Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ingegnerizzare geneticamente le cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la moderna tecnologia di editing del genoma. Sebbene questa procedura possa fornire informazioni sulla biologia delle cellule staminali, può anche essere applicata per facilitare la modellazione della malattia umana in un ambiente geneticamente definito. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo dovranno esercitarsi nell'isolamento delle colonie prima di diventare esperti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale in quanto l'identificazione e la raccolta delle colonie possono essere difficili. Inizia coltivando cellule staminali pluripotenti umane in terreni hESC su una piastra a sei pozzetti contenente fibroblasti embrionali di topo inattivati con mitomicina C o cellule alimentatrici di MEF coltivate su gelatina. Ogni giorno successivo dopo la piastratura, fino a quando le hPSC non raggiungono il 50% di confluenza, utilizzare una pipetta di vetro e aspirare per rimuovere l'intero volume di terreno.

Sostituire con tre millilitri di terreno hESC caldo per pozzetto. Un giorno prima del targeting, rimuovere il terreno hESC e aggiungere un terreno hESC fresco e preriscaldato integrato con 10 micromolari di Y-27632. Inoltre, preparare una o due piastre a sei pozzetti di cellule alimentatrici MEF resistenti ai farmaci da topi DR4.

Il giorno del targeting, preparare le soluzioni di trasvezione pipettando cinque microgrammi di plasmide di espressione della nucleasi a dita di zinco 1 e 2, plasmide di espressione TALON 1 e 2 o 15 microgrammi del plasmide codificante CRISPR cas9 px330 in una provetta da cinque millilitri. Aggiungere 30 microgrammi di plasmide donatore riparato, seguiti da una quantità sufficiente di soluzione salina tamponata con fosfato per portare il volume a 300 microlitri. Ispezionare le cellule al microscopio per garantire una confluenza del 50%.

Quindi, utilizzare una pipetta di vetro e aspirare per rimuovere il terreno dalla piastra di hPFC, quindi lavare le cellule con 2 millilitri di 1x PBS caldo. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere cinque millimetri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% direttamente sulle cellule. Posizionare nell'incubatore per colture tissutali per circa 10 minuti, o fino a quando lo strato di alimentazione inizia a sollevarsi dalla piastra.

Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di terreno di lavaggio ES caldo a ciascun pozzetto per fermare la reazione della tripsina. Raccogli le cellule da ogni pozzetto, assicurandoti che le celle di alimentazione si stacchino come un foglio. Pipettare il contenuto di ciascun pozzetto in un'unica provetta conica da 50 millilitri, unendo tutti i pozzetti e triturare le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri.

Aggiungere il mezzo di lavaggio ES per portare la sospensione cellulare a 40 millilitri. Attendere uno o due minuti per consentire ai pezzi di alimentazione di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il surnatante, utilizzando una pipetta sierologica, e depositarlo in una provetta conica fresca da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per cinque minuti a 190 volte g, aspirare il surnatante senza disturbare la tavolozza cellulare.

Risospendere le cellule in 500 microlitri di 1x pbs. Combinare le cellule risospese con la soluzione di transezione al plasma preparata in precedenza. Pipettare le cellule e la miscela di trasfezione in una cuvetta per elettroporazione da quattro millimetri e metterle sul ghiaccio per tre-cinque minuti.

Impostare i parametri per il programma esponenziale sul sistema di elettroporazione a 250 volt, 500 microfarad, resistenza infinita e dimensioni della cuvetta di quattro millimetri. Elettroricaricare le cellule, quindi riposizionare la cuvetta sul ghiaccio per tre minuti. Risospendere le cellule elettroporate in 18 millilitri di terreno hESC caldo, integrato con 10 micromolari di Y-27632.

Ispezionare i MEF DR4 al microscopio. Piastra tre millilitri della sospensione a singola cellula in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente cellule feeder DR4 e rimettila nell'incubatore. Il terzo giorno dopo la placcatura, sostituire il terreno sulle celle hESC senza Y-27632.

Il quarto giorno, sostituire i terreni non integrati con terreni contenenti l'antibiotico di selezione appropriato. Qui viene utilizzata la puromicina. Il giorno prima della raccolta delle colonie, preparare una piastra a 12 pozzetti di cellule di alimentazione MEF per ogni colonia da prelevare.

Il 12° giorno dopo la piastratura, esaminare la lastra al microscopio da dissezione. Identificare le colonie da 800 a 1.200 micron di diametro pronte per essere raccolte. Assicurati che quelle colonie non contengano cellule che stanno iniziando a differenziarsi, come quella mostrata qui.

Inoltre, assicurati che le cellule esprimano GFP. Il giorno della raccolta, ispezionare i MEF al microscopio per assicurarsi che siano sani. Rimuovere tutti i terreni dalle piastre delle celle di alimentazione MEF e sostituirli con un millilitro di terreni hESC.

Inoltre, cambiare il mezzo hESC sulle piastre hPSC a sei pozzetti che verranno prelevate. Quindi, estrai le pipette di vetro per raccogliere le colonie. Per prelevare le colonie, posizionare prima le hPFC su piastra sul tavolino del microscopio di dissezione nella cappa di coltura tissutale, assemblare il dispositivo di prelievo posizionando l'estremità della pipetta di vetro nel bulbo di aspirazione.

Identificare la colonia da raccogliere e posizionare la punta della pipetta di vetro estratta sopra la colonia. Quindi, comprimere il bulbo del dispositivo di raccolta per asportare e tagliare delicatamente una singola colonia in 10-20 pezzi di uguali dimensioni. Quindi, aspirare i pezzi di colonia asportati nella pipetta rilasciando il bulbo.

Cerca di prendere il minor numero possibile di file multimediali durante il trasferimento. Comprimere il bulbo per trasferire la colonia ora rotta direttamente in un pozzetto di una piastra cellulare di alimentazione MEF a 12 pozzetti. Etichettare ogni pozzetto per consentire l'identificazione univoca dei cloni derivati da singole cellule.

Cambia la pipetta di vetro e ripeti la procedura per la colonia successiva. Rimetti le piastre nell'incubatrice e fai oscillare delicatamente le piastre per disperdere le cellule nel pozzetto. Il giorno successivo, rimuovere l'intero volume del terreno e sostituirlo con uno virgola cinque millilitri di terreno hESC caldo.

Ripetere per 10-12 giorni fino a quando le cellule sono confluenti al 50%. Dopo 10-12 giorni, ispezionare le hESC sotto l'ambito. Prelevare una o due colonie da ciascun pozzetto e trasferirle su nuove piastre di celle di alimentazione MEF a 12 pozzetti per generare una piastra replica.

Estrarre il DNA dalle colonie rimanenti in ciascun pozzetto delle piastre originali per la genotipizzazione mediante PCR o southern blot. Weber Tre cellule staminali embrionali umane sono state indirizzate al locus AAVS1 utilizzando nucleasi sito-specifiche e un modello di riparazione per introdurre un reporter EFFP e una cassetta di resistenza alla puromicina. Queste immagini rappresentative mostrano colonie modificate con nucleasi a dita di zinco, TALEN e CRISPR/Cas9.

Questi risultati rappresentativi della genotipizzazione PCR mostrano cloni mirati non bersaglio, eterozigoti e omozigoti che utilizzano nucleasi a dita di zinco, TALEN e CRISPR/Cas9 insieme a un controllo wild type. Questa tabella mostra le integrazioni verificate dalla PCR al locus AAVS1 per ciascuna nucleasi sito-specifica in questo esperimento, rispetto alle integrazioni singole corrette verificate da Southern Blot negli esperimenti precedenti. CRISPR-Cas9 ha prodotto i cloni più correttamente mirati, mentre la piattaforma TALEN aveva i cloni più omozigi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede dalle tre alle cinque ore di tempo pratico e puoi ottenere cellule modificate entro circa tre settimane dall'inizio degli esperimenti. È davvero importante con questa tecnica lavorare in sicurezza e utilizzare sempre la tecnica sterile. Dopo la manipolazione genetica, si può vedere come influisce su altri tipi di cellule utilizzando la differenziazione delle cellule staminali in altri tipi di cellule, come i neuroni.

Lo sviluppo di questo protocollo ha spianato la strada ai ricercatori per utilizzare l'editing del genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane per stabilire modelli di malattia in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane.