Name: 3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare larchitettura nucleare nelle cellule primarie umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Scopri la tecnica 3D multicolor DNA FISH per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane. Questo metodo consente la visualizzazione di loci genomici multipli a livello di singola cellula.

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Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica dello strumento di imaging INGM (Istituto Nazionale di Genetica", "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), in particolare C. Cordiglieri, per assistenza nell'arte 3D multicolore DNA FISH Acquisizione. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a B.B.: programma di punta italiano EPIGEN, Associazione Francese contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e GiovaniI, Ministero della Sanità Italiano (GR-2011-02349383). Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. Procedure di preparazione ed etichettatura della sonda del DNA con traduzione nick
<ol><li>Purificare e pulire i cromosomi artificiali batterici (BAC), plasmidi o prodotti PCR con kit specifici (Tabella dei materiali), risospendere in ddH2O, controllare per elettroforesi su un gel di agarose e quantificare.</li>
	<li>Eseguire la traslazione del nick su 1,5,5 g di DNA dal punto 1,1 in un volume finale di 50 gradi, mescolando tutti i reagenti in un tubo DNA a bassa legatura di 0,5 mL secondo la tabella 1. NOTA: le sonde etichettate direttamente possono migliorare il rapporto segnale/rumore. Sono disponibili in commercio in commercio kit per la produzione indiretta e diretta di sonde con vari fluorocrodi Alexa.</li>
	<li>Incubare la miscela di traduzione nick in un mixer termico a 16 gradi centigradi per un certo tempo a seconda della lunghezza del materiale DNA iniziale: 45 min per i prodotti PCR (un pool di prodotti PCR di 2.000 bp ciascuno) e fino a 4 h per IL DNA BAC e i plasmidi.</li>
	<li>Controllare le dimensioni delle sonde prodotte al passaggio 1.3 mediante elettroforesi su un gel di agarose del 2,2%. NOTA: la dimensione ottimale del probe è <200 bp (Figura 1A).<ol>
<li>Se il DNA non viene digerito abbastanza, aggiungere 5 U di DNA polymerase I e 0.05 U di DNase I alla reazione e incubare per 1/2 h a 16 gradi centigradi e successivamente ricontrollare. Interrompere la reazione con 0,5 m EDTA (concentrazione finale). Conservare le sonde a -20 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per ogni esperimento DNA FISH, far precipitare le seguenti quantità di sonde a seconda del materiale DNA iniziale da cui vengono prodotte le sonde: 200 ng da prodotti PCR tradotti in nick, 100 ng da NICK tradotti AC o 300 ng da plasmide tradotte nick. Aggiungere ddH2O fino a 150 gradi l, 20 g di DNA di spermatozoi di salmone non etichettato, 3,5 g di DNA Cot-1 specifico per specie, 3 volumi di 100% EtOH e un volume di 3 M di acetato di sodio pH 5.2. Precipitare a -80 gradi centigradi per 1 ora.</li>
	<li>Centrifuga alla massima velocità per 1 h a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Lavare il pellet due volte con il 70% EtOH.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 o L di 100% formamide pH 7,0, agitare a 40 gradi centigradi per 30 min (può richiedere fino a poche ore) e quindi aggiungere un volume uguale di 4x di citrato salina-sodio (SSC)/20% dextransofato.<ol>
<li>Preparare 20 volte SSC mescolando 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in un volume finale di 1 L di H2aliquota, filtrare e preparare. NOTA: Per DNA FISH multicolore, le diverse sonde possono essere precipitate insieme ad eccezione delle sonde che possono anneal tra loro. In questi casi specifici, trattarli separatamente, precipitare e risospendere le sonde che dividono i reagenti menzionati nei passaggi 1.5-1.7 rispetto al numero di sonde. Raggruppare le sonde solo dopo la sospensione in formamide. Se si utilizzano copricapi di vetro con dimensioni maggiori di 10 mm o inferiori a 10 mm, scalare il volume verso l'alto o verso il basso dei reagenti utilizzati nei passaggi 1,5,1,7 in modo proporzionale alla dimensione della diapositiva. Le sonde di ibridazione possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un lungo periodo di tempo (fino a due mesi).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione
NOTA: I passaggi di permeabilizzazione e deproteinizzazione sono passi cruciali. Il tempo di reazione e concentrazione dei reagenti dipende fortemente dal tipo di cellula, dall'abbondanza di citoplasma e dalla morfologia nucleare.
<ol><li>Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i linfociti T primari dell'uomo NOTA: Questo protocollo è adatto per piccole cellule, con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma.<ol>
<li>Utilizzare coprivele in vetro (10 mm, spessore no. 1,5H).</li>
		<li>Lavare il bicchiere con ddH2O, quindi con il 70% EtOH e lasciarli asciugare. Utilizzare un bicchiere per ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 200 L di 0,1% poli-L-lisina (w/v) (Tabella dei materiali) direttamente sul vetro per formare una goccia. Prestare attenzione come la goccia deve rimanere sulla superficie del vetro senza toccare il pozzo per 2/5 min. Lasciare fuori la goccia con attenzione, e lasciare asciugare il vetro per 30 min.</li>
		<li>Eseguire il passaggio 2.1.3 altre due volte.</li>
		<li>Mettere 200 - L di celle di sospensione (2 x 106/ mL, sospensione PBS dei linfociti A T primari osisti ex vivo) direttamente sul vetro, consentire alle cellule di seme a temperatura ambiente (RT) per 30 min.</li>
		<li>Rimuovere rapidamente la goccia. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto (preparato in PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrato) per 10 min e fissare le celle di semi a RT.</li>
		<li>Lavare tre volte per 5 min ciascuno con 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) a RT. Permeabilize con 0.5% TPBS per 10 min a RT.</li>
		<li>Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare durante la notte (ON) a 4 gradi centigradi. NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni.</li>
		<li>Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere il passaggio 2.1.9 altre tre volte.</li>
		<li>Lavare in 0,5% TPBS per 5 min a RT. Lavaggio in 0,05% TPBS, due volte per 5 min a RT. Incubate in 0,1 N HCl per 12 min a RT. Rinse in 2x SSC.</li>
		<li>Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT. NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i mioblasti primari umani NOTA: Questo protocollo è adatto per le cellule di grandi dimensioni, con un'elevata quantità di citoplasma.<ol>
<li>Coltivare mioblasti primari umani direttamente sui bicchieri coverslip in piastre 24 pozzetti nel mezzo di crescita (Mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 20% siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL fattore di crescita fibroblasta (FGF), 10 ng/mLdermica fattore di crescita epidermica (EGF), 10 g/mL di insulina umana, 1x glutammina, 1x penicillina/streptomicina) per almeno 24 h (raggiungendo il 50-70% della confluenza). NOTA: Per facilitare l'adesione, la gelatina o il collagene o la poli-lisina può essere utilizzata per rivestire il coperchio prima della semazione.</li>
		<li>Risciacquare le cellule in 2-3 cambi di PBS. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto e fissare le celle per 10 min a RT.</li>
		<li>Lavare tre volte per 3 min ciascuno nello 0,01% TPBS a RT. Permeabilize in 0.5% TPBS per 10 min a RT.</li>
		<li>Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare ON a RT. NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni.</li>
		<li>Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere questo passaggio tre volte.</li>
		<li>Lavare tre volte per 10 min ciascuno in PBS. Incubare in 0.1 N HCl per 5 min a RT. Risciacquare in 2x SSC.</li>
		<li>Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT. NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni.</li>
		<li>Vetrine Equilibrate (conservate al 50% formamide/2x SSC) in 2x SSC per 2 min. Quindi, equilibrate in PBS per 3 min.</li>
		<li>Trattare con 0.01 N HCl/ 0.0025% pepsina da pochi secondi fino a 5 min, a seconda del tipo di cella. Durante questa fase, osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione (passaggio 2.2.11) non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma, mantenendo intatta la loro struttura (ad esempio, i nucleoli sono ancora visibili e intatti).</li>
		<li>Inattivare la pepsina lavando due volte per 5 min ciascuno in 50 mM MgCl2/PBS.</li>
		<li>Post-fix in 1% PFA/PBS per 1 min. Lavaggio per 5 min in PBS. Lavare due volte per 5 min ciascuno in 2x SSC, quindi aggiungere 50% formamide/2x SSC per almeno 30 min.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ibridazione DNA FISH multicolore 3D
<ol><li>Denaturare le sonde a 80 gradi centigradi per 5 min, quindi mettere rapidamente sul ghiaccio.</li>
	<li>Caricare le sonde di ibridazione su un vetrino al microscopio pulito. Ruotare il coperchio con le celle a testa in giù sulla goccia di sonde di ibridazione.</li>
	<li>Sigillare il coperchio con cemento di gomma. Lasciare asciugare completamente il cemento di gomma. Quindi posizionare i vetrini su un blocco di riscaldamento e denaturare a 75 gradi centigradi per 4 min. NOTA: I tempi di denaturazione e la temperatura di denaturazione possono essere aumentati, fino a 80 gradi centigradi.</li>
	<li>Ibridare a 37 gradi centigradi in una scatola metallica galleggiante in un bagno d'acqua. NOTA: Per migliorare il rapporto segnale/rumore, la temperatura di ibridazione può salire fino a 42 gradi centigradi.</li>
	<li>Sbucciare il cemento di gomma, immergere i vetrini in 2x SCC, togliere la coverslip di vetro e trasferirlo a 2x SSC in 6 pozzetti.</li>
	<li>Lavare in 2x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri al rinfuso in uno shaker incubatore. Lavare in 0,1 x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 60 gradi centigradi, agitando a 90 giri in uno shaker incubatore. Risciacquare brevemente in 4x SSC/0.2% TWEEN 20.</li>
</ol>4. Rilevamento DNA FISH multicolore 3D
NOTA: per le sonde etichettate direttamente, saltare i passaggi 4.1 e 4.2.
<ol><li>Blocco in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% di albumina di siero bovino (BSA) per 20 min a 37 gradi centigradi in un piatto di 24 pozzetti, tremando a 20 giri in uno shaker incubatore.</li>
	<li>Incubare con l'adeguata concentrazione di anti-digoxygenina (1:150) e/o streptavidin (1:1.000) (Tabella dei materiali) diluiti in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA per 35 min in una camera buia e umida a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare in 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri in una piastra 6-well in uno shaker di incubatrice.</li>
	<li>Equilibrio in PBS e post-fisso in 2% formaldeide/PBS per 2 min a RT in una piastra di 24 pozze. NOTA: le sonde etichettate direttamente non necessitano di post-fissazione.</li>
	<li>Lavare brevemente 5 volte in PBS. Macchie con 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS per 5 min a RT.</li>
	<li>Lavare brevemente 5 volte in PBS. Monta con soluzione anti-dissolvenza (Tabella dei materiali).</li>
</ol>5. Microscopia e analisi 3D multicolore DNA FISH
<ol><li>Acquisire immagini 3D con un sistema al microscopio. NOTA: In questo caso, viene utilizzato un microscopio a più ampio campo con una distanza assiale di 0,2 m 0,25 m tra sezioni consecutive (Figura 1B).</li>
	<li>Analizza gli stack di immagini 3D utilizzando diversi software e strumenti (qui, NuCL- d o Nuclear Contacts Locator in 3D). NOTA: L'utensile NuCL- D è stato sviluppato al fine di analizzare automaticamente 3D multicolore DNA FISH in immagine cella di fluorescenza immagine z-stack. NuCL- ricostruisce i nuclei dagli stack di immagini delle cellule in 3D, nonché rileva e localizza i punti 3D fluorescenti. Misura il posizionamento relativo dei punti nel nucleo (ad esempio, la distanza dal centroide dei nuclei e/o della periferia dei nuclei) e il raggio massimo per ogni nucleo e le distanze tra macchie. Lo strumento e l'algoritmo utilizzato sono descritti completamente in Cortesi et al.16.</li>
	<li>Analizzare i dati (ad es. distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare e le frequenze di contatto) recuperati da NuCL. NOTA: per le distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare, normalizzare le distanze sul raggio massimo per ogni nucleo e rappresentare questi dati come distribuzioni di frequenza delle distanze normalizzate dal centroide nucleare. Per gli studi sulle interazioni a lungo raggio, le frequenze di contatto dovrebbero essere nell'intervallo del 10-20%21 con una soglia inter-distanza che può variare e può essere messa intorno a 2 m35.<ol>
<li>Per eseguire analisi statistiche, analizzare circa 100 nuclei per replica biologica. Rappresentano le distanze 3D tra i loci genomici specificati come distribuzioni cumulative di frequenza delle distanze che si trovano al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e utilizzano un test tper valutare l'importanza delle differenze nelle distribuzioni. Inoltre, calcola la percentuale di nuclei positivi per le interazioni che sono al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e usa il test esatto di Fisher per valutare il significato delle differenze nelle percentuali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li>
<li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li>
<li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging%2C+contact+maps%2C+and+integrative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872(2018).</li>
<li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo attuale descrive un protocollo passo dopo passo per eseguire DNA FISH multicolore 3D su una vasta gamma di cellule primarie umane. Anche se DNA FISH è una tecnologia di ampio uso, 3D multicolore DNA FISH su nuclei interfase 3D conservati è ancora difficile da eseguire in molti laboratori, principalmente a causa delle caratteristiche dei campioni utilizzati23,24.
La traduzione di nick probe è un passo fondamentale per il succe...

Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un'enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo1,2,3,4. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati5 e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina6,7. Il loop dinamico 3D della cromatina può influenzare molti processi biologici diversi come la trascrizione8,9, la differenziazione e lo sviluppo10,11, riparazione del DNA12,13, mentre le sue perturbazioni sono coinvolte in varie malattie14,15,16 e difetti dello sviluppo15,17,18.
Molti approcci sono stati sviluppati per studiare l'organizzazione del genoma 3D. Tecnologie basate sulla conformazione cromosomica (tecnologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivati) sono state sviluppate per studiare l'organizzazione del genoma nelle cellule fisse3,4,19,20. Tali approcci si basano sulla capacità di catturare le frequenze di contatto tra loci genomici in prossimità fisica. Le tecnologie C, a seconda della loro complessità, catturano l'organizzazione globale del genoma 3D e la topologia nucleare di una popolazione cellulare3,4,19,20. Tuttavia, le interazioni 3D sono dinamiche nel tempo e nello spazio, altamente variabili tra singole cellule costituite da interazioni multiplex, e sono ampiamente eterogenee21,22.
La fluorescenza 3D multicolore del DNA nell'ibridazione situ (FISH) è una tecnica che consente la visualizzazione di loci genomici specifici a livello di singola cellula, consentendo lo studio diretto dell'architettura nucleare 3D in modo complementare alle tecnologie C. Rappresenta una tecnologia attualmente utilizzata per convalidare in modo inequivocabile i risultati C. IL DNA FISH multicolore 3D utilizza sonde etichettate fluorescentmente complementari ai loci genomici di interessi. L'uso di diversi fluorofori e attrezzature di microscopia idonee consentono la visualizzazione contemporanea di più obiettivi all'interno dello spazio nucleare23,24. Negli ultimi anni, FISH è stato combinato con i progressi tecnologici nella microscopia per ottenere la visualizzazione di strutture su scala fine ad alta risoluzione25,26 o con approcci CRISPR-Cas per la visualizzazione degli acidi nucleici nell'imaging dal vivo27,28. Nonostante l'ampia adozione, l'approccio 3D multicolore DNA FISH è ancora considerato difficile in molti laboratori perché il materiale biologico utilizzato deve essere adattato.
Qui, forniamo un protocollo completo per il DNA FISH multicolore 3D (dalla preparazione di cellule/sonde all'analisi dei dati) applicabile a un'ampia gamma di cellule primarie umane, consentendo la visualizzazione di più loci genomici e preservando la struttura 3D dei nuclei. Per studiare l'architettura nucleare, la struttura 3D dei nuclei deve essere preservata. Per questo motivo, a differenza di altri protocolli esistenti29,30,31, evitiamo l'uso di un gradiente di alcol e lo stoccaggio dei copricapi nell'alcool che possono influenzare la struttura della cromatina32. Il metodo è adattato dai protocolli 3D DNA FISH conservati24,33 da applicare a una vasta gamma di cellule primarie umane, sia isolate ex vivo che coltivate in vitro. Ci sono parametri di permeabilizzazione e deproteinizzazione per diverse morfologia nucleare e caratteristiche citologiche (ad esempio, diversi gradi di compattazione nucleare, abbondanza di citoscheletri)34. Questi parametri sono spesso generalmente descritti in altri protocolli24,33, senza fornire una chiara discriminazione della procedura all'interno di diversi tipi di cellule. Inoltre, abbiamo sviluppato uno strumento specifico chiamato NuCLsD (localizzatore di contatti nucleari in 3D)16, fornendo principi per l'analisi dei dati che miglioreranno la vicinanza 3D tra diversi loci e la loro distribuzione topologica nucleare all'interno dello spazio nucleare in modo automatizzato.

<table><tbody><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digossigenina 488</td><td>DBA</td><td>DI7488</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biotina 11 d-UTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0081</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina sierica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Coverlsips</td><td>Marienfeld</td><td>117500</td><td></td></tr><tr><td>CY3 d-UTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4,6-diamidino-2-fenilidolo)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Acidi desossiribonucleici a singolo filamento da testicoli di salmone</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato (polvere)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203917A</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina 11 d-UTP</td><td>Roche</td><td>11093088910</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21969-035 500mL</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18010-017</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (C-G-A-T)</td><td>Euroclone</td><td>BL0423A/C/G</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hyclone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30109</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F8775-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024 100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279-001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Human</td><td>Sigma</td><td>I9278-5 mL</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>NaAc (Acetato di sodio, pH 5,2, 3 M)</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillina/Streptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070-063 100mL</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Biorad</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>PhasePrep BAC Kit DNA</td><td>Sigma</td><td>NA0100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Estrazione rapida del gel & Kit combinato di purificazione PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K220001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific K210010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cocktail RNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2288</td><td></td></tr><tr><td>Rubbercement</td><td>Bostik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>631-0114</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di trisodio</td><td>Sigma</td><td>1110379026</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

3d multicolor dna fish tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

Una delle principali domande nella biologia cellulare è l'organizzazione genomica all'interno dello spazio nucleare e come l'architettura della cromatina possa influenzare processi come l'espressione genica, l'identità cellulare e la differenziazione. Molti approcci sviluppati per studiare l'architettura 3D del genoma possono essere suddivisi in due categorie complementari: tecnologie basate sulla cattura della conformazione cromosomica (tecnologie C) e imaging. Mentre il primo si basa sulla cattura della conformazione cromosomica e delle interazioni del DNA prossimale in una popolazione di cellule fisse, la seconda, basata sulla fluorescenza del DNA nell'ibridazione situ (FISH) su nuclei conservati in 3D, consente la visualizzazione contemporanea più loci a livello di singola cellula (multicolore), esaminando le loro interazioni e la distribuzione all'interno del nucleo (3D DNA multicolore FISH). La tecnica del DNA FISH multicolore 3D ha una limitazione di visualizzare solo pochi loci predeterminati, non permettendo un'analisi completa dell'architettura nucleare. Tuttavia, data la robustezza dei suoi risultati, 3D DNA FISH multicolore in combinazione con 3D-microscopia e ricostruzione dell'immagine è un possibile metodo per convalidare i risultati basati sulla tecnologia C e per studiare in modo inequivocabile la posizione e l'organizzazione di loci specifici a livello di singola cellula. Qui, proponiamo un metodo passo dopo passo di 3D multicolore DNA FISH adatto per una vasta gamma di cellule primarie umane e discutere tutte le azioni pratiche, passaggi cruciali, nozioni di imaging 3D e analisi dei dati necessari per ottenere un multicolore 3D di successo e informativo DNA FISH all'interno di diversi contesti biologici.

Il metodo del DNA FISH multicolore 3D descritto in questo articolo consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati (Figura 1B). Questo protocollo consente la misurazione delle distanze tra gli alleli e dei diversi loci genomici per valutarne la vicinanza spaziale e per valutarne la posizione all'interno dello spazio nucleare (ad esempio, la distanza loci dal centroide o dalla periferia dei nuclei)16</s...

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione di più loci genomici all'interno di nuclei conservati per definire in modo ambiguo la loro interazione reciproca e localizzazione a livello di singola cellula. 3D multicolor DNA FISH consente lo studio diretto dell'architettura nucleare. In generale, funziona in combinazione con tecnologie basate sulla cattura cromosoma rendendo la tecnica uno strumento disponibile per la convalida dei dati C all'interno di singole cellule.A dimostrare la procedura sarà Federica Marasca. È un postdoc nel mio laboratorio. Inizia incubando il mix di traduzione nick in un miscelatore termico a 16 gradi Celsius in base alla lunghezza del materiale del DNA iniziale.Al termine dell'incubazione, controllare le dimensioni delle sonde su un gel di agarosio al 2,2%. Per ogni esperimento DNA FISH, precipitare la quantità appropriata di sonda in base al materiale del DNA di partenza da cui sono state prodotte le sonde in 150 microlitri di acqua distillata doppia, 20 microgrammi di DNA di sperma di salmone non etichettato, 3,5 microgrammi di DNA Cot-1 specifico per specie, tre volumi di etanolo al 100% e un 1/10° volume di tre acetati di sodio molare per un'ora a meno 80 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, centrifugare il campione alla massima velocità per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il supernatante, lavare il pellet due volte con 500 microlitri di 70%etanolo. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare il pellet in due microlitri di formamide al 100% e agitare la sonda per 30 minuti a 40 gradi Celsius prima di aggiungere un volume uguale di citrato di sodio salino 4X nel solfato di dextran al 20%. Per il pretrattamento di fissazione e la permeabilizzazione di piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, aggiungere prima due volte 10 alla sesta cellula in 200 microlitri di PBS direttamente su coverlips di vetro in singoli pozzi di una piastra da 24 porri e lasciare che le cellule si sistemino per 30 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, sostituire rapidamente il PBS con 300 microlitri di paraformaldeide appena preparata integrata con 0,1% Tween 20. Dopo 10 minuti, lavare le celle fisse tre volte in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule T con 300 microlitri dello 0,5%TPBS per 10 minuti a temperatura ambiente prima di trattare le cellule con 250 microlitri per pozzo di cocktail RNAse diluito 1:100 in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule in 300 microlitri di PBS e aggiungere 300 microlitri di glicerolo al 20% in PBS a ciascun pozzo con un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, posizionare il bicchiere sul ghiaccio secco per 15-30 secondi per congelare le cellule prima di scongelare gradualmente i campioni a temperatura ambiente e immergerli in 300 microlitri di 20%glicerolo in PBS per 30 secondi. Dopo aver congelato/scongelato le cellule altre tre volte come appena dimostrato, lavare i campioni in 300 microlitri dello 0,5%TPBS per cinque minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente.Dopo l'ultimo lavaggio, trattare le cellule con 300 microlitri di acido cloridrico normale 0,1 per 12 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due risciacqui in 300 microlitri di citrato di sodio salino. Quindi fissare i campioni durante la notte in 300 microlitri di 50% formamide in citrato di sodio salino 2X a temperatura ambiente. Per la fissazione, il pretrattamento e la permeabilizzazione di grandi cellule con un'elevata quantità di citoplasma, fissare, pretrattare e permeabilizzare le cellule in modo simile a quanto dimostrato per le cellule T primarie umane e trattare i campioni con 300 microlitri dello 0,0025%pepsina in 0,01 normale acido cloridrico per alcuni secondi fino a cinque minuti.Osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione con due lavaggi di cinque minuti in 300 microlitri di cloruro di magnesio millimolare non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma ma i nucleoli sono ancora visibili e intatti. Per il DNA FISH multicolore 3D, denaturare le sonde di ibridazione a 80 gradi Celsius per cinque minuti e posizionare immediatamente le sonde sul ghiaccio. Caricare le sonde su uno scivolo al microscopio pulito e posizionare un coverslip di celle su ogni goccia di sonda.Sigillare i bordi delle coperture con cemento di gomma. Quando il cemento si è asciugato completamente, denaturare i campioni su un blocco riscaldante di 75 gradi Celsius. Dopo quattro minuti, idrizzare i campioni a 37 gradi Celsius durante la notte in una scatola metallica che galleggia in un bagno d'acqua.La mattina dopo, staccare il cemento di gomma e con gli scivoli immersi in citrato di sodio salino 2X sollevare con cura le copertine. Posizionare ogni coverlip in singoli pozzi di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di citrato di sodio salino fresco per pozzo per due lavaggi di cinque minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento a 90 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, sciacquare brevemente le copertine in due millilitri dello 0,2% Tween 20 in citrato di sodio salino 4X.Per il rilevamento 3D di DNA FISH multicolore, trasferire le coverlips in singoli pozzi di una nuova piastra da 24 porri e bloccare qualsiasi legame non specifico in 300 microlitri di tampone di blocco per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 20 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, trattare i campioni con l'appropriata concentrazione di anti-digoxigenina e/o streptavidina diluita in tampone di blocco per 35 minuti in una camera scura e umida a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni su singoli pozzi di una piastra a sei poggiagli e lavare i campioni tre volte in due millilitri dello 0,2% Tween 20 e 4X citrato di sodio salino per cinque minuti per lavaggio con scuotimento a 90 giri al minuto.Dopo l'ultimo lavaggio, equilibrare i campioni in due millilitri di PBS prima di trasferire le coverlips su una nuova piastra da 24 porri per il post-fissaggio in 300 microlitri di formaldeide al 2% in PBS per pozzo per due minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule fisse cinque volte brevemente in 300 microlitri di PBS, seguiti dalla colorazione con DAPI diluita a un nanogrammo per millilitro in 300 microlitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le coverlips altre cinque volte in PBS e montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato.Quindi acquisire immagini 3D con un sistema di microscopio. 3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno di nuclei 3D conservati. Per la preparazione della sonda DEL DNA, una dimensione della sonda inferiore a 200 coppie di basi garantisce una procedura DNA FISH multicolore 3D di successo.Le sonde SUBOPTIMAL DNA FISH prodotte dalla traduzione nick possono essere parzialmente o sovradigerite. Le sonde sovra digerite si tradurranno in un segnale non specifico a causa di una perdita di specificità nell'ibridazione e di un conseguente aumento dello sfondo. Per i linfociti T primari umani e le piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, si raccomanda un normale trattamento con acido cloridrico di 12 minuti 0,1 per promuovere l'accessibilità dei nuclei alle sonde del DNA e preservare l'integrità nucleare.La digestione della pepsina citoplasmatica non è necessaria per ottenere un segnale di DNA FISH nelle piccole cellule. Per i mioblasti e le cellule primarie umane che hanno grandi nuclei e abbondante citoplasma, tuttavia, la fase di pepsinizzazione è fondamentale. Una pepsinizzazione del citoscheletro breve e non ottimale ostacolerà l'ingresso della sonda nei nuclei terminando in assenza di un segnale FISH di DNA.Tuttavia, se le cellule sono sovranenizzate, i nuclei non rimarranno intatti perdendo la loro struttura 3D. Un DNA FISH multicolore 3D di successo si tradurrà nella presenza di segnale all'interno dei nuclei. Suggerisco di lavorare con materiale biologico fresco, testare sonde prima di eseguire il DNA FISH multicolore 3D, preparare soluzioni fresche ed essere precisi con i tempi di incubazione e le temperature.Ricorda che la formamide e l'HCL sono sostanze pericolose e devono sempre essere utilizzate in una cappa aspirante chimica con materiali monouso appropriati.

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Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

L'isolamento e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue dei pazienti oncologici è un tipo di biopsia liquida non invasiva ed è associata a recidiva e progressione della malattia. Questo video descrive la tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (DNA FISH) su CTC catturate su un filo medico, per studiare uno specifico gene di interesse.

3D DNA FISH: una tecnica per localizzare un gene specifico su un cromosoma

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l'esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Scopri la tecnica 3D multicolor DNA FISH per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane. Questo metodo consente la visualizzazione di loci genomici multipli a livello di singola cellula.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

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