Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Questo metodo può consentire ai ricercatori di acquisire un numero sufficiente di tipi di cellule per rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia dello sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su pochi marcatori selezionati per isolare un gran numero di cellule che tradizionalmente si trovano in basso numero ex vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trapianto terapeutico di midollo osseo, perché consente l'isolamento di un gran numero di progenitori.

Per iniziare il protocollo, saturare le zampe posteriori e il busto di un topo precedentemente preparato con etanolo al 75% e praticare tagli superficiali attraverso la pelle intorno all'articolazione dell'anca con forbici per tessuti curvi. Quindi, rimuovere e spogliare le zampe posteriori. Usando una pinza, tira con decisione la pelle dall'anca verso la caviglia, rivelando il muscolo, e usa le forbici per rimuovere il lembo della pelle.

Taglia appena sopra il femore e l'articolazione dell'anca e rimuovi l'intera zampa posteriore tagliando l'osso. Lavorando in una cappa di biosicurezza sterile, trasferire le gambe in una delle piastre di Petri precedentemente preparate. Usa le forbici per tagliare appena sotto la caviglia e rimuovi con cura il più possibile il muscolo e il tessuto connettivo elastico.

Trasferire l'osso pulito nella seconda capsula di Petri preparata. Quindi, separa il femore, il ginocchio e la tibia. Usando una pinza, tieni la gamba al ginocchio e individua il midollo, una debole linea rossa all'interno della cavità ossea nella parte superiore del femore e verso la fine della tibia.

Con le forbici, taglia la tibia appena sopra il punto in cui sembra finire il midollo. Taglia appena sotto l'articolazione del ginocchio, taglia appena sopra l'articolazione del ginocchio. Quindi, sciacquare il midollo osseo dal femore e dalla tibia.

Riempire una siringa da 10 millilitri con il terreno completo del tubo conico da 50 millilitri e tappare la siringa con un ago da 23 gauge. Tenendo l'osso con una pinza sopra la terza capsula di Petri preparata, inserire l'ago nel canale osseo e spingere il terreno attraverso di esso, espellendo le cellule. Ripeti questo passaggio fino a quando non è più possibile vedere il colore attraverso l'osso.

Continuare la procedura schiacciando l'epifisi. Mentre si è ancora nella seconda capsula di Petri, tenere saldamente la rotula con una pinza e schiacciare le ginocchia con la punta della siringa. Continuare fino a quando le epifisi non sono più rosse.

Utilizzando la siringa, trasferire le cellule dalla seconda e dalla terza capsula di Petri alla provetta da 50 millilitri. Rompi i grumi pipettando delicatamente su e giù e cerca di evitare la formazione di bolle. Centrifugare le cellule.

Quindi rimuovere il surnatante con la pipetta sierologica, rimuovere il pellet con un colpetto e lisare i globuli rossi incubandoli in un millilitro di cloruro di ammonio di potassio o tampone di lisi ACK, per un minuto a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 40 millilitri di tampone HBSS. Utilizzando una pipetta sierologica, filtrare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una nuova provetta conica da 50 millilitri e centrifugare le cellule.

Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il surnatante e coltivare le cellule del midollo osseo in un terreno completo con 10 nanogrammi per millilitro di GM-CSF di topo ricombinante a una densità di una volta 10 per 6 cellule per millilitro. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule su piastre di coltura tissutale e incubarle a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, fino al momento di procedere con la colorazione. Delicatamente, ma accuratamente, pipettare le cellule su e giù per rimuovere le cellule poco aderenti.

Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare le cellule. Versare delicatamente il surnatante e lavare le cellule pellettate aggiungendo 30 millilitri di tampone di lavaggio FACS, o SFWB, con la pipetta sierologica. Quindi centrifugare le celle e ripetere il lavaggio.

Quindi, sospendere e colorare le cellule secondo le istruzioni del produttore dell'anticorpo. Risospendere cinque volte 10 alla settima cellula in un millilitro di FWB e aggiungere due microgrammi ciascuno di anti Ly-6C e anti CD115, marcati con fluorofori. Per distinguere ulteriormente la CMP dalla MODC, aggiungere due microgrammi di anticorpi anti CD11C.

Incubare i campioni per 30 minuti con ghiaccio. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere 10 millilitri di FWB e centrifugare le cellule. Versare delicatamente il surnatante e lavare le cellule pellettate aggiungendo 30 millilitri di FWB con una pipetta sierologica.

Centrifugare le celle e ripetere il lavaggio. Prima di sospendere le celle, muovere accuratamente il tubo per rimuovere il pellet. Utilizzare una pipetta sierologica per risospendere le cellule in una volta da 10 a 7 cellule per millilitro di FWB e filtrarle attraverso un filtro cellulare da 35 micrometri.

Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire le cellule filtrate in una provetta di polipropilene e posizionare la provetta sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per essere selezionate. Eseguire il controllo non colorato attraverso il selezionatore di celle e applicare un cancello per escludere piccoli detriti e particelle altamente granulari. Far passare i singoli campioni di controllo fluorescenti attraverso il selezionatore di cellule e regolare la compensazione secondo necessità.

Eseguire un campione del campione multi-etichettato e osservare quattro popolazioni distinte. Applica un cancello per isolare ciascuna delle quattro popolazioni principali. Preparare le provette di raccolta aggiungendo una quantità sufficiente di siero fetale di vitello, o FCS, per raggiungere almeno il 20% di concentrazione finale quando sono piene.

Ad esempio, se si utilizzano provette da cinque millilitri, aggiungere un millilitro di FCS prima di smistare e rimuovere la provetta quando raggiunge il volume totale di cinque millilitri. Per prevenire il turnover della membrana e l'assorbimento degli anticorpi, mantenere tutti i campioni a quattro gradi Celsius durante la cernita. Dopo aver raccolto il numero desiderato di cellule, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire le cellule in una nuova provetta conica e centrifugare le cellule.

Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di FWB, quindi centrifugare nuovamente le cellule. Ripetere la sospensione FWB per un totale di due lavaggi. Infine, rimuovere il surnatante dopo il secondo lavaggio e procedere in base al design dell'esperimento.

Per mantenere il maggior numero possibile di canali disponibili per l'analisi, sono state selezionate di routine le cellule vitali, in base alla diffusione diretta e laterale, escludendo eventi molto piccoli e molto granulari. Per determinare se questa strategia di gating escludeva in modo affidabile le cellule morte, i campioni sono stati colorati con 7-aminoactinomicina D. Le cellule analizzate immediatamente dopo il prelievo avevano circa il 10% di cellule positive per 7-AAD, quando un tipico FSC, SSC gate è stato applicato alle cellule appena isolate dal midollo osseo. Una proporzione simile di cellule morte era presente anche al soggiorno 1 e al soggiorno 3 della coltura.

Entro il quinto giorno, il numero di cellule morte all'interno del cancello è stato ridotto al 5%, quindi, l'utilizzo di tale cancello di vitalità è generalmente appropriato per lo smistamento il quinto giorno e dopo. La citometria a flusso ha rivelato che all'interno della popolazione Ly6C negativa, CD115, le cellule CD3 e CD45R positive persistevano fortemente dal giorno zero al terzo. Il quarto giorno, rimanevano solo poche cellule CD3, CD45R positive, e al quinto e sesto giorno non erano presenti cellule CD3 e CD45R; quindi, entro quattro giorni dalla coltura in GM-CSF, le cellule positive al lignaggio erano sostanzialmente assenti e non sono state rilevate affatto al quinto e al sesto giorno di coltura.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la composizione cellulare dipende dalla durata della coltura. La cernita tre giorni dopo la raccolta produce un numero elevato di fasi precoci e poche fasi tardive, e viceversa per le colture selezionate dopo cinque giorni.