Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Questo metodo è stato progettato per aiutare gli scienziati a isolare le DC derivate dai monociti dal sangue e dai tumori di topi portatori di tumore, al fine di studiarne le proprietà immunostimolatorie. Penso che il vantaggio principale di questa procedura rispetto ad altri metodi sia che le DC ottenute derivate dai monociti riflettono meglio il loro stato di attivazione nel tumore e nel sangue. La cosa più difficile è probabilmente assicurarsi che tutti i reagenti e gli strumenti siano sterili e che non si introducano contaminazioni durante questa procedura.

Isolo cellule mieloidi e cellule dendritiche dai tumori da oltre 15 anni e ho avuto l'idea di questo metodo quando ho notato che diversi protocolli di isolamento portavano a diversi modelli di attivazione cellulare. A dimostrare la procedura sarà la signora Santana-Magal, che è una studentessa laureata nel mio laboratorio.

Dopo l'eutanasia dei topi utilizzando anidride carbonica all'interno di una cappa a flusso laminare, estrarre i tumori e metterli in terreno RPMI senza siero fetale bovino. Quindi, usa le forbici chirurgiche per tagliare il tumore in piccoli pezzi. Trasferire tutti i pezzi tumorali da un singolo topo a una provetta a fondo piatto da 30 millilitri contenente tampone HBSS integrato con collagenasi IV e DNasi I insieme alle ancorette magnetiche.

Incubare la provetta con i pezzi tumorali su un agitatore a 37 gradi Celsius con un agitatore magnetico all'interno a 200-400 giri al minuto per 20-30 minuti. Quindi, filtrare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 micrometri. Quindi, centrifugare le celle a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione madre a gradiente di densità a 8,5 millilitri di HBSS. Quindi, mescolare energicamente il mezzo del gradiente di densità. Quindi, pipettare la miscela nel pellet.

Centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante al termine della centrifugazione. Dopo aver lavato due volte le celle pellettate, risospendere in un millilitro di tampone di isolamento.

Aggiungere la sospensione cellulare a 30 microlitri di microsfere magnetiche coniugate CD11b. Quindi, incubare la miscela a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di isolamento.

Applicare la sospensione cellulare su una colonna magnetica prelavata. Quindi, utilizzare tre millilitri di tampone di isolamento per lavare la colonna due volte. Quindi, rimuovere la colonna dal magnete.

Quindi, aggiungere sei millilitri di tampone di isolamento nella colonna. Spingere con uno stantuffo per eliminare le cellule marcate magneticamente in una provetta di raccolta sterile. Ancora una volta, centrifugare le celle a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver risospeso e colorato le cellule, ordinare le cellule bloccando le celle piccole, utilizzando il lato piccolo e la piccola dispersione in avanti. Dopo l'eutanasia del topo, spruzzare su di esso il 70% di etanolo. Quindi, utilizzare le forbici chirurgiche per rimuovere la pelle che copre il cuore sotto il cappuccio laminare.

Quindi, pulisci le forbici con etanolo. Lavare la cavità con EDTA HBSS da 20 millimolari e utilizzare le forbici per tagliare l'atrio destro del cuore. Quindi, utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 25 per lavare lentamente il ventricolo destro del cuore con EDTA HBSS da 20 millimolari.

Quindi, utilizzare una siringa sterile per prelevare il sangue dalla cavità pleurica. Trasferire il sangue in una provetta contenente eparan solfato e EDTA. Quindi, pipettare il sangue sul mezzo del gradiente di densità.

Centrifugare le cellule del sangue a 400 volte g per 15 minuti a temperatura ambiente con freno basso. Dopo la centrifugazione, raccogliere le cellule mononucleate in una provetta. Sciogliere le cellule in 10 millilitri di tampone di isolamento per lavare le cellule.

Anche in questo caso, centrifugare le celle a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius. Per selezionare le cellule CD11b, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di isolamento. Incubare per 15 minuti con 50 microlitri di microsfere magnetiche coniugate CD11b a quattro gradi Celsius.

Ricentrifugare a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di isolamento.

Successivamente, applicare la sospensione cellulare su una colonna magnetica prelavata. Lavare due volte la colonna con il tampone di isolamento. Rimuovere la colonna dal magnete e aggiungere sei millilitri di tampone di isolamento sulla colonna.

Quindi, sciacquare le cellule marcate magneticamente in una provetta di raccolta sterile spingendo lo stantuffo. Centrifugare le celle a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere le cellule in tampone di isolamento e colorarle con anticorpi coniugati con fluoroforo.

Ordina le celle controllando le celle piccole usando il lato piccolo e la piccola dispersione in avanti. Per prima cosa, fissare le cellule in paraformaldeide tamponata all'1,8% per 10 minuti a temperatura ambiente. Seminare la sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a forma di U.

Quindi, aggiungere diverse diluizioni di anticorpi leganti il tumore in ciascun pozzetto. Successivamente, incubare le cellule su ghiaccio per 15-20 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 150 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi, centrifugare a 400 volte g per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, espellere il surnatante e lavare le cellule due volte. Sciogliere le cellule in 100 microlitri di tampone FACS contenente anticorpo secondario coniugato con fluoroforo.

Quindi, incubare la piastra sul ghiaccio per 15-20 minuti. Dopo 15-20 minuti, aggiungere 200 microlitri di tampone FACS per lavare le cellule. Centrifugare la piastra a 400 volte g per cinque-10 minuti.

Decantare il surnatante. Condurre la citometria a flusso per analizzare il legame del tumore e determinare la concentrazione minima di immunoglobulina G necessaria per rivestire le cellule. Una volta che le cellule sono rivestite con una concentrazione minima di immunoglobuline G, aggiungere l'immunocomplesso tumorale marcato con CFSE alle cellule dendritiche derivate dai monociti in un rapporto di uno a cinque.

Quindi, incubare la miscela per 12-16 ore durante la notte in un terreno completo. Eseguire l'analisi FACS dell'attivazione delle cellule dendritiche derivate dai monociti. L'intensità media della fluorescenza viene calcolata in seguito all'analisi citofluorimetrica per studiare la presenza di anticorpi IgG e M che legano ex vivo le cellule tumorali LMP.

I risultati mostrano che gli anticorpi IgG dei topi allogenici C57-Black/6 legano le cellule tumorali molto più forte degli anticorpi dei topi singenici 129S1. Quindi, viene calcolata l'intensità media di fluorescenza della capacità di legame delle cellule tumorali B16F10 con le IgG. Le IgG ottenute da topi allogenici 129S1 mostrano un'intensità di colorazione 10 volte superiore con il tumore B16F10 rispetto alle IgG singeniche dei topi C57-Black/6.

Successivamente, vengono acquisite immagini microscopiche DIC per mostrare le cellule dendritiche associate al tumore, derivate dai monociti, dai tumori B16F10. Qui, vengono catturate immagini DIC per mostrare le cellule dendritiche infiammatorie e di pattugliamento derivate dai monociti isolate dal sangue di topi portatori di tumore B16F10. L'analisi citofluorimetrica viene eseguita anche per confrontare i modelli di attivazione delle cellule dendritiche derivate dai monociti della milza e del midollo osseo con quelli del tumore e del sangue durante l'incubazione con l'immunocomplesso.

Il risultato mostra un aumento dell'espressione di CD86 e MHC II da parte del midollo osseo e delle cellule dendritiche spleniche con gli immunocomplessi. Quindi, viene eseguita l'immunoistochimica confocale, che mostra l'assorbimento del tumore e l'espressione di MHC II quando le cellule dendritiche vengono incubate con l'immunocomplesso tumorale marcato con CFSE. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in poche ore a seconda del numero di mouse che stai utilizzando.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre sterili tutti i reagenti e gli strumenti. La pelliccia di topo è una delle principali fonti di contaminazioni. Assicurati che nessuno dei peli tocchi i tuoi tessuti.

Ci auguriamo che dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come isolare le DC derivate dai monociti dal sangue e dai tumori di topo e come attivarle successivamente con cellule immunocomplesse evitando la loro attivazione prematura.