Cryotomography elettrone di cellule batteriche

In questo video, vengono generate immagini 3D di cellule batteriche in stati quasi nativi a risoluzione molecolare mediante tomografia crioelettronica. Questo risultato si ottiene innanzitutto con il congelamento rapido di cellule intatte, oppure con congelamento ad alta pressione e criosezionamento dei pellet cellulari. Viene acquisita una serie di M immagini di proiezione, utilizzate per generare una ricostruzione tridimensionale, o Tom Graham, che viene quindi segmentata e analizzata ulteriormente mediante elaborazione computazionale.

Ciao, sono Grant Jensen della Divisione di Biologia del Caltech, e questa è Sonya Chen che ha organizzato la nostra presentazione. Oggi vi mostreremo come eseguire la tomografia crioelettronica di cellule batteriche. Tipicamente, un singolo individuo eseguirebbe l'intera procedura, ma poiché i nostri protocolli sono stati sviluppati attraverso un'esperienza condivisa, includeremo tutte le persone attualmente attive in laboratorio.

Oltre a Sonya e me nel video, vedrete Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky e Jen. Altri membri del laboratorio hanno prodotto le immagini catturate dagli schermi dei computer e hanno contribuito a preparare il protocollo scritto allegato, tra cui Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova e Dylan Morris. Ariana inizierà mostrandovi come effettuiamo la congelazione rapida per immersione delle cellule batteriche.

Per cellule batteriche sottili, una sospensione di cellule integre viene congelata rapidamente su una griglia per microscopia elettronica. Qui il processo viene dimostrato utilizzando un congelatore automatico commerciale: iniziare esaminando le colture batteriche per assicurarsi che siano prive di contaminanti e a un'adeguata confluenza o concentrazione; sottoporre la griglia per ME rivestita di carbonio a scarica al glow per due-quattro minuti. Successivamente, mescolare 100 microlitri di soluzione colloidale di oro con 25 microlitri di una soluzione di BSA al 5%.

Centrifugare la miscela a 18.000 G per 15 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet d'oro. In 20 microlitri di soluzione cellulare, posizionare la griglia per microscopia elettronica nel Vitra bot all'umidità al 100%.

Quindi applicare quattro microlitri della miscela cellulare sulla griglia EM sottoposta a glow discharge. La griglia viene automaticamente asciugata su entrambi i lati con carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso, quindi immersa rapidamente in una miscela liquida di etano e propano, raffreddata con azoto liquido. Rimuovere con attenzione la griglia dalla miscela di etano e propano e trasferirla rapidamente in una scatola di conservazione per griglie mantenuta sotto azoto liquido. Per cellule più spesse, il congelamento ad alta pressione impedisce la cristallizzazione del ghiaccio.

Il successivo taglio criostatico rende i campioni abbastanza sottili per la microscopia elettronica. L'imaging inizia centrifugando 15 millilitri di cellule a 1000 giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e mescolare 0,5 millilitri del pellet cellulare rimanente con 0,5 millilitri di crioprotettante al 20% di destrina.

Quindi centrifugare nuovamente a 13.000 giri/min per 15 secondi. Dopo che le cellule sono state pellettizzate, rimuovere il sopernatante e pipettare 0,1 millilitro della pasta del pellet superiore in una punta di micropipetta sigillata a caldo, che contiene già 0,2 millilitri di crioprotettante al 20% di destrina. Centrifugare la miscela nella punta di micropipetta a 13.000 giri/min per 30 secondi.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante. Si osserva un pellet compatto di cinque-dieci microlitri nella punta sigillata. Trasferire la sospensione su una delle due cupole di una piastrina bombata in ottone rivestita di Teflon, già montata sul braccio del portacampioni del congelatore ad alta pressione, quindi sigillarla con il relativo cappuccio piatto in ottone.

Inserire quindi prontamente l'assale nel congelatore ad alta pressione preparato. A una pressione di 2100 bar, l'unità combinata in ottone contenente le cellule viene rapidamente raffreddata da un getto di azoto liquido ad alta pressione. Dopo che le cellule sono state raffreddate, rimuovere rapidamente l'assale e immergerlo immediatamente in un bagno di azoto liquido per impedire al planchet di riscaldarsi.

Successivamente, trasferire la lamella in una pinza a morsetto criogenica pre-raffreddata, montata saldamente nella camera del microtomo criogenico, per esporre la cupola di cellule perfettamente congelata e procedere al taglio. Le due lamelle di ottone vengono separate con attenzione sotto azoto liquido. Una cupola di cellule perfettamente congelata avrà un aspetto vetroso e sarà priva di crepe e fessurazioni dovute alla nucleazione del ghiaccio.

Utilizzando il microtomo criogenico, modellare la regione del domo esterno a meno di 0,2 millimetri quadrati impiegando lo strumento di taglio al diamante con una velocità di sezionamento rapida, mantenendo una profondità di circa 200 micrometri e utilizzando uno spray antistatico diretto verso la lama inclinata a basso angolo e le griglie di supporto in rame. In prossimità, avanzare con attenzione il coltello al diamante fino alla faccia del blocco lucidato utilizzando una velocità di taglio di circa 0,4 millimetri al secondo e una finestra di taglio stretta. Iniziare il sezionamento di fette spesse da 50 a 350 nanometri.

Manovrare un applicatore fine a base di ciglia per afferrare le sezioni iniziali, facendole scivolare lungo il bordo del coltello diamantato a basso angolo e per sostenere e guidare i nastri di sezioni attraverso il supporto in griglia di rame. Una volta caricata la griglia, utilizzare una sonda in argento lucidato e raffreddata per premere con fermezza i nastri. Conservare le griglie nelle apposite scatole all'interno di un trasportatore secco raffreddato a azoto liquido fino a quando il microscopio non è pronto.

Le cellule batteriche sulla griglia possono essere visualizzate utilizzando un microscopio luminoso crio. In questo caso, verrà utilizzato un microscopio invertito Nikon personalizzato, TIB, con un piatto crio FEI modificato. Caricare le griglie nei contenitori sulla stazione crio e fissarle utilizzando gli anelli di bloccaggio in rame, quindi posizionare il contenitore in un tubo immerso in azoto liquido per il trasferimento.

Caricare fino a due cartucce nel piatto criogenico pre-raffreddato e posizionare la griglia nella finestra di osservazione. Quindi abbassare la lente condensatrice e mettere a fuoco la lente obiettivo sulla griglia. Individuare le cellule ed acquisire le immagini.

Per lo studio correlativo al microscopio ottico (LM) e al microscopio elettronico (EM). La griglia viene scansionata intorno alla zona delle cellule per localizzarle successivamente in EM. Dopo l'acquisizione delle immagini della griglia, reinserire la cartuccia nel tubo e mantenere il tubo in azoto liquido fino al momento dell'acquisizione in microscopia elettronica per ottenere una tomografia tridimensionale (3D TOM) della cellula batterica.

Vengono acquisite una serie di immagini proiettive mentre il campione viene inclinato progressivamente lungo uno o due assi nel microscopio elettronico criogenico; in questo caso, la procedura viene dimostrata utilizzando Legon con un TF30 Polar cryo-TEM. Caricare fino a sei cartucce in un portacampioni multiplo sulla stazione criogenica, quindi collegarlo al TF30 Polar. Selezionare una cartuccia e inserirla nella colonna del microscopio elettronico. Avviare Legon tramite il software client sul computer del microscopio elettronico.

Inserire le condizioni dell'immagine per la legenda della sessione. Selezionare le aree di interesse sulle immagini partendo dall'ingrandimento più basso e inviarle al passaggio successivo con ingrandimento più elevato. Quindi mettere in coda tutte le aree di interesse per l'acquisizione della serie di inclinazioni e inviarle tutte al passaggio finale di tomografia.

Acquisire una serie di immagini. Il campione verrà inclinato progressivamente lungo uno o due assi nel microscopio elettronico criogenico. Al termine dell'esperimento, scaricare la serie di inclinazioni completata su una workstation locale per la ricostruzione.

Le tomografie delle cellule batteriche vengono calcolate utilizzando un software specializzato. Il programma Raptor viene utilizzato per ricostruire automaticamente le tomografie ed e tomo può essere impiegato per eseguire la ricostruzione in modo semiautomatico. Ispezionare le serie di inclinazione utilizzando il visualizzatore 3D mod di IMOD e scartare quelle che, a causa di problemi di tracciamento o altri errori, risulterebbero improbabili da produrre.

Un buon tomografo raptor viene eseguito in modalità distribuita sui computer Linux del laboratorio utilizzando le impostazioni di base. La generazione della tomografia richiede da 20 minuti a due ore, a seconda delle dimensioni del file. Quando Raptor fallisce o quando un ricercatore desidera assicurarsi che la ricostruzione sia ottimale, è possibile utilizzare EMO per allineare manualmente le immagini con attenzione.

Seguire i passaggi di ogni scheda nell'interfaccia grafica e tomo per ricostruire la tomografia di Tom Graham a partire dalla serie di inclinazioni. Utilizziamo un database interno basato sul web per organizzare, archiviare, cercare e distribuire i dati tomografici. La pagina principale di navigazione presenta un'immagine in miniatura e un filmato simile a un video di YouTube in evidenza.

Per ogni tomografo Graham. Dopo il Tommo, una volta ottenuti i Graham, le singole caratteristiche possono essere segmentate per aiutare a visualizzarne le forme. La segmentazione 3D è il processo di assegnazione di ogni voxel dell'immagine 3D a una regione o materiale specifico.

Qui viene utilizzato un software di mirroring per generare un modello tridimensionale della superficie in cui ogni regione è mostrata con un colore diverso e visualizzata in filmati e animazioni 3D della tomografia. È possibile creare grafici per riassumere progetti e illustrare i risultati mediante grafica tridimensionale. Software come Amira o Kymera possono essere utilizzati per generare le singole immagini fisse del filmato e del video promozionale.

Un software di editing video come Adobe Premiere può essere utilizzato per modificare il filmato realizzato con software commerciale. Maya viene utilizzato per generare l'animazione. È possibile importare le superfici da Amira, creare fotogrammi chiave e renderizzare il filmato.

Di seguito viene mostrata una serie rappresentativa di inclinazione di dati relativi a cellule intere per lo Spiro Treponema Promesa, seguita da una visualizzazione fetta per fetta del tomogramma ricostruito. La segmentazione della cellula di T. Promesa permette di distinguere la membrana esterna, la membrana interna e le strutture di superficie, inclusi i contenitori superficiali e l'arcata dell'uncino superficiale. I batteri presentano flagelli e motore ulare, cono periplasmatico e pili.

Questo modello meccanico mostra come lo spirochete Treponema Promesa nuoti e come un cilindro interno o nucleo sia racchiuso da una guaina esterna. I flagelli si muovono come rulli da vernice tra il cilindro interno e la guaina esterna. Mentre i flagelli ruotano, il cilindro interno ruota in senso opposto all'interno della guaina esterna.

In un ambiente non viscoso, la cellula ruota inutilmente, ma in ambienti viscosi come quelli in cui T Promesa si trova in natura, fibre esterne od altri oggetti resistono alla rotazione della guaina esterna, accelerando la rotazione del cilindro interno e fornendo materiali contro cui la cellula può spingersi mentre si avvita in avanti. Qui sono mostrate cellule reali di T promeus osservate al microscopio ottico. Abbiamo appena mostrato come eseguire la tomografia crioelettronica di cellule batteriche.

Certo, siamo consapevoli che questo tipo di lavoro richiede investimenti significativi. I microscopi crioelettronici e i microscopi a fluorescenza sono strumenti sofisticati e costosi, che devono inoltre essere correttamente citati. Ad esempio, la base di questa stanza è una lastra di cemento isolata meccanicamente, spessa diversi piedi, appoggiata su un terreno appositamente compattato.

Il sistema di condizionamento dell'aria è anch'esso progettato su misura, con condotti di grandi dimensioni e curve morbide per mantenere una temperatura costante senza correnti d'aria o turbolenze. Le tende che vedete sono posizionate per ridurre il rumore acustico. Infine, verifichiamo che questa stanza sia priva di campi elettromagnetici interferenti.

Sebbene le operazioni che vi abbiamo mostrato sul microscopio siano ora in gran parte automatizzate, si verificano comunque frequentemente problemi che richiedono una diagnosi specializzata. Tuttavia, speriamo che la visione di questo filmato vi abbia aiutato ad apprezzare le procedure e gli strumenti coinvolti in questo tipo di lavoro. Grazie per la vostra attenzione.