Name: Cryotomography elettrone di cellule batteriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Scopri la criotomografia elettronica per visualizzare l'ultrastruttura cellulare batterica con risoluzione macromolecolare. Impara le tecniche di congelamento rapido e ricostruzione 3D per studi di biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Borse Salute AI067548 R01, R01 GM081520, GM086200 R01, R01 AI049194 e P01 GM066521 a GJJ così come l&#39;Howard Hughes Medical Institute, l&#39;Istituto Beckman al Caltech, e doni a Caltech dal Gordon and Betty Moore Foundation e Agouron Institute. MSL è supportato dal NIH concedere 2R37-A1041239-06A1 di Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc. gentilmente messo a disposizione contenuti video della collezione cryosection. I risultati rappresentativi della presenza di Treponema primitia sono stati raccolti e trattati da Gavin E. Murphy, e pubblicato in Microbiologia molecolare con il titolo &quot;Novel ultrastrutture della presenza di Treponema primitia e delle loro implicazioni per la motilità&quot;. (Murphy, G. et al. Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mostriamo in questo articolo video di come fare ECT di cellule batteriche. Limitato da spazio e tempo, mostriamo solo il protocollo generale. Maggiori dettagli possono essere trovati nei documenti, informazioni on-line o altre informazioni fornite dal produttori di apparecchiature e sviluppatori di software, e da gruppi di ricerca ECT. A seconda delle diverse specie batteriche studiate, le attrezzature utilizzate e l&#39;interesse nelle cellule, il protocollo ed i parametri sperimentali devono essere testati e ottimizzati.

<table><tbody><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>soluzione 0,1%</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colloidale d'oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Carta filtro n. 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, PM 39000</td></tr><tr><td>Piastrina in ottone con cupola</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelatore ad alta pressione Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criomicrotomo ultracro Cryo-ultra microtome UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliente criogenico in diamante 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionizzatore Static line II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitore criogenico CX100</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stazione di carico MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Personalizzato</td></tr><tr><td>Portacampioni criogenico per microscopio ottico</td><td>FEI</td><td></td><td>Personalizzato</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Con UltraCam di Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryotomography elettrone di cellule batteriche

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Mentre molto è già noto circa il metabolismo di base delle cellule batteriche, molte questioni fondamentali sono ancora senza risposta sorprendentemente, tra cui per esempio il modo in cui generare e mantenere forme cella specifica, stabilire la polarità, segregare i loro genomi, e dividere. Per capire questi fenomeni, sono necessarie tecnologie di imaging che colmare il divario risoluzione tra luce e microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione metodi come la cristallografia a raggi X e spettroscopia NMR. Electron cryotomography (ECT) è una tecnologia emergente che fa proprio questo, che consente l&#39;ultrastruttura delle cellule da visualizzare in un quasi-stato nativo, in tre dimensioni (3D), con risoluzione &quot;macromolecolari&quot; (~ 4 Nm). 1, 2 In ECT, le cellule vengono esposte in un vitreo, stato &quot;congelato-idratata&quot; in un microscopio elettronico a trasmissione crio (cryoTEM) a bassa temperatura (&lt;-180 ° C). Per le celle sottili (fino a ~ 500 nm di spessore 3), le cellule sono intatte tuffo congelati all&#39;interno dei media di tutto EM griglie in criogeni come etano o etano / propano miscele. Cellule più spesse e biofilm può anche essere ripreso in uno stato vetroso in primo luogo &quot;ad alta pressione congelamento&quot; e poi, &quot;crio-sezionamento&quot; loro. Una serie di immagini bidimensionali proiezione vengono poi raccolti attraverso il campione in modo incrementale in quanto è inclinato lungo uno o due assi. Una ricostruzione tridimensionale, o &quot;tomogramma&quot; può essere calcolata dalle immagini. Mentre ECT richiede una strumentazione costosa, negli ultimi anni, è stato utilizzato in un paio di laboratori per scoprire le strutture delle varie appendici esterne, le strutture di buste cellulari diversi, le posizioni e le strutture di filamenti del citoscheletro, e le posizioni e le architetture dei grandi macromolecolari assemblee come motori flagellare, scomparti interni e array chemiorecettori. 1, 2 In questo articolo video che illustra come celle di immagine con ECT, compresi i processi di preparazione del campione, raccolta dei dati, la ricostruzione tomogramma, e l&#39;interpretazione dei risultati attraverso la segmentazione e in alcuni casi di correlazione con il microscopio ottico.

Illustriamo qui come utilizzare elettroni cryotomography (ECT) per studiare l&#39;ultrastruttura delle cellule batteriche in quasi native stati, a &quot;macromolecolari&quot; (~ 4 nm) risoluzione.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

Sebbene sia già noto molto sul metabolismo di base delle cellule batteriche, molte domande fondamentali rimangono sorprendentemente senza risposta, incluse quelle relative a...

In questo video, vengono generate immagini 3D di cellule batteriche in stati quasi nativi a risoluzione molecolare mediante tomografia crioelettronica. Questo risultato si ottiene innanzitutto con il congelamento rapido di cellule intatte, oppure con il congelamento ad alta pressione e la criosezionatura dei pellet cellulari. Viene acquisita una serie di M immagini di proiezione, utilizzate per generare una ricostruzione tridimensionale, o Tom Graham, che viene quindi segmentata e analizzata ulteriormente mediante elaborazione computazionale.Ciao, sono Grant Jensen della Divisione di Biologia del Caltech, e questa è Sonya Chen che ha organizzato la nostra presentazione. Oggi vi mostreremo come eseguire la tomografia crioelettronica di cellule batteriche. Tipicamente, un singolo individuo esegue l'intera procedura, ma poiché i nostri protocolli sono stati sviluppati attraverso un'esperienza condivisa, includeremo tutte le persone attualmente impegnate in laboratorio.Oltre a Sonya e me nel video, vedrete Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky e Jen. Altri membri del laboratorio hanno prodotto le immagini catturate dagli schermi dei computer e hanno contribuito a preparare il protocollo scritto allegato, tra cui Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova e Dylan Morris. Ariana inizierà mostrandovi come effettuiamo la congelazione rapida per immersione delle cellule batteriche.Per cellule batteriche sottili, una sospensione di cellule integre viene congelata rapidamente su una griglia per microscopia elettronica. Qui il processo viene dimostrato utilizzando un congelatore automatico commerciale: iniziare esaminando le colture batteriche per assicurarsi che siano prive di contaminanti e che abbiano una confluenza o concentrazione appropriata. Sottoporre la griglia per ME rivestita di carbonio a scarica al glow per due-quattro minuti. Successivamente, mescolare 100 microlitri di soluzione di oro colloidale con 25 microlitri di una soluzione di BSA al 5%.Centrifugare la miscela a 18.000 G per 15 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet d'oro. In 20 microlitri di soluzione cellulare, posizionare la griglia per microscopia elettronica nel Vitra bot all'umidità al 100%.Quindi applicare quattro microlitri della miscela cellulare sulla griglia EM trattata con glow discharge. La griglia viene automaticamente asciugata su entrambi i lati con carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso, quindi immersa rapidamente in una miscela liquida di etano e propano, raffreddata con azoto liquido. Rimuovere con attenzione la griglia dalla miscela di etano e propano e trasferirla rapidamente in una scatola per il deposito di griglie mantenuta sotto azoto liquido. Per cellule più spesse, il congelamento ad alta pressione impedisce la cristallizzazione del ghiaccio.Il successivo taglio criostatico rende i campioni abbastanza sottili per la microscopia elettronica. L'acquisizione delle immagini inizia centrifugando 15 millilitri di cellule a 1000 giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e mescolare 0,5 millilitri del pellet cellulare residuo con 0,5 millilitri di crioprotettante al 20% di destrina.Quindi centrifugare nuovamente a 13.000 RPM per 15 secondi. Dopo che le cellule sono state pellettizzate, rimuovere il sopernatante e pipettare 0,1 millilitro della pasta del pellet superiore in una punta di pipetta microcentrifugata sigillata a caldo, che contiene già 0,2 millilitri di crioprotettante al 20% di destrina. Centrifugare la miscela nella punta di pipetta microcentrifugata a 13.000 RPM per 30 secondi.Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante. Si osserva un pellet compatto di cinque-dieci microlitri alla punta sigillata. Trasferire la pasta su una delle due cupole di una piastrina bombata in ottone rivestita di Teflon già montata sul braccio del portacampioni del congelatore ad alta pressione, quindi sigillarla con il suo cappuccio piatto in ottone abbinato.Quindi inserire immediatamente l'assale nel congelatore ad alta pressione preparato. A una pressione di 2100 bar, l'unità combinata in ottone contenente le cellule viene rapidamente raffreddata da un getto di azoto liquido ad alta pressione. Dopo che le cellule sono state raffreddate, rimuovere rapidamente l'assale e immergerlo subito in un bagno di azoto liquido per impedire al planchette di riscaldarsi.Successivamente, trasferire la lamella in una morsa a tenaglia per microtomo criogenico, precedentemente raffreddata, montata saldamente all'interno della camera del microtomo criogenico, per esporre la cupola di cellule ben congelata da tagliare in sezioni. Le due lamelle di ottone vengono separate con attenzione sotto azoto liquido. Una cupola di cellule perfettamente congelata avrà un aspetto vetroso e sarà priva di crepe e fessurazioni dovute alla nucleazione del ghiaccio.Utilizzando il microtomo criogenico, modellare la regione del domo esterno a meno di 0,2 millimetri quadrati impiegando lo strumento di taglio al diamante con una velocità di sezionamento rapida, mantenendo una profondità di circa 200 micrometri e utilizzando uno spray antistatico diretto verso la lama inclinata a basso angolo e le griglie di supporto in rame. In prossimità, avanzare con attenzione il coltello al diamante fino alla faccia del blocco lucidato utilizzando una velocità di taglio di circa 0,4 millimetri al secondo e una finestra di taglio stretta. Iniziare il sezionamento di fette spesse da 50 a 350 nanometri.Manovrare un applicatore fine simile a un batuffolo per ciglia per afferrare le sezioni iniziali, facendole scivolare lungo il bordo del coltello diamantato a basso angolo e per sostenere e guidare i nastri di sezioni attraverso il supporto in griglia di rame. Una volta caricata la griglia, utilizzare una sonda in argento lucidato e raffreddata per premere con fermezza i nastri. Conservare le griglie nelle apposite scatole all'interno di un contenitore isotermico raffreddato con azoto liquido fino a quando il microscopio non è pronto.Le cellule batteriche sulla griglia possono essere visualizzate utilizzando un microscopio luminoso crio. In questo caso, verrà utilizzato un microscopio invertito Nikon personalizzato, TIB, con una fase crio FEI modificata. Caricare le griglie nei contenitori sulla stazione crio e fissarle utilizzando gli anelli di bloccaggio in rame, quindi posizionare il contenitore in un tubo immerso in azoto liquido per il trasferimento.Caricare fino a due cartucce nel piatto criogenico pre-raffreddato e posizionare la griglia nella finestra di osservazione. Quindi abbassare la lente condensatrice e mettere a fuoco la lente obiettivo sulla griglia. Individuare le cellule ed acquisire le immagini.Per lo studio correlativo di microscopia ottica ed elettronica. La griglia viene scansionata intorno alla zona delle cellule per localizzarle successivamente in microscopia elettronica. Dopo l'acquisizione delle immagini della griglia, reinserire la cartuccia nel tubo e mantenere il tubo in azoto liquido fino al momento dell'acquisizione in microscopia elettronica per ottenere una tomografia tridimensionale della cellula batterica.Vengono acquisite una serie di immagini proiettive mentre il campione viene inclinato progressivamente lungo uno o due assi nel microscopio elettronico criogenico; in questo caso, la procedura viene dimostrata utilizzando Legon con un TF 30 Polar cryo TEM. Caricare fino a sei cartucce in un portacampioni multiposizione sulla stazione criogenica, quindi collegarlo al TF 30 Polar. Selezionare una cartuccia e inserirla nella colonna del microscopio elettronico. Avviare Legon tramite il software client sul computer del microscopio elettronico.Inserire le condizioni dell'immagine per la legenda della sessione. Selezionare le aree di interesse sulle immagini partendo dall'ingrandimento più basso e inviarle al passaggio successivo con ingrandimento più elevato. Quindi mettere in coda tutti i bersagli per la raccolta della serie di inclinazione e sottoporli tutti al passaggio finale di tomografia.Acquisire una serie di immagini. Il campione verrà inclinato progressivamente lungo uno o due assi nel microscopio elettronico criogenico. Al termine dell'esperimento, scaricare la serie di inclinazioni completata su una workstation locale per la ricostruzione.Le tomografie delle cellule batteriche vengono calcolate utilizzando software specializzati. Il programma Raptor viene utilizzato per ricostruire automaticamente le tomografie e e tomo può essere impiegato per eseguire la ricostruzione in modo semi-automatico. Ispezionare le serie di inclinazione mediante il visualizzatore 3D mod di IMOD e scartare quelle che, a causa di errori di tracciamento o di altro tipo, risulterebbero improbabili da produrre.Un buon tomografo raptor viene eseguito in modalità distribuita sui computer Linux del laboratorio utilizzando le impostazioni di base. La generazione della tomografia richiede da 20 minuti a due ore, a seconda delle dimensioni del file. Quando Raptor non riesce o quando un ricercatore desidera assicurarsi che la ricostruzione sia ottimale, è possibile utilizzare EMO per allineare manualmente le immagini con attenzione.Seguire i passaggi di ogni scheda nell'interfaccia grafica e tomo per ricostruire la tomografia di Tom Graham a partire dalla serie di inclinazioni. Utilizziamo un database interno basato sul web per organizzare, archiviare, cercare e distribuire i dati tomografici. La pagina principale di navigazione presenta un'immagine in miniatura e un filmato in stile simile a YouTube.Per ogni tomografo Graham. Dopo il Tommo, una volta ottenuti i Graham, le singole caratteristiche possono essere segmentate per facilitarne la visualizzazione delle forme. La segmentazione 3D è il processo mediante il quale ciascun voxel dell'immagine 3D viene assegnato a una regione o materiale specifico.Qui un software mirror viene utilizzato per generare un modello tridimensionale della superficie in cui ogni regione è mostrata con un colore diverso e visualizzata in filmati e animazioni 3D della tomografia. È possibile creare grafici per riassumere progetti e illustrare risultati mediante grafica tridimensionale. Software come Amira o Kymera possono essere utilizzati per renderizzare i singoli fotogrammi fissi del filmato e del prodotto commerciale.Per modificare il filmato, si può utilizzare un software di editing video come Adobe Premiere. Maya viene utilizzato per generare l'animazione. È possibile importare le superfici da Amira, creare fotogrammi chiave e renderizzarli in un filmato.Di seguito viene mostrata una serie rappresentativa di inclinazione di dati relativi a cellule intere per lo Spiro Treponema Promesa, seguita da una visualizzazione fetta per fetta del tomogramma ricostruito. La segmentazione della cellula di T. Promesa permette di distinguere la membrana esterna, la membrana interna e le strutture di superficie, inclusi i solchi superficiali e l'arcata dell'uncino superficiale. I batteri presentano flagelli e motore ulare, cono periplasmatico e pili.Questo modello meccanico mostra come lo spirochete Treponema Promesa nuoti e come un cilindro interno o nucleo sia racchiuso da una guaina esterna. I flagelli si muovono come rulli da vernice tra il cilindro interno e la guaina esterna. Mentre i flagelli ruotano, il cilindro interno ruota in senso opposto all'interno della guaina esterna.In un ambiente non viscoso, la cellula ruota inutilmente, ma in ambienti viscosi come quelli in cui T Promesa si trova in natura, le fibre esterne o altri oggetti resistono alla rotazione della guaina esterna, accelerando la rotazione del cilindro interno e fornendo materiali contro cui la cellula può spingersi mentre si avvita in avanti. Qui sono mostrate cellule reali di T promeus osservate al microscopio ottico. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la tomografia crioelettronica di cellule batteriche.Certo, siamo consapevoli che questo tipo di lavoro richiede investimenti significativi. I microscopi crioelettronici e i microscopi a fluorescenza sono strumenti sofisticati e costosi, che devono inoltre essere correttamente citati. Ad esempio, la base di questa stanza è una lastra di cemento isolata meccanicamente, spessa diversi piedi, appoggiata su un terreno appositamente compattato.Il sistema di condizionamento dell'aria è anch'esso progettato su misura, con condotti di grandi dimensioni e curve morbide per mantenere una temperatura costante senza correnti d'aria né turbolenze. Le tende che vedete sono posizionate per ridurre il rumore acustico. Infine, verifichiamo che questa stanza sia priva di campi elettromagnetici interferenti.Sebbene le operazioni che vi abbiamo mostrato sul microscopio siano ora in gran parte automatizzate, si verificano comunque frequentemente problemi che richiedono una diagnosi specializzata. Tuttavia, speriamo che la visione di questo filmato vi abbia aiutato ad apprezzare le procedure e gli strumenti coinvolti in questo tipo di lavoro. Grazie per la vostra attenzione.

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Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione dell'imaging di cellule vive e della tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)Il video descrive come preparare campioni di Legionella pneumophila per la tomografia crioelettronica combinando coltura batterica, marcatura con nanoparticelle d'oro e tecniche di vetrificazione. Il processo preserva le strutture cellulari native e consente l'imaging...

Preparazione della Legionella pneumophila per la tomografia elettronica criogenica

Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l'organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Questo protocollo viene descritto come visualizzare la compattazione DNA transitoria nei cianobatteri. Coltivazione sincrono, monitoraggio di microscopia di fluorescenza, congelamento rapido e alta tomografia di cryo-elettrone di tensione sono usati. Un protocollo per queste metodologie è presentato, e sono discussi gli sviluppi e le applicazioni future.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dirigere l'adesione e la crescita cellulare verso aree mirate di griglie per la crio-microscopia elettronica. Ciò si ottiene applicando uno strato antivegetativo che viene ablato in modelli specificati dall'utente seguito dalla deposizione di proteine della matrice extracellulare nelle aree modellate prima della semina cellulare.

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Il presente protocollo descrive l'acquisizione remota dei dati della tomografia crioelettronica ad alta risoluzione utilizzando Tomo5 e la successiva elaborazione dei dati e la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity. L'apoferritina è usata come esempio per illustrare dettagliati processi passo-passo per ottenere una struttura crio-ET con una risoluzione di 2,86 Å.

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

Visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-STEM

Questo protocollo standardizza la criotomografia elettronica (crio-ET) per tessuti spessi integrando il congelamento ad alta pressione (HPF) con il metodo waffle, il sollevamento criogenico del fascio di ioni a fuoco (crio-FIB) e l'acquisizione parallela a simmetria dose, producendo lamelle uniformemente sottili e campioni vitrificati per analisi riproducibili in situ nell'ippocampo del topo.

Flusso di lavoro di crio-tomografia elettronica per tessuti spessi dimostrato nell'ippocampo del topo

Scopri la criotomografia elettronica per visualizzare l'ultrastruttura cellulare batterica con risoluzione macromolecolare. Impara le tecniche di congelamento rapido e ricostruzione 3D per studi di biologia cellulare.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

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