Ablazione epatica mirata: induzione della morte degli epatociti con metronidazolo nelle larve di pesce zebra transgenico

- Sciogliere il metronidazolo in acqua d'uovo contenente DMSO, un solvente, e aggiungere feniltiourea, che previene la formazione di pigmenti negli embrioni. Trasferire alcune larve dell'età appropriata su piastre di trattamento e controllo. Quindi, aggiungere la concentrazione desiderata della soluzione di metronidazolo alla piastra di prova e dell'acqua d'uovo contenente DMSO alla piastra di controllo.

Lascia che le larve in entrambe le piastre crescano a 28 gradi Celsius. Le larve transgeniche producono nitroreduttasi solo negli epatociti, che converte il metronidazolo in un farmaco citotossico, provocando la morte solo degli epatociti bersaglio. Dopo il trattamento, rimuovere la soluzione di metronidazolo dalla piastra di trattamento e lavare gli embrioni con acqua d'uovo.

Aggiungere tricaina per anestetizzare le larve ed esaminarle al microscopio a epifluorescenza per verificare la presenza di una grave ablazione degli epatociti, la distruzione delle cellule epatiche. Osserverai un fegato molto più piccolo negli individui trattati rispetto agli individui del gruppo di controllo. Nel protocollo di esempio, utilizzeremo il metronidazolo per l'ablazione degli epatociti nelle larve di zebrafish transgenico per studiare la rigenerazione epatica.

- Trasferisci fino a 100 embrioni in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 25 millilitri di acqua d'uovo e posiziona la capsula a 28 gradi Celsius. Per inibire la pigmentazione, aggiungere PTU alla coltura fino a 10 ore dopo la fecondazione. A 80 ore dalla fecondazione, anestetizzare le larve con tricaina e utilizzare un microscopio a epifluorescenza per raccogliere le larve positive alla CFP, mantenendo solo gli animali con fegati di dimensioni simili

Quindi sostituire l'acqua d'uovo di tricaina con acqua d'uovo fresca integrata con PTU e riportare le larve di pesce zebra positive alla CFP nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Per trattare le larve di zebrafish con MTZ, per prima cosa, dividere il numero appropriato di larve in due diversi recipienti di coltura. Tenere il gruppo di larve sperimentali in una soluzione di MTZ appena preparato e il gruppo di controllo in acqua d'uovo integrata con DMSO.

Coprire il gruppo sperimentale con un foglio di alluminio per prevenire la fotoinattivazione dell'MTZ e incubare entrambi i gruppi di larve di zebrafish a 28 gradi Celsius. Al termine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione MTZ dalle piastre e lavare le lave trattate con MTZ due o tre volte con 25 millilitri di acqua d'uovo e agitando, scartando l'acqua d'uovo dopo ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, immobilizzare le larve con metà della concentrazione di tricaina precedentemente utilizzata per evitare l'edema cardiaco e la morte nelle larve trattate con MTZ. Quindi utilizzare il filtro CFP su un microscopio a epifluorescenza per valutare i livelli di ablazione degli epatociti in base alle dimensioni relative del fegato delle lave trattate con MTZ. Si considerino i pesci zebra con fegati grandi che rappresentano dallo 0% al 5% delle larve da non ablare, quelli con fegati di medie dimensioni che rappresentano dal 10% al 20% delle larve da ablare parzialmente e quelli con fegati molto piccoli che rappresentano dall'80% al 90% delle larve da ablare completamente.