Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

L'obiettivo generale di questo approccio di ablazione cellulare è quello di stressare o uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare o in animali vivi. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare il destino di una singola cellula morente e la risposta delle cellule, come la microglia e gli astrociti, al sito di ablazione circostante. Il vantaggio principale di questa tecnica è il targeting preciso delle singole cellule, che può essere ottenuto con un normale microscopio confocale dotato di un laser a 405 nanometri.

Utilizziamo il pesce zebra come sistema modello per studiare malattie neurodegenerative come la malattia del motoneurone o la demenza frontotemporale. Visualizzare la morte di un motoneurone e le conseguenze che ne derivano offre un'eccellente opportunità per comprendere meglio i processi dinamici coinvolti nella malattia. Il nostro approccio per infliggere stress cellulare in modo dose-dipendente consente una caratterizzazione dettagliata delle interazioni cellulari.

Ad esempio, la clearance della microglia dopo la morte nueronale. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui meccanismi di malattia di un organismo vivente, può anche essere applicato in modo simile in cellule isolate in coltura. Dopo aver impostato le linee transgeniche maschili e femminili per l'accoppiamento secondo il protocollo di testo, utilizzare un colino da tè di plastica per raccogliere gli embrioni dopo la deposizione delle uova filtrando l'acqua della vasca.

Quindi usa l'acqua dell'uovo per sciacquare le uova e trasferiscile nell'acqua dell'uovo in una capsula di Petri. Esamina gli embrioni al microscopio ottico per determinare la fecondazione. Quindi incubare le uova fecondate a 28 gradi Celsius.

Quando gli embrioni raggiungono da due a cinque giorni dopo la fecondazione o DPF, sottoporli a un microscopio composto a fluorescenza e sottoporre gli embrioni a screening per l'espressione appropriata del fluoroforo. Quindi separare il pesce con etichetta vivace in un piatto fresco con acqua d'uovo per incorporarlo successivamente. Per incorporare il pesce zebra nell'agarosio, preparare una soluzione anestesiologica aggiungendo quattro grammi per litro di MS 222 goccia per goccia a una capsula di Petri contenente acqua d'uovo.

Preparare una scorta di agarosio a basso punto di fusione e acqua d'uovo e aliquotarla in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Metti un'aliquota in un blocco di calore a 38-40 gradi Celsius e lasciala equilibrare. Per tempi di imaging superiori a quattro ore, pipettare circa 300 microlitri di agarosio lungo il cerchio interno di un piatto con fondo di vetro per preparare un cerchio a forma di ciambella con una piccola apertura al centro.

Per montare il pesce zebra in agarosio per microscopia, dopo aver anestetizzato il pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta regolabile per aspirare una larva e lasciarla affondare sul fondo della punta. Far cadere la larva in un volume minimo di liquido nell'agarosio preriscaldato. Aspirare quindi il pesce con l'agarosio e distribuirlo rapidamente in un piatto da 35 millimetri con fondo di vetro precedentemente preparato.

Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un pennello standard per posizionare l'animale o più animali all'interno dell'agarosio sui lati in modo che il corpo e la coda siano piatti. Lasciare riposare il pesce incorporato per 10-15 minuti fino a quando l'agarosio non si sarà ben solidificato. Quindi utilizzare circa due millilitri di acqua d'uovo con tricaina per rabboccare accuratamente la capsula di Petri da 35 millimetri.

Posizionare la capsula di Petri con una larva incorporata sul tavolino del microscopio confocale e, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro e l'ingrandimento 40x, mettere a fuoco il lato dorsale del midollo spinale dell'animale. Passa a un'impostazione di fluorescenza appropriata e visualizza la struttura di interesse per confermare che tutti i parametri di imaging siano necessari per la successiva ablazione. Per determinare lo spessore della struttura per l'ablazione laser UV, utilizzare l'unità Z per verificare la parte superiore e inferiore della struttura di interesse mettendo a fuoco manualmente su e giù.

Registra manualmente il piano Z che verrà ablato. Ad esempio, il centro della cella. Per eseguire l'ablazione laser, avviare la procedura guidata FRAP facendo clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu del software.

Dalla nuova finestra, è possibile determinare i parametri dell'immagine per l'approccio all'ablazione selezionando il formato, la velocità di scansione e la media. Se il piano Z per l'ablazione non è già stato selezionato, premere il pulsante Live e mettere a fuoco il campione fino a quando la struttura fluorescente o il piano Z desiderato da ablare non è a fuoco. Una volta impostati i parametri generali dell'immagine, accedi alla fase Bleach per controllare i componenti specifici dell'ablazione.

Quindi attivare il laser a 405 nanometri attivandolo per la procedura di sbiancamento. Quindi, utilizza l'opzione Zoom avanti per massimizzare l'intensità dello sbiancamento al ROI selezionato riducendo il campo di scansione, massimizzando così il tempo di permanenza. Selezionare una o più ROI per l'ablazione utilizzando uno qualsiasi degli strumenti di disegno nella finestra Acquisizione immagine.

Prendi di mira la collinetta dell'assone, ad esempio, con lo strumento di disegno circolare di circa quattro-otto micrometri. Dopo aver stabilito la ROI, selezionare il pulsante Andamento temporale e confermare il numero di cicli in cui le ROI verranno scansionate e ablate. Scegli i fotogrammi Pre-Bleach e Post-Bleach come desiderato per consentire una panoramica dell'intera immagine appena prima e subito dopo il processo di sbiancamento.

Queste impostazioni consentono ai ricercatori più livelli di raffinatezza. Attraverso la regolazione della potenza del laser, della velocità di scansione, della media delle linee, delle dimensioni della regione di interesse e delle ripetizioni, questa tecnica offre un alto grado di libertà per causare stress o morte nelle singole cellule. Dopo aver stabilito tutti i parametri di ablazione necessari, premere Esegui esperimento e monitorare l'efficienza dell'ablazione.

Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. In questo esperimento, l'ablazione laser UV è stata effettuata su motoneuroni che esprimono GFP nel midollo spinale di zebrafish transgenico. L'espressione della GFP guidata da promotori di motoneuroni come 3 MINX one, IO one o MET consente la visualizzazione ad alta risoluzione dei corpi cellulari, dei principali assoni e dei rami periferici che si estendono ai muscoli.

Il successo dell'ablazione dei neuroni nel midollo spinale è stato ottenuto quando la fluorescenza svanisce immediatamente dopo l'ablazione e non riprende più. La specificità di questo approccio è confermata come mostrato qui, dove un singolo neurone bersaglio è stato convertito utilizzando il fotofluro fotoconvertibile Kaede che cambia la sua emissione da verde a rosso dopo l'esposizione alla luce UV. Per indirizzare le cellule con intensità diverse, sono disponibili più livelli di regolazione fine regolando la potenza del laser, la velocità di scansione, la media delle linee, la dimensione della ROI da ablare e le ripetizioni.

Come mostrato qui, i motoneuroni con lunghe proiezioni assonali che sono stati ablati al soma con intensità laser UV inferiori hanno rivelato un caratteristico blebbing che è continuato dal soma lungo l'assone nel tempo. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che ogni configurazione confocale è unica e che la potenza del laser per ogni strumento è specifica e può differire. Dopo la procedura, le caratteristiche della morte cellulare apoptotica possono essere osservate nei neuroni ablati.

Possono essere rilevati in modo riproducibile marcatori apoptotici come XN 5 o cambiamenti morfologici come la degenerazione somica o il blebbing esterno. Ulteriori test possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come le prestazioni di nuoto siano influenzate dall'ablazione di uno o più neuroni nel midollo spinale. Incrociando diverse linee transgeniche di zebrafish, i ricercatori possono studiare la risposta di altre cellule alla distruzione cellulare indotta dal laser.

Questi metodi forniscono una piattaforma sperimentale unica per comprendere i precisi meccanismi molecolari di una malattia come la MND in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il pesce zebra per la microscopia confocale e di come eseguire l'ablazione laser UV a cellula singola.