Dissociazione meccanica: un metodo per ottenere cellule vitali da un tessuto

Per prima cosa, pesa un frammento di tessuto e misurane la lunghezza, la larghezza e l'altezza. Metti il fazzoletto in un piatto di coltura con un terreno di coltura e taglialo a pezzetti usando un bisturi. Trasferire il tutto in una provetta a C per l'omogeneizzazione utilizzando una pipetta Pasteur.

Posizionare il tubo in un dissociatore meccanico ed eseguire i cicli secondo necessità. L'apparato utilizza forze meccaniche per estrarre singole cellule vitali dal campione di tessuto mantenendo l'integrità cellulare, comprese le proteine di superficie. Decantare l'omogeneizzato attraverso un colino cellulare fissato su una provetta da centrifuga.

Riomogeneizzare il tessuto rimanente e filtrare l'omogenato attraverso il filtro cellulare nella provetta. Centrifugare l'omogeneizzato e rimuovere il surnatante. A questo punto, risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura e trasferire una piccola quantità di sospensione cellulare in una provetta contenente la colorazione blu di tripano.

Dopo la colorazione, trasferire le cellule su un vetrino per emocitometro. Contare le celle vitali trasparenti. Le cellule morte assorbono la colorazione, poiché la loro membrana cellulare non è intatta. Nel seguente protocollo, eseguiremo la dissociazione non enzimatica di tessuto umano fresco per l'analisi quantitativa e qualitativa delle cellule CD45+.

- Inizia pesando il campione di tessuto e poi misurando la lunghezza, la larghezza e l'altezza del tessuto. Quindi trasferire il frammento di tessuto in una piccola capsula di Petri contenente 1 millilitro del terreno cellulare ematopoietico appropriato chimicamente definito, privo di siero, e utilizzare un bisturi sterile per tagliare i campioni in piccoli pezzi da 1 a 2 millimetri quadrati. Quindi, trasferire il contenuto del piatto in un tubo C con dissociatore meccanico e sciacquare il piatto e il bisturi con 2 millilitri di terreno.

Aggiungere il lavaggio al tubo C e quindi eseguire il programma di dissociazione meccanica 8.01 due volte di seguito per omogeneizzare delicatamente i frammenti di tessuto in una sospensione di una singola cellula. Dopo il secondo ciclo, decantare l'omogeneizzato attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi utilizzare la stessa pipetta Pasteur del lavaggio della capsula di Petri per trasferire il liquido rimasto nella provetta C nel filtro cellulare.

Quindi, utilizzare una micropipetta da 1 millilitro per trasferire il liquido filtrato in una provetta conica da 15 millilitri e sciacquare la provetta C con altri 3 millilitri di terreno. Trasferire questo lavaggio attraverso il colino cellulare nella provetta da 50 millilitri. Quindi spostare delicatamente il tessuto non omogeneizzato attorno al colino con una punta pulita da 1 millilitro per spremere la massima quantità di liquido residuo intrappolato nel tessuto nel tubo da 50 millilitri. Ora posiziona il filtro cellulare capovolto sopra il tubo C originale e risciacqua il filtro con altri 3 millilitri di terreno in modo che il tessuto non omogeneizzato ricada nel tubo C.

Riomogeneizzare il tessuto per altri due cicli, come appena dimostrato, e poi versare nuovamente il secondo omogenato attraverso il colino cellulare. Sciacquare il tubo C con altri 3 millilitri di terreno. Quindi filtrare il surnatante attraverso il colino e spremere il liquido residuo dal tessuto, come appena dimostrato. A questo punto, un volume di circa 2,5 millilitri di sospensione a cellula singola dovrebbe essere presente nel tubo da 15 millilitri e circa 9 millilitri dovrebbero essere osservati nel tubo da 50 millilitri.

Per separare il surnatante tissutale dalle cellule, centrifugare prima entrambe le provette di omogenato per 15 minuti a 600 Gs a temperatura ambiente. Decantare il surnatante dal tubo da 15 millilitri in un tubo da 1,5 millilitri, posizionandolo a 4 gradi Celsius, ed eliminare il surnatante dal tubo da 50 millilitri. Quindi picchiettare delicatamente ogni tubo su una superficie dura per rompere ciascuno dei pellet cellulari.

Rimettere in sospensione il pellet di celle sciolte nel tubo da 50 millilitri con 500 microlitri di terreno e trasferire le celle nel tubo da 15 millilitri per risospendere il secondo pellet. Quindi sciacquare la provetta da 50 millilitri con altri 500 microlitri di terreno e trasferire il lavaggio nella provetta da 15 millilitri per il massimo recupero cellulare. Dopo aver contato il numero di cellule vitali per esclusione del blu di tripano, pellettare la sospensione cellulare.

Infine, centrifugare il surnatante tissutale riservato. Quindi trasferire con cura il surnatante in almeno una provetta pulita senza toccare o disturbare il pellet e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per future analisi a valle.