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- La pelle è un organo complesso costituito da varie popolazioni cellulari disposte in più strati. CUBIC, una tecnica di imaging tridimensionale basata sulla pulizia dei tessuti, aiuta a visualizzare i modelli di espressione proteica all'interno di queste cellule cutanee utilizzando biopsie dell'intera pelle. Inizia prendendo un topo soppresso e rimuovendo i peli dalla regione dorsale del collo. Eliminate un pezzo di pelle e tagliatelo a pezzetti.
Immergere i pezzi in una soluzione di chiarificazione CUBIC1 e incubarli. Le cellule della pelle non sono trasparenti, a causa della presenza di cromofori e lipidi che causano la dispersione della luce. Le sostanze chimiche nella soluzione CUBIC rimuovono queste molecole, riducendo così la dispersione della luce e rendendo il tessuto trasparente.
Successivamente, trattare il tessuto con gli anticorpi primari desiderati che si legano specificamente alle proteine intracellulari bersaglio espresse nelle cellule della pelle. Inoltre, trattare con anticorpi secondari marcati in fluorescenza che si legano ai complessi proteina-anticorpo primario. Controcolorare il tessuto con un colorante legante il DNA che colora il nucleo.
Infine, immergere il campione in una soluzione CUBIC2. La soluzione riduce ulteriormente la dispersione della luce all'interno del tessuto, rendendolo più trasparente per l'imaging. Osservare al microscopio confocale per visualizzare le regioni di interesse marcate in fluorescenza nel campione tridimensionale. Il seguente protocollo consente la visualizzazione dell'espressione dei marcatori di proliferazione dei cheratinociti in biopsie cutanee a montatura intera utilizzando il protocollo CUBIC.
- Inizia usando i rifinitori per radere i peli dal collo di un topo soppresso, facendo attenzione a non ferire la pelle. Quindi, decontaminare la pelle con etanolo al 70% in PBS. Quindi, solleva la pelle del collo dorsale con una pinza e usa le forbici per rimuovere un'area di circa 1,5 x 4 centimetri di pelle dorsale del topo. Quindi, appiattire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, su un pezzo di carta da filtro, prendendo nota dell'orientamento antero-posteriore del campione e rifilare la carta attorno alla pelle sezionata.
- Per un imaging ottimale, i campioni di pelle devono rimanere piatti con un orientamento costante del follicolo pilifero. Per mantenere i campioni in una corretta posizione antero-posteriore, fissiamo i pezzi di pelle su carta da filtro in biopsie rettangolari.
- Trasferire i campioni in una provetta da 15 millilitri riempita con PFA al 4% in PBS appena preparato. Quindi, quando sono stati fissati saldamente alla carta da filtro, trasferire i campioni in un nuovo tubo da 15 millilitri di PBS per due lavaggi di 5 minuti.
Per eliminare le biopsie cutanee dopo il secondo lavaggio, utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare i tessuti in pezzi di circa 0,2 x 0,5 centimetri, facendo attenzione che i lati più lunghi dei campioni siano tagliati lungo la direzione antero-posteriore dei campioni.
- Tagliare il lato più lungo della biopsia parallelamente all'orientamento dei follicoli piliferi aiuta anche a evitare danni estesi al follicolo pilifero.
- Quindi, immergere le biopsie in 5 millilitri di soluzione di chiarificazione CUBIC1 appena preparata in una nuova provetta da 15 millilitri e posizionare la provetta su una piattaforma rotante in un forno di ibridazione a 37 gradi Celsius. Una volta che i pezzi di tessuto sono trasparenti, lavare le biopsie in 4 millilitri di PBS per quattro lavaggi di 6 ore a 37 gradi Celsius seguiti da un lavaggio di 4 ore a 37 gradi Celsius in saccarosio al 20% in peso per volume in PBS.
Al termine dell'incubazione, congelare ogni campione in un composto a temperatura di taglio ottimale in provette individuali da 15 millilitri durante la notte a meno 80 gradi Celsius per aumentare la permeabilità dei tessuti alla penetrazione degli anticorpi.
La mattina successiva, colorare i campioni di pelle con gli anticorpi appropriati e i coloranti vitali di interesse. Quindi, incubare i campioni in 1 millilitro di soluzione di chiarificazione CUBIC2 appena preparata in provette da 2 millilitri su uno shaker per 24 ore nel forno a 37 gradi Celsius per uniformare l'indice di rifrazione dei tessuti.
Quando i tessuti sono chiari, posizionare le biopsie lungo il lato più lungo dei singoli vetrini di copertura in modo che la direzione di crescita del follicolo pilifero sia parallela alla superficie del vetrino. Mettere una goccia di soluzione di CUBIC2 sul fazzoletto. Metti due strisce di 1 millimetro per 2 centimetri di puntina blu su un vetrino coprioggetti. Quindi, coprire la biopsia con un secondo vetrino coprioggetto.
Quindi, posizionare la camera di imaging su un tavolino per microscopio confocale e spostare il tessuto nel percorso della luce. Utilizzando la sorgente luminosa appropriata e i filtri standard per l'epifluorescenza, eseguire la scansione del campione per identificare le regioni di interesse colorate in fluorescenza. Quindi, acquisire immagini confocali fluorescenti delle regioni di interesse.
