Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre l'ablazione degli epatociti nel pesce zebra per l'analisi della rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari. Ciò si ottiene esponendo prima le larve transgeniche che esprimono la nitro reduttasi nei loro epatociti a metrona o MTZ. Nella seconda fase, il livello di ablazione degli epatociti viene valutato in base alle dimensioni relative del fegato.

Dopo il trattamento con MTZ nella fase finale, vengono raccolte le larve ablate con un fegato minuscolo, alla fine vengono rilevate le dimensioni del fegato e l'espressione dei marcatori epatici nel fegato rigenerante vengono misurate rispettivamente mediante epifluorescenza e microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i modelli di attivazione delle cellule ovali dei roditori è che con questa tecnica, gli epatociti rigenerativi derivano principalmente da cellule epiteliali biliari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione del fegato, come ad esempio in che modo le cellule biliari o progenitrici del fegato contribuiscono alla rigenerazione del fegato Generalmente l'individuo a nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché la dimensione del fegato in piombo e laboratorio degenerante è variabile.

Per condurre accoppiamenti a tempo, sistemare i pesci emizigoti o omozigoti maschi e femmine adulti durante la notte con un divisore tra di loro. Rimuovere il divisore la mattina seguente quando si desidera l'accoppiamento, utilizzando un colino a rete di plastica fine per raccogliere gli embrioni, capovolgere il colino e utilizzare un flacone da spremere per sciacquare la superficie della rete con un getto sottile di acqua d'uovo. Quindi trasferisci fino a 100 embrioni in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 25 millilitri di acqua d'uovo e posiziona la capsula a 28 gradi Celsius per inibire la pigmentazione.

Aggiungere PTU alla coltura fino a 10 ore. Post fecondazione a 80 ore. Dopo la personalizzazione, anestetizzare le larve con trica e utilizzare un microscopio a epifluorescenza per raccogliere le larve positive alla CFP, mantenendo solo gli animali con fegati di dimensioni simili.

Quindi sostituire l'acqua d'uovo trica con acqua d'uovo fresca integrata con PTU e riportare le larve di pesce zebra positive alla CFP nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Per trattare prima le larve di zebrafish con MTZ, dividere il numero appropriato di larve in due diversi recipienti di coltura. Tenere il gruppo di larve sperimentali in una soluzione di MTZ appena preparato e il gruppo di controllo in acqua d'uovo.

Integrato con DMSO. Coprire il gruppo sperimentale con un foglio di alluminio per prevenire la fotoinattivazione dell'MTZ e incubare entrambi i gruppi di larve di zebrafish a 28 gradi Celsius alla fine del periodo di ablazione. Togliete la soluzione MTZ dalle piastre e lavate le larve trattate con MTZ due o tre volte con 25 millilitri di acqua d'uovo e agitando scartando l'acqua d'uovo Dopo ogni lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, immobilizzare le larve con metà della concentrazione di trica precedentemente utilizzata per evitare l'edema cardiaco e la morte nelle larve trattate con MTZ. Quindi utilizzare il filtro CFP su un microscopio a epifluorescenza per valutare i livelli di ablazione degli epatociti in base alle dimensioni relative del fegato delle larve trattate con MTZ. Si consideri il pesce zebra con grandi fegati che rappresentano dallo zero al 5% delle larve da non ablare.

Quelli con fegati di medie dimensioni che rappresentano il 10-20% delle larve da ablare parzialmente e quelli con fegati molto piccoli che rappresentano l'80-90% delle larve da ablare completamente. Dopo aver classificato tutti gli animali, scopri le larve con fegati non ablati o parzialmente ablati, tenendo solo il pesce zebra con fegati minuscoli che indicano una grave ablazione degli epatociti per l'analisi del fegato. Al punto dell'ora zero di rigenerazione, trasferire le larve in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Subito dopo il lavaggio MTZ e l'approvvigionamento di CFP, sostituire l'acqua d'uovo con un tampone MPEM al 3% di formaldeide per un fissaggio notturno su un rotore di quattro gradi Celsius. La mattina successiva, sostituire la soluzione di fissazione con un millilitro di P-B-S-D-T e ruotare le larve per altri cinque minuti. Successivamente, tutte le larve fissate in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente P-B-S-D-T fresco sotto un microscopio da dissezione e utilizzare una pinza per rimuovere manualmente il tuorlo e le pinne pettorali quando tutte le larve sono state tagliate.

Trasferire fino a 20 animali in una provetta da 1,5 millilitri e sostituire il P-B-S-D-T con un millilitro di soluzione bloccante. Dopo due ore sul rotatore a temperatura ambiente, sostituire la soluzione bloccante con 100 microlitri del cocktail di anticorpi primari per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Con l'oscillazione il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare il pesce zebra con P-B-S-D-T per cinque lavaggi di 10 minuti.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente con oscillazione. Infine, lavare le larve cinque volte in P-B-S-D-T come appena dimostrato. Orientare le larve lateralmente su un vetrino da microscopio e aggiungere una goccia di terreno di montaggio.

Quindi coprire accuratamente ogni pesce zebra con un vetro di copertura e sigillare il vetro di copertura con lo smalto per unghie. Il trattamento MTZ per 36 ore da 3,5 a cinque giorni dopo la fecondazione riduce drasticamente le dimensioni del fegato. Dopo il washout di MTZ, una forte espressione di CFP e rosso riappare entro 30 ore, come valutato dall'espressione di LCAM nella membrana delle cellule epiteliali biliari.

La rete biliare intraepatica inizialmente collassa, ma viene poi ristabilita 54 ore dopo il washout indicando una rapida rigenerazione e recupero del fegato. In queste immagini, epatociti rigeneranti transgenici per una proteina fluorescente rossa nucleare espressa esclusivamente nelle cellule epiteliali biliari del fegato sono mostrati, la maggior parte di questi H due cellule BM cherry positive nel fegato rigenerante esprimono HNF quattro alfa all'ora di rigenerazione zero all'ora di rigenerazione quattro C otto. Gli epatociti CFP positivi trattati con MTZ conservano ancora la loro espressione di ciliegia H 2 BM, indicando la conversione delle cellule epiteliali biliari in epatociti in seguito a grave perdita di epatociti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare completamente ablato dopo il trattamento MTT per la successiva rigenerazione epatica all'azione della lisi dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione epatica per esplorare i meccanismi alla base del progenitore epatico, la rigenerazione epatica guidata dalle cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo modello operativo specifico per i citi geografici per gli studi sulla degenerazione epatica guidata dal bilio.