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0 visualizzazioni • 6:00 min. • April 30th, 2023
- HCR-FISH, o ibridazione in situ con reazione a catena di ibridazione-fluorescenza, rileva le sequenze di acido nucleico virale all'interno del genoma delle cellule infettate da virus. Per iniziare, fissa una coltura aderente di cellule infettate da virus e permea la loro membrana cellulare. Incubare le cellule con un tampone di ibridazione per ridurre qualsiasi segnale di fondo. Trattare le cellule con sonde iniziatrici che trasportano una sequenza iniziatrice HCR e una sequenza complementare che ha come bersaglio il DNA virale. Riscaldare il campione per denaturare il DNA a doppio filamento dell'ospite in DNA a filamento singolo. Incubare il campione per consentire alla sonda di legarsi alla sua sequenza di DNA virale bersaglio complementare.
Successivamente, trattare con un tampone di amplificazione contenente due serie di sonde a forcina oligonucleotidica marcate con fluorescenza, H1 e H2. Incubare per facilitare la reazione a catena di ibridazione. La sequenza iniziatrice spaiata si lega alla sua coda complementare H1, linearizzando la struttura a forcina. La sequenza H1 esposta si lega in modo simile alla sua coda H2 complementare. L'H2 finale continua a legarsi a una coda H1. In questo modo, le sonde con tag fluorescenti si amplificano intorno al sito bersaglio, emettendo un segnale forte. Trattare il campione con DAPI per colorare i nuclei cellulari.
Utilizzare un microscopio a fluorescenza per rilevare la fluorescenza luminosa dai focolai di replicazione all'interno dei nuclei delle cellule infette. Nel seguente protocollo, mostreremo in situ HCR-DNA FISH per rilevare il genoma del poliomavirus a cellule di Merkel in cellule primarie della pelle umana infettate.
- Per prima cosa, fissare le celle sui vetrini coprioggetti con il 4% di PFA in PBS per 10 minuti. Quindi, lavare due volte i vetrini di copertura con PBS e trattarli con etanolo al 70% a 4 gradi Celsius durante la notte per permeare le cellule. Il giorno successivo, sostituire l'etanolo con il tampone di idratazione della sonda e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti per pre-ibridare i campioni. 30 minuti prima della fine dell'incubazione pre-ibridazione, diluire le sonde in soluzione di ibridazione con sonda a una diluizione di 1:500 e incubare a 45 gradi Celsius.
Al termine delle incubazioni, pipettare circa 10 microlitri della miscela di sonde diluite su un vetrino da microscopio per ogni vetrino coprioggetti. Posizionare ciascun vetrino coprioggetti, con la cella rivolta verso il basso, sulla rispettiva gocciolina di miscela di ibridazione. Utilizzando una quantità generosa di cemento di gomma, sigillare i bordi e il retro di ciascun vetrino coprioggetto al relativo carrello. Posiziona i vetrini sul lato piatto di un blocco termico e riscaldali a 94 gradi Celsius per 3 minuti. Successivamente, trasferire i vetrini in una camera umidificata e incubarli a 45 gradi Celsius per una notte.
Il giorno successivo, usa una pinza per staccare con cura il cemento di gomma. Posizionare i vetrini coprioggetti, con la cella rivolta verso l'alto, nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e lavarli con il tampone di lavaggio della sonda tre volte a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto contenente un vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Nel frattempo, ricuocere ciascuna delle due forcine di oligonucleotidi marcate riconoscendo le sonde in provette PCR separate, riscaldandole a 95 gradi Celsius per 90 secondi e poi raffreddandole a temperatura ambiente per 30 minuti. Mescolare le forcine nel tampone di amplificazione a una diluizione di 1:50.
Quindi, stendere la pellicola di paraffina sulla faccia aperta di un coperchio della piastra a 12 pozzetti per creare una superficie per la reazione di amplificazione. Pipettare da 50 a 100 microlitri di goccioline della miscela di forcine sulla pellicola di paraffina per ogni vetrino coprioggetti. Utilizzando una pinza, rimuovere con cura ogni vetrino coprioggetto dalla soluzione di preamplificazione e toccare il bordo di una salvietta porosa monouso per asciugare. Posizionare ogni vetrino coprioggetti essiccato, con la cella rivolta verso il basso, su una gocciolina di amplificazione. Trasferire il coperchio della piastra in una camera umidificata e incubare per una notte a temperatura ambiente e al buio.
Il giorno successivo, rimettere i vetrini di copertura nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 5 DAPI contenenti SSCT a una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare i campioni due volte con 5x SSCT a temperatura ambiente. Montare i vetrini coprioggetto lavati sui vetrini del microscopio e utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita per analizzare le cellule e visualizzare i campioni.