Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

L'obiettivo generale di questo procedimento è identificare il segnale di localizzazione nei plasmodesmi nelle proteine bersaglio. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio delle connessioni intercellulari delle piante, identificando i segnali chiave che indirizzano le proteine ai plasmodesmi, facilitando così il trasporto da cellula a cellula di molecole di grandi dimensioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il procedimento è affidabile e può essere facilmente adattato per scoprire sequenze di segnali di localizzazione nei plasmodesmi nella maggior parte delle proteine dirette ai plasmodesmi.

La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di filtrazione delle piante e di preparazione per l'osservazione confocale sono difficili da apprendere tramite pubblicazioni tradizionali su carta. Piantare i semi di Nicotiana benthamiana in terreno umido e con alta densità. Durante la crescita, mantenerli in una camera ambientale controllata a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius e con 16 ore di luce al giorno, corrispondente a circa 75 micromole di fotoni al metro quadrato al secondo.

Una volta che il diametro della u. fil raggiunge mezzo centimetro, trasferire con attenzione le piantine in vasi più grandi e proseguire la loro crescita nella stessa camera e nelle stesse condizioni. Mantenere le piante fino a quando raggiungono lo stadio di quattro-otto foglie entro quattro settimane.

A questo punto, le foglie più grandi dovrebbero avere un diametro compreso tra quattro e sei centimetri. Per un'agevole identificazione e analisi, scegliere un sistema di espressione ed etichettare fluoroscopicamente ciascuna proteina espressa come descritto nel protocollo testuale allegato. Preparare un plasmide basato su pPZP-RCS2 come descritto e aggiungere un microgrammo di esso in una coltura di 100 microlitri di cellule competenti di Agrobacterium tumefaciens.

Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, congelare rapidamente le cellule in azoto liquido per un minuto. Poi, riscaldare le cellule a 28 gradi Celsius per 15 minuti e aggiungere un millilitro di mezzo LB alla miscela di cellule competenti.

Dopo aver aggiunto il mezzo LB, riposizionare le cellule a 28 gradi Celsius per due ore. Successivamente, centrifugare le cellule a 3.000 ×g per un minuto. Risospendere il pellet cellulare in 0,2 millilitri di mezzo LB e piastrarle su piastre di agar LB selettivo con antibiotico.

Coltivare le cellule sulle piastre a 28 gradi Celsius per 48 ore fino a quando non risultano visibili colonie singole. Successivamente, selezionare e seminare diverse colonie singole su piastre fresche di agar LB e coltivare le cellule a 28 gradi Celsius per 48 ore. Poi, prelevare una piccola quantità di batteri da ciascuna piastra per l'analisi e utilizzare la PCR su colonia per confermare la presenza dei costrutti binari specifici di interesse.

Aggiungere ogni colonia di agrobatterio contenente il costrutto di interesse a cinque millilitri di mezzo LB integrato con gli antibiotici appropriati. Far crescere le cellule per tutta la notte a 28 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare le cellule a 3.000 × g. Ri-sospendere il pellet a un OD600 di 0,5 in tampone per agroinfiltrazione.

Incubare la sospensione per due ore a temperatura ambiente, quindi caricare l'inoculo in una siringa di plastica da un millilitro. Tenendo una foglia completamente matura di N.Benthamiana con un dito guantato sulla faccia adassiale, premere la punta della siringa contro l'epidermide inferiore della foglia. Quindi, introdurre lentamente l'agrobatterio nel mezzo di infiltrazione iniettando il mezzo.

Mantenere la pianta infiltrata fino al momento dell'osservazione. Utilizzare una lama per tagliare ogni foglia in frammenti tra le vene da 24 a 48 ore dopo l'infiltrazione. Posizionare le fette di foglia sul vetrino con la superficie abassiale della foglia rivolta verso l'alto.

Quindi, posizionare una goccia d'acqua sulla sezione della foglia e coprirla con il vetrino da copertura. Immobilizzare il vetrino da copertura con piccoli pezzi di nastro adesivo su ciascun lato. Trasferire un vetrino sotto un microscopio confocale a scansione laser e utilizzare un obiettivo soggettivo da 10X per identificare le cellule con il segnale migliore.

Quindi, utilizzare un obiettivo soggettivo 63X per acquisire immagini destinate a osservazioni più dettagliate. Inoltre, utilizzare i fluorescenziali appropriati per eccitare le proteine fluorescenti espresse. Mantenere tutte le impostazioni utilizzate per l'acquisizione delle immagini al fine di garantire coerenza tra gli esperimenti.

In media, esaminare da 100 a 120 cellule per ogni condizione sperimentale. Diagnosticare la localizzazione delle proteine testate utilizzando le immagini ottenute con il microscopio confocale. Queste immagini illustrano i caratteristici pattern di localizzazione periferici puntiformi ai plasmodesmi osservati per la proteina di movimento del TMV a lunghezza intera fusa alla molecola indicatore CFP, per il segnale di localizzazione ai plasmodesmi identificato fuso a CFP, nonché per la proteina di localizzazione ai plasmodesmi espressa in co-espressione, PDCB1 fusa a DsRed.

In condizioni di controllo, il targeting ai plasmodesmi della proteina di movimento completa del TMV fusa alla CFP e del segnale di localizzazione nella proteina di movimento del TMV fusa alla CFP appare come mostrato qui, con localizzazione subcellulare della CFP e localizzazione nucleocitoplasmatica del marcatore DsRed2. Quando il quarto aminoacido, valina, viene mutato in alanina, il targeting ai plasmodesmi sia della proteina di movimento completa del TMV sia del segnale di localizzazione identificato nella proteina di movimento del TMV viene perso. Ciò indica che questo residuo è importante per la struttura o la funzione del segnale di localizzazione ai plasmodesmi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 50 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le piante in condizioni molto sane e al giusto stadio fogliare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione non solo di come identificare il segnale della proteina localizzata nei plasmodesmi, ma anche di come riconoscere altri segnali specifici nelle proteine vegetali.