Reazione quantitativa della polimerasi a catena per enumerare i batteriofagi

Per enumerare i batteriofagi tramite la reazione a catena della polimerasi quantitativa, qPCR, ottenere un cocktail di reazione qPCR contenente Taq DNA polimerasi, primer, deossinucleotide trifosfati - dNTP - e molecole di colorante reporter fluorescente in un tampone ottimizzato. Trasferire nei pozzetti di una piastra qPCR.

Aggiungere batteriofagi trattati termicamente. Il trattamento termico rilascia il DNA dei batteriofagi dalle particelle dei batteriofagi. Sigillare la piastra, impedendo l'evaporazione della miscela. Caricare la piastra nel sistema qPCR, impostando le condizioni di ciclo appropriate.

Il riscaldamento ad alte temperature denatura il DNA a doppio filamento in singoli filamenti. Attiva anche la Taq DNA polimerasi. La ricottura fa sì che i primer sequenza-specifici si leghino ai filamenti di DNA dei batteriofagi complementari. L'estensione consente alla Taq DNA polimerasi attivata di aggiungere dNTP all'estremità 3' del primer, estendendo il filamento di DNA in crescita nella direzione da 5' a 3'

Le molecole di colorante si intercalano nel DNA a doppio filamento appena sintetizzato, causando un aumento dell'intensità della fluorescenza. Ogni ciclo di PCR raddoppia la quantità di DNA target, aumentando l'intensità della fluorescenza.

Determinare il valore del ciclo di soglia, Ct, al quale la fluorescenza misurata supera il livello di fondo.

Il valore Ct è inversamente correlato alla quantità di DNA iniziale, con ogni genoma del batteriofago equivalente a una particella di batteriofago, facilitando la quantificazione del batteriofago dalla curva standard del DNA del batteriofago.

Post-amplificazione, eseguire l'analisi della curva di fusione, aumentando gradualmente la temperatura di reazione. A una specifica temperatura di fusione, metà del DNA si separa in singoli filamenti, rilasciando molecole di colorante e causando un'improvvisa diminuzione della fluorescenza.

Una temperatura di fusione distinta, unica per il prodotto qPCR, convalida la specificità del prodotto.