Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la proliferazione cellulare e i modelli di espressione proteica a livello di singola cellula in tre dimensioni e di valutare accuratamente l'anatomia e la patologia della pelle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i meccanismi cellulari e molecolari controllano lo sviluppo e la rigenerazione epidermica e su come questi meccanismi sono perturbati durante la malattia della pelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un protocollo tecnicamente semplice per visualizzare singole cellule in biopsie cutanee a tutto spessore in tre dimensioni con una precisione senza precedenti.

Il metodo facilita anche l'indagine delle interazioni tra l'epidermide e il derma in campioni di pelle intera. In generale, i ricercatori nuovi a questo metodo potrebbero avere un po' di difficoltà nella preparazione delle piccole biopsie della pelle piatta senza danneggiare i follicoli piliferi. A dimostrare la procedura sarà Betty Maclarios, dottoranda presso l'Unità di Dermatologia Evolutiva e Rigenerativa dell'UNSW Australia.

Inizia usando i rifinitori per radere i peli dal collo di un topo soppresso, facendo attenzione a non ferire la pelle. Quindi decontaminare la pelle con etanolo al 70% e PBS. Quindi sollevare la pelle del collo dorsale con una pinza e usare le forbici per rimuovere un'area di circa 1,5 x 4 cm di pelle dorsale del topo.

Quindi appiattire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, su un pezzo di carta da filtro, prendendo nota dell'orientamento antero-posteriore del campione e tagliare la carta attorno alla pelle sezionata. Per un imaging ottimale, i campioni di pelle devono rimanere piatti con un orientamento costante del follicolo pilifero. Per mantenere i campioni nella corretta posizione antero-posteriore, fissiamo i pezzi di pelle sulla carta da filtro in biopsie rettangolari.

Trasferire i campioni in una provetta da 15 ml riempita con PFA e PBS al 4% appena preparati. Quindi, quando sono stati fissati saldamente alla carta da filtro, trasferire i campioni in una nuova provetta da 15 ml di PBS per due lavaggi di cinque minuti. Per pulire le biopsie cutanee, dopo il secondo lavaggio, utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare i tessuti in pezzi di circa 0,2 x 0,5 cm, facendo attenzione che i lati più lunghi dei campioni siano tagliati lungo la direzione anteriore posteriore dei campioni.

Il taglio lungo il lato della biopsia parallelamente all'orientamento dei follicoli piliferi aiuta anche a evitare danni estesi al follicolo pilifero. Immergono le biopsie in 5 mL di soluzione di chiarificazione cubica appena preparata in una nuova provetta da 15 mL e posizionano la provetta su una piattaforma rotante in un forno di ibridazione a 37 gradi Celsius. Una volta che i pezzi di tessuto sono trasparenti, lavare le biopsie in 4 ml di PBS per quattro lavaggi di sei ore a 37 gradi Celsius, seguiti da un lavaggio di quattro ore a 37 gradi Celsius in saccarosio al 20% in peso per volume e PBS.

Al termine dell'incubazione, congelare ogni campione in un composto a temperatura di taglio ottimale in singole provette da 15 mL per una notte a 80 gradi Celsius per aumentare la permeabilità dei tessuti alla penetrazione degli anticorpi. La mattina successiva colorare i campioni di pelle con gli anticorpi appropriati e i coloranti vitali di interesse. Quindi incubare i campioni in 1 mL di soluzione di chiarificazione cubica a due appena preparata in provette da 2 mL su uno shaker per 24 ore nel forno a 37 gradi Celsius per uniformare l'indice di rifrazione dei tessuti.

Quando i tessuti sono liberi, posizionare le biopsie lungo il lato più lungo dei singoli vetrini, in modo che la direzione della crescita del follicolo pilifero sia parallela alla superficie del vetrino. Mettere una goccia di soluzione cubica due sul fazzoletto. Posizionare due strisce di puntina blu da 1 ml per 2 cm su un vetrino coprioggetti, quindi coprire la biopsia con un secondo vetrino coprioggetti.

Quindi posizionare la camera di imaging su un tavolino per microscopio confocale e spostare il tessuto nel percorso della luce. Utilizzando la sorgente luminosa appropriata e i filtri standard per l'epifluorescenza, eseguire la scansione del campione per identificare le regioni di interesse colorate in fluorescenza, quindi acquisire immagini confocali fluorescenti delle regioni di interesse. Utilizzando questo metodo, le biopsie cutanee dorsali di topi adulti wild type possono essere chiarificate e colorate con anticorpi contro il marcatore basale dei cheratinociti cheratina 14.

I nuclei dappy positivi sono visibili in tutto il campione e consentono di apprezzare alcune delle caratteristiche anatomiche come le papille dermiche. La colorazione K14 è evidente nello strato basale spesso una cellula dell'epidermide interfollicolare. Delineando le ghiandole sebacee e le guaine radicolari esterne dei follicoli piliferi e nei germi piliferi secondari con solo bassi livelli di espressione di K14 rilevati nell'area del rigonfiamento dei follicoli piliferi.

Per visualizzare le cellule proliferanti, le biopsie cutanee dorsali a tutto spessore a telogen di topi adulti wild type possono essere chiarite e colorate, come dimostrato, rivelando la presenza di cheratinociti proliferanti nell'epidermide interfollicolare basale e nell'istmo, ma non nella regione di rigonfiamento dei follicoli piliferi. Per visualizzare le ghiandole sebacee, è possibile chiarire e colorare biopsie cutanee dorsali a tutto spessore all'antigene di topi adulti di tipo selvatico, facilitando il rilevamento delle ghiandole sebacee nella regione dell'istmo dei follicoli piliferi. Per visualizzare i cambiamenti morfologici nell'epidermide e negli animali transgenici, è possibile chiarire e colorare biopsie cutanee dorsali a tutto spessore, rivelando iperplasia dell'epidermide interfollicolare e follicoli piliferi anormali con masse cellulari marcate con K14 che si estendono prossimalmente nel derma che rappresentano le popolazioni di cellule staminali transgeniche ingrandite.

Dopo aver visto questo video dovremmo avere una buona comprensione di come preparare e chiarire campioni di pelle e di visualizzare i modelli di espressione proteica alla risoluzione di una singola cellula in tre dimensioni. Questo metodo è semplice da eseguire e utilizza reagenti relativamente sicuri ed economici. In futuro, verranno testati più anticorpi per verificarne la compatibilità con questo metodo, consentendo di estendere questa analisi per visualizzare più proteine e determinati tipi di interesse.

Altri metodi di imaging, come la microscopia a foglio luminoso, possono essere eseguiti per visualizzare l'anatomia della pelle e i modelli di espressione proteica di campioni di pelle più grandi in tre dimensioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della dermatologia per esplorare le interazioni cellulari e molecolari tra il derma e l'epidermide nell'omeostasi della pelle, in modelli murini geneticamente modificati e in uno dei nostri modelli di malattie della pelle.