Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Iniziare con cellule staminali pluripotenti indotte umane o sospensione di hiPSC in terreno. Aggiungere una coppia di nucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione o plasmidi codificanti TALEN. Integrare con un plasmide donatore portatore di un gene proteico fluorescente, accoppiato a un gene di resistenza agli antibiotici, con bracci di omologia adiacenti per un allineamento specifico ai loci bersaglio.

Elettroporare la miscela per generare pori transitori nelle membrane cellulari, consentendo l'internalizzazione del plasmide. Una volta all'interno delle cellule, i plasmidi codificanti TALEN vengono elaborati, producendo TALEN, proteine chimeriche composte da un dominio di legame al DNA TALE sito-specifico fuso con un dominio di scissione dell'endonucleasi di restrizione FokI non specifico.

Ogni monomero TALEN attraverso il suo dominio di legame al DNA - che comprende moduli di ripetizione di amminoacidi tandem - riconosce e si lega ai loci bersaglio, un modulo per nucleotide, su ciascun filamento di DNA in orientamenti opposti, separati da una sequenza spaziatrice. I domini FokI quindi dimerizzano e fendono il DNA all'interno della sequenza spaziatrice, creando rotture a doppio filamento con sporgenze.

In presenza di plasmidi donatori contenenti bracci di omologia complementari alle regioni che fiancheggiano il sito scisso, la riparazione diretta dall'omologia avviene utilizzando la sequenza omologa come modello per la sintesi della riparazione del DNA per colmare le rotture del doppio filamento. Dopo la legatura dei nick, la proteina fluorescente e i geni di resistenza agli antibiotici vengono integrati nel genoma ospite.

Trattare le hiPSC, seminate su uno strato di cellule di alimentazione per supportare la crescita, con terreni contenenti antibiotici. Il gene della resistenza agli antibiotici senza promotore, guidato da un promotore endogeno a monte, facilita la selezione delle cellule modificate con TALEN.