Overview
इस वीडियो को अलग करने के लिए एक विधि का परिचय और बाँझ संस्कृति भ्रूण सी elegans कोशिकाओं में विट्रो ।
Protocol
1. भ्रूण कोशिकाओं का विघटन
- एक लैमिनार प्रवाह हुड का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में प्रक्रिया के अगले चरणों का संचालन करें। जबकि जानवरों बैक्टीरिया प्लेटों पर गाउन कर रहे हैं, वॉश और लाइसिस ब्लीच युक्त समाधान के साथ उपचार सबसे अगर नहीं सभी बैक्टीरिया को खत्म करना चाहिए । इस प्रकार प्रक्रिया के इस बिंदु पर एक लेमिनार हुड का उपयोग करना अंडे के निलंबन के नए प्रदूषण को रोकता है।
- रिसुस्पेंड 2 मिलीग्राम/मिलीलीटर चिटिनेस (अंडे बफर पीएच 6.5 में स्टॉक) के 1 मिलीलीटर में अंडे को फिर से 15 मिलीलीटर शंकुदाता में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए ट्यूब रॉक। एंजाइम की ताजगी और कमरे के तापमान के अनुसार सटीक इनक्यूबेशन समय बदलता है और इसलिए प्रत्येक तैयारी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। 10 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद एक उल्टे सेल-कल्चर माइक्रोस्कोप के तहत अंडों की निगरानी शुरू करने की सिफारिश की जाती है। नोट: हमारे अनुभव में, कम पीएच चिटनेज एंजाइमेटिक गतिविधि को बढ़ाता है। इस कारण से हम पीएच 6.5 पर अंडे बफर का उपयोग चिटिनेस को भंग करने के लिए करते हैं (ऊपर रिपोर्ट किया गया नुस्खा, जहां पीएच को नाओएच का उपयोग करके 6.5 में समायोजित किया जाता है)।
- जब ~ 80% अंडे के गोले चिटिनेस उपचार(आंकड़े 1 ए-बी)द्वारा पचते हैं, तो 3 मिनट के लिए 900 x ग्राम (~ 2,500 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र द्वारा अंडे को गोली मारते हैं। P1000 पिपेटर और बाँझ युक्तियों का उपयोग करके, सुपरनेट को ध्यान से हटा दें और 3 मिलीलीटर एल-15 माध्यम जोड़ें।
- अंडे को 6 सेमी व्यास की प्लेट में स्थानांतरित करें और 18 जी सुई से लैस 10 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को धीरे-धीरे अलग करें। एक ताजा प्लास्टिक पेट्री डिश में निलंबन की एक बूंद रखकर और माइक्रोस्कोप के नीचे देखने के द्वारा वियोजन की डिग्री की निगरानी करें। हानिकारक कोशिकाओं से बचने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान सिरिंज में हवा को एस्पिरेट न करें। जब तक ~ 80% कोशिकाओं को अलग न कर रहे हैं तब तक वियोजन जारी रखें।
- एक बाँझ 5 माइक्रोन मिलिपोर फिल्टर का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टर करें। सेल झुरमुट, अपाच्य अंडे और रची लार्वा को हटाने के लिए सेल निलंबन को फ़िल्टर किया जाना चाहिए। सभी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए फिल्टर के माध्यम से ताजा एल-15 मीडिया के अतिरिक्त 4-5 मिलीलीटर फ़िल्टर करें। फिल्टर और/या कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए फिल्ट्रेशन स्टेप के दौरान अत्यधिक बल का उपयोग न करें ।
2. संस्कृति कोशिकाएं
- 3 मिनट के लिए 900 x ग्राम (~ 2,500 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र द्वारा वियोजनित कोशिकाओं को गोली मारें। P1000 पिपेटर और बाँझ युक्तियों का उपयोग सावधानी से सभी सुपरनॉट को हटा दें। पेल्ड कोशिकाओं को पूर्ण एल-15 माध्यम और प्लेट 1 मिलीलीटर/वेल में फिर से खर्च करें। जोड़े गए माध्यम की मात्रा उपयोग की जाने वाली 8P प्लेटों की संख्या, प्लेटों पर कीड़े के संगम और कोशिकाओं पर किए जाने वाले प्रयोगों के प्रकार पर निर्भर करती है। कोशिका घनत्व एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है। पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए ~ 230,000 कोशिकाओं/सेमी2 का घनत्व चढ़ाना इष्टतम है।
- संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए गीले कागज तौलिए युक्त प्लास्टिक टपरवेयर कंटेनर में 24 कुओं की प्लेट रखें। कंटेनर को 20 डिग्री सेल्सियस और परिवेशी हवा में आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में स्टोर करें।
- कोशिकाएं आमतौर पर 24 घंटे के भीतर प्रयोगों के लिए तैयार होती हैं जब रूपात्मक भेदभाव और जीएफपी मार्कर की अभिव्यक्ति पूरी हो जाती है। कोशिकाओं को संस्कृति में 2 सप्ताह तक रखा जा सकता है लेकिन वे आमतौर पर चढ़ाना के बाद 7-9 दिनों तक सबसे स्वस्थ होते हैं। स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए दिन में एक बार माध्यम को बदलने की जरूरत है।
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Representative Results
चित्रा 1. सी एलिगेंस भ्रूण से पहले और चिटनस उपचार के बाद। (क) चिटनेज के संपर्क में आने से पहले अंडों की तस्वीर । तीर एक भ्रूण के आसपास पारदर्शी और बरकरार अंडे के लिए इंगित करता है। (ख) अंडे का उपचार 10 मिनट के लिए चिटनेज के साथ किया जाता है । अंडे के गोले पचा गए हैं और अब भ्रूण के आसपास दिखाई नहीं दे रहे हैं। तीर अंडे के से जारी तीन गुना भ्रूण को इंगित करते हैं। ब्लू बॉक्स कोशिकाओं के एक समूह को घेरे हुए है जो अभी भी एक दूसरे से जुड़े हुए हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
