Name: Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Impara l'ablazione laser UV a singola cellula per studiare lo stress cellulare e la morte neuronale utilizzando Danio rerio. Questo metodo consente di analizzare le risposte di microglia e astrociti in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto di Ricerca MND dell'Australia e dalla Cure for MND Foundation [GIA 1638], dalla Snow Foundation e dalla Macquarie University [MQRDG 9201401462]. L'imaging è stato effettuato presso la Facility di Microscopia del Dipartimento di Scienze Biomediche della Macquarie University. Si ringraziano gli altri membri del centro di ricerca MND per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi e linee di pesce.

NOTA: Design, condotta, e la segnalazione di esperimenti sugli animali devono tener conto degli orientamenti attuali 15. Tale lavoro deve essere preventivamente approvato dalle autorità locali il benessere degli animali (nel nostro caso, il comitato etico degli animali di Macquarie University). 1. Preparare il Zebrafish per il montaggio e UV cellulare ablazione <ol><li> Genera zebrafish (Danio rerio) che esprime proteine fluorescenti. <ol><li> Per esprimere proteine fluorescenti di interesse in zebrafish, eseguire le iniezioni plasmide nella fase una cella dell&#39;uovo pesce zebra (come descritto altrove 16) o utilizzare linee transgeniche fluorescenti. Per etichettare più tipi di cellule, creare composti linee di zebrafish transgenico attraversando linee transgeniche stabiliti pertinenti alla questione di interesse. Inserire un maschio e una femmina zebrafish su ciascun lato di una coppia tank doppio fondo accoppiamento la sera e rimuovere il divisore con l&#39;inizio della luceLa mattina successiva (come descritto altrove 17). Mantenere il pesce zebra a 28 ° C e gestirli secondo i protocolli stabiliti 17, 18. </li><li> Raccogliere gli embrioni dopo la deposizione di successo da sforzare l&#39;acqua della vasca contenente gli embrioni attraverso un colino da tè di plastica. Lavare le uova con l&#39;acqua del sistema e trasferirli in acqua uovo in una capsula di Petri. </li><li> li esaminare al microscopio ottico per determinare la fecondazione. Conservare uova fecondate in una capsula di Petri e metterli in un incubatore a 28 ° C 18. </li></ol></li><li> Opzionale: Eseguire un microiniezione per etichettare specifiche popolazioni cellulari. NOTA: Questo è un metodo alternativo che permette l&#39;espressione e la visualizzazione di proteine, senza la necessità di aumentare linee transgeniche stabili. Questo metodo è anche vantaggioso quando la proteina di interesse è tossico e vieta la generazione di un trans stabilelinee geniche. <ol><li> Iniettare i costrutti plasmidici nella fase una cella di embrioni zebrafish, come descritto altrove 19, 20, 21. NOTA: Questo metodo risulta nell&#39;espressione mosaico della proteina di interesse. La proteina di interesse è guidata da un promotore di scelta (ad esempio, islet1 22, -3mnx1 23, 24, 25 incontrato o MPEG1 26) affiancato da Tol2 invertito ripetizioni 20. </li></ol></li><li> Åge il pesce alla dimensione desiderata. <ol><li> Sollevare il pesce per 3-5 giorni dopo la fecondazione (DPF) e metterli sotto un microscopio composto fluorescente. Schermo gli animali di espressione fluoroforo appropriata e selezionare il pesce brillantemente etichettato. Separare le larve appropriata in un altro piatto con acqua uovo per l&#39;incorporamento in ritardoR (conservare in 28 ° C incubatore). Opzionali: embrioni possono essere inseriti in un 0,2 mM 1-fenil-2-thioures soluzione (PTU) Ringers a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per inibire la formazione di pigmentazione. La cura deve essere presa con PTU, in quanto è tossico e può avere fisiologici negativi, genetica, o gli effetti morfologici. </li><li> Per gli studi in una fase di sviluppo precoce (&lt;2 DPF), dechorionate gli embrioni utilizzando manualmente pinze taglienti. Dechorionate gran numero di embrioni enzimaticamente aggiungendo pronase (2 mg / mL) all&#39;acqua uovo e li incubando per 10 min a 28 ° C. </li><li> Passare gli embrioni periodicamente attraverso una pipetta Pasteur di plastica per facilitare dechorionation. Terminare il processo quando la maggior parte degli embrioni sono emersi dai loro chorions lavando più volte con acqua uovo. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni per l&#39;incorporamento zebrafish in agarosio. <ol><li> Preparare una soluzione di anestesia con l&#39;aggiunta di 4 g / L MS222 (soluzione tricaine, pH 7,0)goccia a goccia ad una piastra di Petri contenente acqua uovo. Una dose di 50 mg / L è un punto di partenza consigliato (Figura 1A). </li><li> Preparare uno stock di basso punto di fusione agarosio (0,8-1,5%) in acqua uovo e aliquota in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Inserire una aliquota in un blocco di calore pre-riscaldato (38 - 40 ° C) e lasciare equilibrare alla temperatura impostata (~ 30 min; Figura 1B). </li><li> Opzionale: Per l&#39;imaging a lungo termine (&gt; 4 h), preparare un piccolo cerchio agarosio all&#39;interno della 35 mm piastra di Petri con fondo di vetro e permettono di impostare (Figura supplementare 1). NOTA: Questo passo ulteriore è stato efficace nell&#39;evitare qualsiasi movimento di tutta la goccia di agarosio con il pesce zebra un lasso di tempo più lunghi. <ol><li> Per fare ciò, posto ~ 300 ml di agarosio lungo il cerchio interno del piatto fondo di vetro per preparare un cerchio a forma di ciambella con una piccola apertura al centro in cui collocare il pesce (fase 1.5.3; supplementare figura 1) . </li></ol></li></ol></li><li> Montare il pesce zebra in agarosio per la microscopia. <ol><li> Selezionare 1 - 3 del pesce pre-screening per l&#39;ablazione e anestetizzare le larve tramite trasferimento (utilizzando una pipetta di trasferimento) in un piatto con la soluzione anestesia (passo 1.4.1; la figura 1C, circa 5 min). NOTA: I pesci sono anestetizzati quando mostrano un movimento opercolare superficiale e una diminuzione della frequenza cardiaca e visualizzare non più di una risposta di fuga touch-evocato (TEER, pena di nuotare via dopo delicatamente toccare la coda a pennello). Garantire l&#39;anestesia appropriata per il trattamento etico dei pesci e per evitare spasmi al momento del trasferimento in agarosio o l&#39;esposizione a luce fluorescente. </li><li> Dopo l&#39;anestesia è confermato, succhiare una larva utilizzando una pipetta regolabile (con un cut-off di 200 microlitri punta impostato a ~ 30 mL) e lasciare che si depositano sul fondo della punta. Trasferire la larva in agarosio preriscaldato (fase 1.4.2) rilasciando una goccia del liquido con illarva in agarosio (cercare di minimizzare la quantità di acqua uovo entrare in agarosio; Figura 1D). </li><li> Aspirare il pesce circondato da agarosio. Distribuire rapidamente nel piatto precedentemente preparato fondo di vetro da 35 mm. </li><li> Utilizzare un microscopio dissezione e un pennello standard (di linea lunga, formato 1) per posizionare l&#39;animale all&#39;interno del agarosio sul lato (testa a sinistra) in modo che il corpo e la coda sono piatte (Figura 1E). Se si lavora con pesce multipla, allineare tutti i pesci nel piatto in modo che siano facilmente individuati dalla microscopio confocale seguito. NOTA: eseguire rapidamente questa procedura di posizionamento e allineamento (si può richiedere una certa pratica, come l&#39;agarosio inizia la presa immediatamente dopo l&#39;esposizione a temperature più fredde). </li><li> Lasciare il pesce agarosio-embedded per 10 - 15 minuti fino a quando l&#39;agarosio è impostato saldamente. Top con cautela il 35 mm piastra di Petri con ~ 2 ml di acqua contenente uova tricaine (Figura 1F). </li></ol></li></ol> 2. Impostare il microscopio confocale e imaging Parametri <ol><li> Porre la capsula di Petri con la larva incorporato sul palco microscopio confocale e concentrarsi sul lato dorsale del midollo spinale degli animali (con campo chiaro). Esaminare l&#39;animale sotto l&#39;ingrandimento appropriata (40X) e l&#39;impostazione fluorescenti e visualizzare la struttura di interesse (ad esempio, intensità di fluorescenza dei neuroni marcati o movimenti della microglia) per confermare che tutti i parametri di imaging sono come necessario per la successiva ablazione (Figura 2). Noi abitualmente utilizziamo l&#39;obiettivo 40X per eseguire i nostri studi lasso di tempo. </li><li> Opzionale: Per eseguire uno studio time-lapse per diverse ore, si consiglia di registrare un singolo o pochi punti temporali prima di ablazione per stabilire la risposta fisiologica imperturbato della cellula e l&#39;ambiente (ad esempio, il movimento della microglia stabilire velocità basale e la motilità). </li><li> Determinare lo spessore della structure di interesse per l&#39;ablazione laser UV. <ol><li> Utilizzando la z-drive, verificare la parte superiore e inferiore della struttura di interesse (ad esempio, il soma cella) concentrandosi manualmente su e giù. Si annota il piano z che saranno ablazione (ad esempio, il centro della cella). NOTA: Per esperienza, questo metodo è più efficace di mira neuroni del midollo spinale che sono stati brillantemente etichettati (un alto rapporto segnale-rumore che permette una facile visualizzazione temporizzata dopo l&#39;ablazione, ad esempio, figura 4) e ablazione mezzo della soma cellulare. Cellulare nucleo di fluorescenza può essere di vantaggio per assicurare una corretta targeting e ad alta efficienza l&#39;ablazione. </li></ol></li></ol> 3. Eseguire mirato Laser Ablation di celle singole nel midollo spinale Zebrafish NOTA: per questo approccio di ablazione e visualizzazione, è stato usato un microscopio confocale (Leica SP5). La procedura di ablazione mediante un diodo 405 nm per dest cellule-specificheruction è dettagliato in base al software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Tuttavia, qualsiasi microscopio confocale convenzionale che è dotato di un laser 405 nm e un FRAP (recupero di fluorescenza dopo photobleaching) o modulo candeggina consentire l&#39;effettuazione delle stesse manipolazioni cellulari, ma potenzialmente con impostazioni leggermente diverse, i parametri e nomi. <ol><li> Avviare la procedura guidata FRAP facendo clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu del software (Figura 3A, 1 e 2). Osservare una nuova finestra con diversi passaggi che permette la messa a punto dei parametri specifici per l&#39;ablazione laser (Figura 3B, 3). </li><li> Determinare i parametri dell&#39;immagine per l&#39;approccio di ablazione selezionando il formato, velocità di scansione (Figura 3B, 4), e media (Figura 3B, 5). Un formato immagine di 1.024 x 1.024 ad una velocità di scansione di 400 Hz e una lineamedia di 4 era più applicabile. NOTA: Non vi è alcuna necessità di cambiare il rilevamento spettrale (ad esempio i parametri dell&#39;eccitazione o emissione), così come sono stati determinati nel precedente acquisizione. <ol><li> Se non è già stato selezionato il piano z per l&#39;ablazione (come descritto nel passaggio 2.4.), Premere il tasto &quot;Live&quot; e mettere a fuoco attraverso il campione fino alla fluorescente struttura o piano z desiderato che sta per essere ablated è messo a fuoco. </li></ol></li><li> Una volta impostati i parametri dell&#39;immagine generale, l&#39;accesso alla fase &quot;Bleach&quot; (Figura 3C, 6) per controllare i componenti di ablazione specifici. NOTA: Una combinazione di intensità del laser (Figura 3C, 8), la velocità di scansione, e la media che è stato impostato nel passo 3.2 (Figura 3B, 4 e 5), nonché il numero di ripetizioni che sarà fissato nelle passo 3.5 (Figura 3E,12), determina il tempo di permanenza complessivo della laser UV al ROI, e quindi, l&#39;efficienza sbianca. <ol><li> Inserire il laser 405 nm attivando per la procedura di sbianca (Figura 3C, 8). NOTA: La maggior parte successo con le impostazioni di cui sopra è stato raggiunto con intensità laser 405 nm tra il 60 - 80% nel nostro apparato sperimentale. Essere consapevoli del fatto che questa potenza del laser è specifico strumento e sarà diverso per ogni configurazione confocale. </li><li> Utilizzare la &quot;zoom in&quot; opzione (Figura 3C, 7) per massimizzare l&#39;intensità sbiancante al ROI selezionata riducendo il campo di scansione, quindi ottimizzando tempo di sosta. In alternativa, utilizzare l&#39;opzione &quot;punto Bleach&quot; del software di scelta per questo processo. </li></ol></li><li> Selezionare una o più ROI (Figura 3D, 10) per l&#39;ablazione utilizzando uno qualsiasi degli strumenti di disegno nel vento di acquisizione delle immaginiOW (Figura 3D, 9). Obiettivo poggio assone, per esempio, con lo strumento di disegno circolare di circa 4 - 8 micron. NOTA: La zona di ablazione è regolabile da un singolo pixel in un&#39;area più ampia, a seconda dell&#39;applicazione. </li><li> Dopo aver stabilito il ROI, selezionare il pulsante &quot;Time Course&quot; (Figura 3E, 11) e confermare il numero di cicli del ROI sarà scansito / ablazione (Figura 3E, 12). Scegliere il &quot;Pre-Bleach&quot; e cornici &quot;post-Bleach&quot;, se lo desideri per consentire una visione d&#39;insieme dell&#39;intera immagine appena prima e subito dopo il processo di sbiancamento. </li><li> Dopo aver stabilito tutti i parametri di ablazione necessario, premere &quot;Run Experiment&quot; (Figura 3E, 13) e monitorare l&#39;efficienza della ablazione. NOTA: Nel nostro setup FRAP, una singola immagine verrà presa prima e dopo il ciclo FRAP con il laser appropriata excitation (ad esempio, 488 nm di eccitazione per le cellule EGFP che esprimono). Queste immagini pre e post-ablazione consentono un rapido giudizio di come soddisfacente ROI è stato sbiancato e l&#39;efficacia dei parametri di ablazione scelti erano. </li><li> Ripetere la procedura regolando l&#39;intensità del laser (Figura 3C, 8), velocità di scansione e media (Figura 3B, 4 e 5), e le ripetizioni (Figura 3E, 12) nel caso della ROI selezionata mostra ancora alta intensità di fluorescenza dopo il completamento della ciclo FRAP. </li></ol> 4. Eseguire la procedura di follow-up, tra cui pesce &quot;Rescue&quot; o lo smaltimento <ol><li> Se l&#39;esperimento è il morsetto, eutanasia l&#39;animale con una overdose di tricaine. Rimuovere l&#39;acqua uovo e sostituirlo con soluzione di riserva anestesia per 10 min. Per garantire l&#39;eutanasia, controllare sotto il microscopio per la cessazione del battito cardiaco. </li><li> Opzionale:Se l&#39;esperimento non è il morsetto, togliere il pesce con attenzione di agarosio con pinza sottile e un pennello. Mettere il pesce in acqua fresca all&#39;uovo e permettono di recuperare sotto osservazione per 15 min. Se il normale comportamento di nuoto torna, restituire il pesce per l&#39;incubatore. </li><li> Smaltire animali transgenici in base al flusso di rifiuti OGM approvato dell&#39;istituzione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Approcci ablazione laser tecniche di ablazione laser assistita consentono di targeting preciso di individui o piccoli gruppi di cellule. La combinazione di questa tecnica con microscopia ad alta risoluzione e le manipolazioni genetiche in modelli animali, come zebrafish permette ai ricercatori di studiare in modo sistematico il destino di una singola cella e le interazioni dopo l&#39;infortunio. L&#39;UV (405 nm) protocollo ablazione laser qui descritto delinea come le singole cellule possono essere stressati o uccisi in modo selettivo (in modo dose-dipendente), mentre la vicina neuroni, cellule gliali e gli assoni sono lasciati illesi. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio in esperimenti di coltura cellulare e descrivere qui l&#39;approccio dettagliato per il midollo spinale zebrafish. Mostriamo l&#39;attuazione di questo approccio nel midollo spinale zebrafish, sottolineando in modo selettivo un singolo neurone all&#39;interno di una rete di altre cellule (Figura 5, A e <strong&gt; B), o uccidendo immediatamente e senza recupero di un singolo neurone (Figura 5, C e D). In precedenza, sistemi laser specializzati, come ad esempio il laser pulsato-azoto o sistemi laser a due fotoni, sono stati necessari per indurre danni ai tessuti e transections 10, 11, 12, 13 nervo motore. Questi sistemi laser sono stati utilizzati con successo per causare danni alle cellule, come ad esempio la trombosi nelle arterie e vene 6, danno renale acuto 7, danno cardiaco 8, e di studiare le onde di calcio e la risposta della microglia dopo una lesione cerebrale 9. Inoltre, Soustelle e colleghi hanno utilizzato una configurazione confocale convenzionale (351 nm e 364 nm laser UV) per indurre danni alle epiteliali e cellule gliali in Drosophila 14 &lt;/ Sup&gt;. Importanza dei modelli Zebrafish per la comprensione ALS (e altre malattie umane) Zebrafish sono un organismo modello ampiamente utilizzato, soprattutto per gli studi di sviluppo 28, 29, 30. Mentre hanno alcune limitazioni, il loro potenziale per modellare le malattie umane e dare una comprensione dei meccanismi molecolari patogenetici è enorme. Modelli zebrafish sono stati ben consolidata per lo studio della MND e hanno portato a importanti intuizioni molecolari 31, 32, 33, 34. linee di zebrafish transgeniche possono essere rapidamente generato (4 - 5 mesi) e consentono il tracciamento selettiva di un tipo di cellula specifica, caratteristiche che li rendono una preziosa aggiunta alla modelli animali di SLA correnti fanno. embrioni di zebrafish / larve sono otticamente trasparente e offrono esperimenti unicovantaggi mentali che permettono a lungo termine live-immagini a livello di singola cellula nel cervello o al midollo spinale, che non può essere facilmente ottenuto in modelli di roditori (o nell&#39;uomo). Quando combinato con tecniche molecolari, come l&#39;ablazione singola cellula, questo fornisce una piattaforma sperimentale unica per studiare i meccanismi molecolari precisi in vivo. Motoneuroni possono essere selettivamente mirati Utilizzando UV Laser Ablation Neuroni spinali in zebrafish iniziano a sviluppare entro 10 ore dopo la nascita e sono stabiliti dopo circa 48 ore 35, 36. Questo rapido sviluppo permette la visualizzazione di questi neuroni in tempi brevi e con un elevato throughput. I motoneuroni forniscono il legame essenziale tra cervello e muscoli e, nella SLA, sono colpiti nella corteccia motoria (neuroni motori superiori), il tronco cerebrale e il midollo spinale (motoneuroni). Perdita di questi neuroni determina inevitabilmente muatrofia SCLE e debolezza. Motoneuroni del midollo spinale di zebrafish possono essere identificati dal loro proiezioni distinte e dall&#39;uso di promotori specifici del motore-neurone come -3MNX1. Targeting la soma delle cellule di tali neuroni proiettano rivelato la degenerazione anterograda lungo la proiezione assonale nel tempo (figura 4 e Video 1). L&#39;imaging risoluzione di una singola cellula dei motoneuroni spinali inoltre confermato fosfatidilserina traslocazione e annessina conseguente V-etichettatura dopo ablazione laser (vedi figura 4 e supplementare Video 3 in riferimento 27). Anche se si segnala l&#39;attivazione di annessina V morendo neuroni dopo il nostro approccio ablazione laser UV, non possiamo essere certi che la cascata di morte, che viene attivato durante questo processo accelerato corrisponde esattamente alla morte neuronale che si verifica durante la neurodegenerazione o normale omeostasi cellulare. Sebbene questo approccio ablazione è altamente riproducibilee specifiche, diverse strategie all&#39;incorporamento potrebbero anche influenzare l&#39;efficienza dell&#39;ablazione UV. Nella nostra esperienza, era più efficace per ridurre lo strato di agarosio si conficcarono nostro pesce. Spessori di mezzo di inclusione con uno strato addizionale di acqua uovo può ridurre la potenza UV infine ricevuta dalla cellula causa dell&#39;attenuazione e effetti di dispersione che si verificano lungo il percorso del fascio. In futuro, l&#39;attraversamento di diverse linee di pesci transgenici permetterà la visualizzazione della immediato e di breve termine (fino a 12 h) le risposte delle altre cellule colpite, come la glia, alla distruzione delle cellule indotta da laser. Ad esempio, astrociti e la tossicità autonoma non-cellule in malattie neurodegenerative come la SLA sono stati sotto i riflettori della ricerca e sono fortemente implicati nella patogenicità di sporadica e SLA familiare 37, 38. Tuttavia, i meccanismi alla base della tossicità gliali e selettivitàverso il motore neuroni rimangono poco chiari. Noi e gli altri recentemente approfittato di questo approccio per studiare la engulfment di morire neuroni dalla microglia e visualizzati liquidazione dei residui neuronali 27, 39, 40. Combinando la tecnica di ablazione ad alta risoluzione microscopia e marcatori per neuroinfiammazione permetterà ai ricercatori in futuro di ampliare la comprensione della funzione single-cell e sistemi cellulari interconnessi. La caratterizzazione di questi processi in un ambiente in vivo è fondamentale non solo in contesti di sviluppo, ma anche in modelli di malattie neurodegenerative, tra cui MND, in cui le interazioni cellulari può essere compromessa 3, 41.

Microscopia a fluorescenza è stato a lungo utilizzato per studiare gli effetti dei transgeni nel zebrafish sistema nervoso centrale, in particolare i loro effetti sullo sviluppo 1. -Microscopia ad alta risoluzione ha permesso una mappatura dettagliata dei processi cellulari coinvolti nello sviluppo del cervello, la generazione del muscolo, e molti altri eventi di sviluppo 2. Studiando la morte di una singola cella è stato più impegnativo, soprattutto a causa delle difficoltà tecniche di indurre la morte delle cellule selettivo durante le procedure di imaging standard. Tuttavia, la combinazione delle immagini risoluzione singola cellula e tecniche di ablazione altamente mirati permette la ricerca di risposte cellulari immediate allo stress e lesioni, nonché delle interazioni cellula-cellula conseguenti. La comprensione di questi processi è critica, soprattutto per le malattie neurodegenerative come il morbo motoneurone (MND), dove è stato dimostrato interazioni neuroni-glia di contribuire alla progressionedella malattia 3. MND, o la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i neuroni motori nel tronco encefalico, corteccia motoria, e nel midollo spinale. La perdita di questi neuroni porta alla perdita di massa muscolare, ed i pazienti muoiono entro 3 - 5 anni dalla diagnosi 4. motoneuroni del midollo spinale collegamento alle fibre muscolari e svolgono un ruolo essenziale nel facilitare la contrazione muscolare. La mancata comunicazione di questo o di morte di questi neuroni indebolisce progressivamente i muscoli e colpisce la capacità del paziente di deglutire, camminare, parlare e respirare. Visualizzare la morte di un neurone motore e le conseguenze a breve termine in un animale vivente offre un&#39;eccellente opportunità per comprendere meglio i processi dinamici coinvolti nella normale omeostasi cellulare e la malattia. Zebrafish sono emerse come un sistema modello interessante per studiare le malattie neurodegenerative 1. Questoè dovuto ai vantaggi offerti da questo organismo modello, come la fecondazione esterna, breve tempo di sviluppo, accesso ottico al sistema nervoso, e facilità di transgenesi. Inoltre, la capacità di generare facilmente composto zebrafish transgenico consente molteplici strategie di etichettatura di diversi tipi cellulari. Ablazione genetica si avvicina per uccidere specifici tipi cellulari permettono piuttosto ampia disturbo, ma non hanno la multa di controllo di colpire singole celle 5. tecniche laser assistita, invece, forniscono controllo fine temporale e spaziale e sono stati utilizzati per diversi modelli animali. Mentre la maggior parte approcci utilizzare attrezzature specializzate, come i laser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o due fotoni set-up 13 pulsata, altrogruppi di ricerca hanno recentemente approfittato di un laser UV nei microscopi confocale convenzionali 14. La tecnica qui descritta combina alta risoluzione microscopia confocale con un approccio laser-mediata UV per provocare stress cellulare o morte in maniera dose-dipendente motoneuroni selezionati. Esso si basa sull&#39;utilizzo del laser 405 nm comunemente installato, è stato testato con successo in coltura cellulare e in animali viventi, e permette la caratterizzazione dettagliata di interazioni cellulari, quali incidenza microglia dopo la morte neuronale.

<table><tbody><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Fisher-Scientific</td><td></td><td>Sciogliere in acqua d'uovo con tricaina (0,02%) a 0,8 - 1,5%</td></tr> <tr><td>Tricaina</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0,02%</td></tr> <tr><td>Parete standard di Harvard Borosilicato con filamento Vetro capillare</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>GC100F-10 (corto) GC100F-15 (lungo)</td><td>Tirare a una resistenza di 2 - 7 M&Omega;</td></tr><tr><td>Acqua d'uovo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,6 g di sale marino istantaneo dell'oceano, 4 ml di blu di metilene da 1 mg/ml in 10 litri di acqua deionizzata</td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>blocco termico</td><td>Seleziona BioProdotti</td><td>Riscaldatore digitale a blocchi (SBD110_)Apparecchio</td><td></td></tr> per <tr><td>microiniezione</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>La microiniezione è stata eseguita a mano sotto uno steromicroscopio (Leica) con un ago di vetro caricato e un Picospritzer II (General Valve corporation)</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica</td><td></td><td>La microscopia con illuminazione a campo chiaro è stata eseguita su un microscopio a dissezione stereo Leica M165FC (Leica)</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

attivazione delle cellule lo stress e la morte con i convenzionali uv laser microscopia confocale

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Utilizzando una configurazione confocale standard, un metodo di ablazione UV può essere utilizzato per indurre selettivamente il danno cellulare e per visualizzare le risposte di singole cellule e le interazioni cellula-cellula nel SNC in tempo reale. In precedenza, lo studio di queste risposte cellulo-specifiche dopo una lesione richiedeva spesso configurazioni complicate o il trasferimento di cellule o animali in ambienti diversi e non fisiologici, confondendo l'analisi immediata e a breve termine. Ad esempio, gli approcci di ablazione mediata da farmaci spesso mancano della specificità necessaria per studiare le risposte di singole cellule e le interazioni immediate cellula-cellula. Allo stesso modo, mentre gli approcci di ablazione laser pulsata ad alta potenza forniscono un ottimo controllo e penetrazione nei tessuti, richiedono apparecchiature specializzate che possono complicare la visualizzazione in tempo reale delle risposte cellulari. Il raffinato approccio di ablazione laser UV qui descritto consente ai ricercatori di stressare o uccidere una singola cellula in modo dipendente dalla dose e dal tempo utilizzando un microscopio confocale convenzionale dotato di un laser a 405 nm. Il metodo è stato applicato per ablare selettivamente un singolo neurone all'interno di una fitta rete di cellule circostanti nel midollo spinale del pesce zebra. Questo approccio ha rivelato una risposta dose-dipendente dei neuroni ablati, causando la frammentazione dei corpi cellulari e la degenerazione anterograda lungo l'assone in pochi minuti o ore. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare il destino di una singola cellula morente e, soprattutto, la risposta istantanea delle cellule, come la microglia e gli astrociti, che circondano il sito di ablazione.

Il metodo qui descritto permette l'ablazione dei motoneuroni nel midollo spinale zebrafish utilizzando il modulo FRAP di un microscopio confocale commerciale. Linee di zebrafish transgenici che esprimono una proteina fluorescente verde nei neuroni sotto il controllo di promotori specifici, come - 3mnx1, islet1, o incontrato, sono stati utilizzati. L'espressione di GFP guidata dal promotore del motoneurone (come -3mnx1 o incontrato) permette la visualizzazione ad alta risoluzione dei corpi cellulari, le principali assoni e rami periferici estendono ai muscoli (Figura 4 e video 1). I neuroni nel midollo spinale di 3 a 5 giorni di età pesci sono stati ablazione con successo, con un tempo di permanenza complessiva di 60 - 80 s ad una potenza laser di ~ 70% e le impostazioni generali descritto al punto 3. l'ablazione di successo è raggiunto quando la fluorescenza svanisce subito dopo l'ablazionee mai riprende (Figura 5, C e D). I tentativi di ablazione con altre linee laser (come ad esempio la linea laser 488 nm) non hanno comportato sbiadimento permanente, e la fluorescenza è stata ripristinata in tempi brevi. È importante sottolineare che questa tecnica ha dimostrato caratteristiche di apoptosi nei neuroni UV-ablazione, come ad esempio la presenza di annessina V, cambiamenti morfologici consistenti di Somal degenerazione e blebbing assonale del neurone ablato 27. La specificità di questo approccio è confermato negli esperimenti utilizzando il fluoroforo fotoconvertibile Kaede (che passa la sua emissione da verde a rosso dopo l'esposizione ai raggi UV), dove è stato convertito un singolo neurone bersaglio (Figura 5, A e B) senza segni di cellulari distruzione per diverse ore. L'utilizzo di un laser di potenza superiore porta invece to estinzione del neurone bersaglio (senza fotoconversione o ricomparsa della fluorescenza) e fotoconversione (senza morte) delle cellule in prossimità (~ 20 micron) al sito di ablazione (Figura 5, C e D). Un importante vantaggio di questa tecnica di ablazione laser-indotta è la dipendenza dose di approccio. Per indirizzare cellule con diverse intensità, strati multipli di messa a punto sono disponibili regolando la potenza del laser (Figura 3C, 8), la velocità di scansione e la linea media (Figura 3B, 4 e 5), la dimensione della ROI da ablazione (Figura 3D, 10), e le ripetizioni (Figura 3E, 12). In particolare, questo approccio può essere utilizzato anche per applicare stress cellulare celle individuali invece di indurre la morte cellulare. Ad esempio, la messa a punto è statamolto prezioso per valutare i processi cellulari durante la morte di un neurone. Motoneuroni con lunghe proiezioni assonale che sono stati ablated con intensità laser inferiori UV rivelato caratteristica "blebbing" (la formazione e la frammentazione delle vescicole cellulari), che ha avuto inizio alla soma mirato e continuato lungo l'assone nel corso del tempo (40 - 90 min; Figura 4 ; 3D rendering di film di questo ablazione in Video 1). Di conseguenza, modulando i diversi parametri di ablazione laser e quindi il livello di stress cellulare indotto sul decorso della morte permette ai ricercatori un elevato livello di flessibilità sperimentale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg"> Figura 1: Embedding di zebrafish per l'imaging dal vivo. (AF) Incorporare procedura per l'imaging dal vivo: (A) Tricaine viene aggiunto all'acqua uovo per anestetizzare il pesce zebra un ta dose iniziale di 50 mg / L. (B) a bassa fusione agarosio (0,8 specificato - 1,5%) viene preparato e riscaldato a 38 - 40 ° C. (C) Usando una pipetta di trasferimento, il pesce zebra esaminati e selezionati vengono trasferiti in un piatto con la soluzione tricaine. Dopo la sedazione con successo (il movimento opercolare superficiale, diminuzione della frequenza cardiaca, la mancanza di una risposta al tocco evocata), un pesce viene trasferito nel agarosio preriscaldato (D). Minimizzare la quantità di acqua di uovo che è trasferito nel agarosio per impedire successiva diluizione. (E) trasferimento di una goccia di agarosio (~ 30 - 50 mL) contenente il pesce zebra su un piatto fondo di vetro da 35 mm. Eseguire questo sotto un microscopio dissezione e utilizzare un pennello per allineare delicatamente il zebrafish al suo orientamento preferenziale. Attendere 10 - 15 minuti, fino a quando l'agarosio è impostato, e aggiungere ~ 2 ml di soluzione tricaine al piatto (F).ank "&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg"> Figura 2: Visualizzazione dei neuroni e microglia nel midollo spinale di un zebrafish 3 dpf. Visualizzazione della microglia e neuroni nel midollo spinale di un 3-day-old zebrafish transgenico che esprime (A) neuroni GFP-positive (islet1: GFP) e (B) mCherry-positivo microglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Immagine composita di canale neurone e microglia l'immagine in campo chiaro insieme. L'inserto schema in (C) illustra l'orientamento del pesce e delinea l'area presentato. Barra di scala = 30 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3: Passi nel processo di ablazione laser UV (come descritto nel protocollo, fase 3). Misure per controllare il modulo software FRAP nel software confocale (Leica Application Suite). (A) Avviare il modulo FRAP come strumento per eseguire l'ablazione laser UV. (B) Impostazione del piano z per le impostazioni di ablazione e altri FRAP come formato, la velocità e media, che determineranno il tempo di permanenza del laser. (C) Il controllo intensità del laser e la "zoom in" per massimizzare l'efficienza sbiancamento. (D) Selezione di una o più regioni di interesse (ROI) che verrà ablazione. (E) Impostazione il decorso temporale di sbiancamento determina i cicli di lavaggio e il tempo complessivo di sosta laser sul ROI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare il suo</a> e per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg"> Figura 4: degenerazione Anterograde di un neurone UV-ablazione. time-lapse imaging della neurodegenerazione di un neurone spinale UV-ablazione. (AF) UV-irradiazione di un singolo neurone spinale (incontrato: GAL4, UAS: EGFP; A; cerchio) ha provocato la soma del neurone contrazione e arrotondamento nel tempo (AC), seguita da assonale frammentazione (CF; punte di freccia) . La degenerazione assonale iniziata alla soma (sito di ablazione) e progredito anterograda verso l'estremità distale del assone finché, la fluorescenza nel soma scomparve e l'intero assone mostrato "blebbing" (DF). Barre di scala = 20 micron. Il time-lapse film in 3D-rendering di questo ablazione è mostrato in Video 1.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg"> Figura 5: conferma dell'effetto di cella singola irradiazione UV utilizzando un fluoroforo fotoconvertibile (Kaede) in un motoneurone. Convalida di cella singola irradiazione UV attraverso l'attivazione del fotoconvertibile fluoroforo Kaede in un neurone. (AD) irradiazione UV di neuroni marcati con Kaede. (A) Fotoconversione di un singolo neurone (cerchio) con una potenza laser del 30% per 10 s portato alla fotoconversione di Kaede (da verde a rosso) solo neurone individuale mirata (B). Si noti che la cella convertito sopravvissuto per diverse ore e non ha mostrato segni visivi di deterioramento, come blebbing o arrotondamento in su. Ablazione di un singolo neurone (C ; cerchio) con una potenza laser maggiore (95% per 10 s) portato immediata scomparsa di quel neurone (D) e successiva fotoconversione di Kaede in un piccolo numero di neuroni circostanti entro un raggio di circa 20 micron. Barre di scala = 20 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg"> Video 1: Rappresentazione superficie 3D (Imaris) del UV ablated neurone illustrata in figura 4. Il time-lapse video del neurone rappresentato in figura 4 è reso superficie utilizzando un software di visualizzazione (Imaris, Bitplane). Si evidenzia il processo di restringimento del soma ablato, seguita dalla frammentazione assonale anterogradely verso l'estremità distale della cella.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "&gt; Clicca qui per scaricare il file. Figura supplementare 1: fusione agarosio opzionale per l'imaging di lunga data. Per evitare spostamenti del pesce e l'agarosio durante l'acquisizione lungo termine preparare una ciambella a forma di cerchio di agarosio lungo i bordi al centro della piastra da 35 millimetri di vetro-inferiore (A). Lasciare il set di agarosio per ~ 10 min e trasferiti i pesci nel cerchio interno con una goccia di agarosio (B). Cercare di minimizzare la quantità di agarosio per l'incorporamento (pennello eccesso di agarosio all'esterno dopo orientando il pesce). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare il file.</a>

Le manipolazioni mirate per causare stress diretto o morte nelle singole cellule sono state relativamente difficili da realizzare. In questo articolo, viene descritto un approccio di ablazione con risoluzione di singole cellule per stressare e uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare e animali viventi basato su un laser UV confocale standard.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

L'obiettivo generale di questo approccio di ablazione cellulare è quello di stressare o uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare o in animali vivi. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare il destino di una singola cellula morente e la risposta delle cellule, come la microglia e gli astrociti, al sito di ablazione circostante. Il vantaggio principale di questa tecnica è il targeting preciso delle singole cellule, che può essere ottenuto con un normale microscopio confocale dotato di un laser a 405 nanometri.Utilizziamo il pesce zebra come sistema modello per studiare malattie neurodegenerative come la malattia del motoneurone o la demenza frontotemporale. Visualizzare la morte di un motoneurone e le conseguenze che ne derivano offre un'eccellente opportunità per comprendere meglio i processi dinamici coinvolti nella malattia. Il nostro approccio per infliggere stress cellulare in modo dose-dipendente consente una caratterizzazione dettagliata delle interazioni cellulari.Ad esempio, la clearance della microglia dopo la morte nueronale. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui meccanismi di malattia di un organismo vivente, può anche essere applicato in modo simile in cellule isolate in coltura. Dopo aver impostato le linee transgeniche maschili e femminili per l'accoppiamento secondo il protocollo di testo, utilizzare un colino da tè di plastica per raccogliere gli embrioni dopo la deposizione delle uova filtrando l'acqua della vasca.Quindi usa l'acqua dell'uovo per sciacquare le uova e trasferiscile nell'acqua dell'uovo in una capsula di Petri. Esamina gli embrioni al microscopio ottico per determinare la fecondazione. Quindi incubare le uova fecondate a 28 gradi Celsius.Quando gli embrioni raggiungono da due a cinque giorni dopo la fecondazione o DPF, sottoporli a un microscopio composto a fluorescenza e sottoporre gli embrioni a screening per l'espressione appropriata del fluoroforo. Quindi separare il pesce con etichetta vivace in un piatto fresco con acqua d'uovo per incorporarlo successivamente. Per incorporare il pesce zebra nell'agarosio, preparare una soluzione anestesiologica aggiungendo quattro grammi per litro di MS 222 goccia per goccia a una capsula di Petri contenente acqua d'uovo.Preparare una scorta di agarosio a basso punto di fusione e acqua d'uovo e aliquotarla in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Metti un'aliquota in un blocco di calore a 38-40 gradi Celsius e lasciala equilibrare. Per tempi di imaging superiori a quattro ore, pipettare circa 300 microlitri di agarosio lungo il cerchio interno di un piatto con fondo di vetro per preparare un cerchio a forma di ciambella con una piccola apertura al centro.Per montare il pesce zebra in agarosio per microscopia, dopo aver anestetizzato il pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta regolabile per aspirare una larva e lasciarla affondare sul fondo della punta. Far cadere la larva in un volume minimo di liquido nell'agarosio preriscaldato. Aspirare quindi il pesce con l'agarosio e distribuirlo rapidamente in un piatto da 35 millimetri con fondo di vetro precedentemente preparato.Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un pennello standard per posizionare l'animale o più animali all'interno dell'agarosio sui lati in modo che il corpo e la coda siano piatti. Lasciare riposare il pesce incorporato per 10-15 minuti fino a quando l'agarosio non si sarà ben solidificato. Quindi utilizzare circa due millilitri di acqua d'uovo con tricaina per rabboccare accuratamente la capsula di Petri da 35 millimetri.Posizionare la capsula di Petri con una larva incorporata sul tavolino del microscopio confocale e, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro e l'ingrandimento 40x, mettere a fuoco il lato dorsale del midollo spinale dell'animale. Passa a un'impostazione di fluorescenza appropriata e visualizza la struttura di interesse per confermare che tutti i parametri di imaging siano necessari per la successiva ablazione. Per determinare lo spessore della struttura per l'ablazione laser UV, utilizzare l'unità Z per verificare la parte superiore e inferiore della struttura di interesse mettendo a fuoco manualmente su e giù.Registra manualmente il piano Z che verrà ablato. Ad esempio, il centro della cella. Per eseguire l'ablazione laser, avviare la procedura guidata FRAP facendo clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu del software.Dalla nuova finestra, è possibile determinare i parametri dell'immagine per l'approccio all'ablazione selezionando il formato, la velocità di scansione e la media. Se il piano Z per l'ablazione non è già stato selezionato, premere il pulsante Live e mettere a fuoco il campione fino a quando la struttura fluorescente o il piano Z desiderato da ablare non è a fuoco. Una volta impostati i parametri generali dell'immagine, accedi alla fase Bleach per controllare i componenti specifici dell'ablazione.Quindi attivare il laser a 405 nanometri attivandolo per la procedura di sbiancamento. Quindi, utilizza l'opzione Zoom avanti per massimizzare l'intensità dello sbiancamento al ROI selezionato riducendo il campo di scansione, massimizzando così il tempo di permanenza. Selezionare una o più ROI per l'ablazione utilizzando uno qualsiasi degli strumenti di disegno nella finestra Acquisizione immagine.Prendi di mira la collinetta dell'assone, ad esempio, con lo strumento di disegno circolare di circa quattro-otto micrometri. Dopo aver stabilito la ROI, selezionare il pulsante Andamento temporale e confermare il numero di cicli in cui le ROI verranno scansionate e ablate. Scegli i fotogrammi Pre-Bleach e Post-Bleach come desiderato per consentire una panoramica dell'intera immagine appena prima e subito dopo il processo di sbiancamento.Queste impostazioni consentono ai ricercatori più livelli di raffinatezza. Attraverso la regolazione della potenza del laser, della velocità di scansione, della media delle linee, delle dimensioni della regione di interesse e delle ripetizioni, questa tecnica offre un alto grado di libertà per causare stress o morte nelle singole cellule. Dopo aver stabilito tutti i parametri di ablazione necessari, premere Esegui esperimento e monitorare l'efficienza dell'ablazione.Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. In questo esperimento, l'ablazione laser UV è stata effettuata su motoneuroni che esprimono GFP nel midollo spinale di zebrafish transgenico. L'espressione della GFP guidata da promotori di motoneuroni come 3 MINX one, IO one o MET consente la visualizzazione ad alta risoluzione dei corpi cellulari, dei principali assoni e dei rami periferici che si estendono ai muscoli.Il successo dell'ablazione dei neuroni nel midollo spinale è stato ottenuto quando la fluorescenza svanisce immediatamente dopo l'ablazione e non riprende più. La specificità di questo approccio è confermata come mostrato qui, dove un singolo neurone bersaglio è stato convertito utilizzando il fotofluro fotoconvertibile Kaede che cambia la sua emissione da verde a rosso dopo l'esposizione alla luce UV. Per indirizzare le cellule con intensità diverse, sono disponibili più livelli di regolazione fine regolando la potenza del laser, la velocità di scansione, la media delle linee, la dimensione della ROI da ablare e le ripetizioni.Come mostrato qui, i motoneuroni con lunghe proiezioni assonali che sono stati ablati al soma con intensità laser UV inferiori hanno rivelato un caratteristico blebbing che è continuato dal soma lungo l'assone nel tempo. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che ogni configurazione confocale è unica e che la potenza del laser per ogni strumento è specifica e può differire. Dopo la procedura, le caratteristiche della morte cellulare apoptotica possono essere osservate nei neuroni ablati.Possono essere rilevati in modo riproducibile marcatori apoptotici come XN 5 o cambiamenti morfologici come la degenerazione somica o il blebbing esterno. Ulteriori test possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come le prestazioni di nuoto siano influenzate dall'ablazione di uno o più neuroni nel midollo spinale. Incrociando diverse linee transgeniche di zebrafish, i ricercatori possono studiare la risposta di altre cellule alla distruzione cellulare indotta dal laser.Questi metodi forniscono una piattaforma sperimentale unica per comprendere i precisi meccanismi molecolari di una malattia come la MND in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il pesce zebra per la microscopia confocale e di come eseguire l'ablazione laser UV a cellula singola.

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Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death utilizzando la microscopia confocale laser UV convenzionale. J. Vis. Exp. (2017) In questo video, esploriamo la tecnica dell'ablazione laser UV ad alta intensità per indirizzare e studiare con precisione i singoli neuroni nel pesce zebra transgenico. Dimostriamo come preparare, immobilizzare e visualizzare le risposte neuronali, evidenziando le dinamiche cellulari della lesione e del recupero.

Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Viene introdotto un setup sperimentale originale per le celle di riscaldamento in un piatto di coltura utilizzando radiazioni laser a onda continua da 1,94 μm. Utilizzando questo metodo, le risposte biologiche delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) dopo diverse esposizioni termiche possono essere studiate.

Laser di Thulium ad onda continua per la cottura delle cellule coltivate per indagare gli effetti termici cellulari

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Il laser a femtosecondi strettamente focalizzato può fornire una stimolazione precisa alle cellule aggiungendosi a una microscopia confocale che consenta l'osservazione e la fotostimolazione in tempo reale. La fotostimolazione può attivare eventi molecolari cellulari, tra cui percorso di segnalazione ERK e lampi mitocondriali di specie reattive dell'ossigeno.

La fotostimolazione da parte del laser Femtosecondo attiva la segnalazione o eventi mitocondriali regolati dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule bersaglio

Questo protocollo dimostra il rilevamento simultaneo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), cellule vive e cellule morte nelle colture primarie vive da cellule superficiali del topo. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, iodio propidio e colorazione Hoechst sono utilizzati per valutare il ROS, le cellule morte e le cellule vive, seguita dall'imaging e dall'analisi.

Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

Impara l'ablazione laser UV a singola cellula per studiare lo stress cellulare e la morte neuronale utilizzando Danio rerio. Questo metodo consente di analizzare le risposte di microglia e astrociti in vivo.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

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