Southern Blotting per rilevare la ricombinazione omologa nel genoma delle cellule staminali embrionali di topo

Il Southern blotting comporta l'identificazione di specifiche sequenze di DNA da un complesso mix di DNA tramite il rilevamento basato su sonda.

Per identificare la ricombinazione omologa o gli eventi HR nelle cellule staminali embrionali di topo con Southern blotting, ottenere il DNA genomico dalle cellule. Incubare con un enzima di restrizione per digerire il DNA in frammenti più piccoli.

Caricare il DNA su un gel di agarosio. Eseguire l'elettroforesi per la separazione dei frammenti in base alle dimensioni.

Trattare il gel con una soluzione acida per rimuovere le basi puriniche, allentando il DNA a doppio filamento, dsDNA. Aggiungere una soluzione denaturante alcalina. L'alto pH interrompe i legami idrogeno, denaturando il dsDNA allentato in DNA a filamento singolo, ssDNA. Incubare con una soluzione neutralizzante per neutralizzare il pH del gel.

Assemblare il sistema di trasferimento utilizzando carta assorbente, una membrana di nylon e gel impilati sopra la membrana. Eseguire il trasferimento. L'ssDNA si trasferisce dal gel alla membrana attraverso l'azione capillare verso il basso.

Irradiare la membrana con raggi ultravioletti, reticolando e immobilizzando il DNA. Porre la membrana in una provetta contenente una soluzione di ibridazione. Incubare con rotazione, rivestendo la membrana e impedendo il legame aspecifico della sonda.

Infine, incubare la membrana con il tampone di ibridazione contenente sonde marcate radioattivamente a singolo filamento. Le sonde si legano a specifiche regioni del DNA tramite complementarità di sequenza.

Lavare la membrana, rimuovendo le sonde non legate. Esporre la membrana ai raggi X. Bande distinte sulla membrana distinguono le regioni del DNA contenenti eventi HR dalle regioni di controllo.