HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

- HCR-FISH, o ibridazione in situ con reazione a catena di ibridazione-fluorescenza, rileva le sequenze di acido nucleico virale all'interno del genoma delle cellule infettate da virus. Per iniziare, fissa una coltura aderente di cellule infettate da virus e permea la loro membrana cellulare. Incubare le cellule con un tampone di ibridazione per ridurre qualsiasi segnale di fondo. Trattare le cellule con sonde iniziatrici che trasportano una sequenza iniziatrice HCR e una sequenza complementare che ha come bersaglio il DNA virale. Riscaldare il campione per denaturare il DNA a doppio filamento dell'ospite in DNA a filamento singolo. Incubare il campione per consentire alla sonda di legarsi alla sua sequenza di DNA virale bersaglio complementare.

Successivamente, trattare con un tampone di amplificazione contenente due serie di sonde a forcina oligonucleotidica marcate con fluorescenza, H1 e H2. Incubare per facilitare la reazione a catena di ibridazione. La sequenza iniziatrice spaiata si lega alla sua coda complementare H1, linearizzando la struttura a forcina. La sequenza H1 esposta si lega in modo simile alla sua coda H2 complementare. L'H2 finale continua a legarsi a una coda H