Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

- Le cellule dendritiche o DC sono cellule chiave che presentano l'antigene e attivano le cellule T. Nei pazienti leucemici, queste cellule esprimono scarsamente l'antigene associato al tumore e non riescono a suscitare una risposta immunitaria antigene specifica. Le cellule dendritiche sono abbondanti nel midollo osseo. E quindi, il midollo osseo è il sito preferito per il loro isolamento per aiutare a studiare il loro ruolo nel cancro.

Per ottenere cellule dendritiche, estrarre il midollo osseo dal femore o dall'osso della tibia di un topo soppresso utilizzando una siringa riempita di terreno per sciacquarlo. Centrifugare e risospendere il pellet in tampone ammonio-cloruro-potassio o ACK per lisi gli eritrociti. Ora aggiungere i terreni di coltura per arrestare la lisi e centrifugare. Risospendere il pellet nel terreno di coltura contenente un antibiotico. Aggiungere il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi o GM-CSF e trasferire la sospensione cellulare in una piastra di Petri.

Incubare la piastra per il tempo desiderato. GM-CSF aiuta le cellule progenitrici a differenziarsi in cellule dendritiche. Infine, attivare le cellule con lipopolisaccaridi o LPS, che si lega al recettore di superficie delle cellule dendritiche, dando vita a cellule dendritiche del midollo osseo completamente mature e immunogeniche. In questo protocollo, dimostreremo la generazione di cellule dendritiche dal midollo osseo del topo.

- Per generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, isolare il midollo osseo dai femori di topi wild type o knockout per il fattore B, come dimostrato, e lisare i globuli rossi in 5 millilitri di tampone di lisi ACK, interrompendo la reazione con 10 millilitri di RPMI, integrato con FBS all'1% dopo cinque minuti.

Dopo aver raccolto le cellule del sangue intero mediante centrifugazione, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura a una concentrazione da 2 volte 10 a 6 cellule per millilitro e aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF alle cellule, prima di seminare 10 millilitri di cellule su singole piastre di Petri da 100 per 15 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei giorni. Il sesto giorno, attivare le colture di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo con 25 microgrammi per millilitro di LPS per piastra.