservata. Usa una lama per tagliare ogni foglia in frammenti tra le vene da 24 a 48 ore dopo l'infiltrazione. Posizionare le fette di foglia sullo scivolo dell'oggetto con la superficie abassiale della foglia rivolta verso l'alto.

Quindi, mettere una goccia d'acqua sulla fetta di foglia e coprirla con il vetro di copertura. Immobilizzare il vetro di copertura con piccoli pezzi di nastro adesivo su ciascun lato. Trasferire un vetrino sotto un microscopio confocale a scansione laser e utilizzare una lente soggettiva 10X per identificare le cellule con il segnale migliore.

Quindi, utilizzare un obiettivo soggettivo 63X per registrare le immagini e ottenere osservazioni più dettagliate. Inoltre, utilizzare le lampade fluorescenti appropriate per eccitare le proteine fluorescenti espresse. Mantenere tutte le impostazioni utilizzate per l'acquisizione delle immagini per mantenere la coerenza tra gli esperimenti.

In media, esaminare da 100 a 120 cellule per ogni condizione sperimentale. Diagnosticare la localizzazione delle proteine testate utilizzando le immagini del microscopio confocale. Queste immagini illustrano i caratteristici modelli di localizzazione dei plasmodesmi puntati periferici osservati per la proteina di movimento TMV a lunghezza intera fusa alla molecola cargo CFP, e per il segnale di localizzazione dei plasmodesmi identificato fuso a CFP, nonché per la proteina di localizzazione dei plasmodesmi co-espressa, PDCB1 fusa a DsRed.

In condizioni di controllo, il targeting dei plasmodesmi della proteina di movimento TMV a lunghezza intera fusa a CFP e il segnale di localizzazione nella proteina di movimento TMV fusa a CFP, appare come mostrato qui con la localizzazione subcellulare di CFP e la localizzazione nucleocitoplasmatica del marcatore DsRed2. Quando il quarto amminoacido, la valina, viene mutato in alanina, il targeting dei plasmodesmi sia da parte della proteina di movimento TMV a lunghezza intera che del segnale di localizzazione identificato nella proteina di movimento TMV viene perso. Ciò indica che questo residuo è importante per la struttura o la funzione del segnale di localizzazione dei plasmodesmi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 50 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le piante sono in condizioni molto sane e che le piante siano allo stadio fogliare giusto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione non solo di come identificare il segnale proteico di localizzazione dei plasmodesmi, ma anche di sapere come identificare altri segnali nelle proteine vegetali.