Name: Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Impara a criopreservare e recuperare cellule iPS umane usando KnockOut SR in condizioni feeder-free o con feeder. Questo protocollo garantisce elevata vitalità cellulare post-scongelamento.

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Nota: Per mantenere condizioni di coltura sterili, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuate utilizzando pratiche di laboratorio sterile e condotto sotto una cappa a flusso laminare. Prima di iniziare, assicurarsi che i media sono equilibrati a 37 ° C e opportunamente gasati. Preparazione Geltrex rivestita Piatti Cultura Nota: vedi appendice per l&#39;uso di piatti CELLstart cultura rivestito. <ol><li> Scongelare un tubo di Geltrex (1 ml) lentamente a 2-8 ° C e diluire 1:100 in 99 ml di Knockout D-MEM/F-12. Mescolare delicatamente la soluzione. Nota: alcune linee di cellule iPS possono richiedere una diversa diluizione Geltrex per una crescita ottimale. Vedi appendice per le diluizioni alternative. </li><li> Coprono l&#39;intera superficie di ogni piatto cultura con la soluzione Geltrex (1 mL per un piatto da 35 mm, 1,5 ml per un piatto di 60 mm). </li><li> Sigillare ogni piatto con Parafilm contro l&#39;essiccamento e incubare i piatti per 1 ora a 37 ° C. Nota: A questo punto si può memorizzare il Geltrex rivestite piatti di cultura a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Sigillare ogni piatto con Parafilm per evitare che il Geltrex si secchi. </li><li> Prima di utilizzare, trasferire il Geltrex rivestite piatti di una cappa a flusso laminare e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 1 ora). </li></ol> Preparazione completa alimentatore-Free SR KnockOut Media <ol><li> Per preparare 1 mL di 10 mg / ml soluzione di base FGF, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino a 6 mesi. <table border="0"><tbody><tr><td> Di base FGF </td><td> 10 mcg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% di BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA può essere sostituito con HSA o SR Knockout alla stessa concentrazione. </li><li> Per preparare 50 ml di 2 mg / ml soluzione dispasi, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Filtrare la soluzione sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispasi </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Per preparare 100 mL di SR KnockOut completo alimentatore-Free (KSR-FF) asetticamente combinare i componenti elencati nella tabella sottostante. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione magazzino </td><td> Concentrazione finale </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (n ° cat. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR (n ° cat. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (n ° cat. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> bFGF (n ° cat. PHG0024). </td><td> 10 mcg / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table> Si può memorizzare il KSR-FF medio a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Poco prima di pre-raggiunga l&#39;equilibrio completo a temperatura e gas, in modo asettico aggiungere il volume richiesto di 2 mercaptoetanolo (55 concentrazione magazzino mm) per una concentrazione di 0,1 mM finale. Ad esempio, per preparare 100 ml di KSR-FMedio F aggiungere 182 microlitri di 55 mM di 2-mercaptoetanolo (diluizione 1:550) In alternativa, il 2-mercaptoetanolo possono essere aggiunti al mezzo di 1X completato e conservato a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. </li></ol> Preparazione di congelamento / Crioconservazione Media Il mezzo di crioconservazione è composto da due mezzi di comunicazione; Media congelamento A e B. Media congelamento Essi sono aggiunti alle cellule in tempi diversi e devono rimanere separati. Ciascuno di essi è il 50% del volume totale delle medie Crioconservazione necessario. Il volume totale delle medie Crioconservazione necessario è di 1 ml per ogni flacone da congelare. Un 90% piatto confluenti 60mm hESC può essere utilizzato alla banca 2 flaconi di hESC nei media crioconservazione. Preparare un volume sufficiente di ogni media di congelamento con un extra di 2-5mL per assicurare eccedenza. <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Media A (50% del volume finale): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Congelamento Media B (50% del volume finale): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% di DMSO </td></tr></tbody></table> Esempio: Se siete congelamento 20 fiale di cellule, avrete bisogno di 20 mL di media crioconservazione. Aggiungere 4 ml di carico eccessivo per un totale di Media Crioconservazione 24ml. Ciò significa che avrete bisogno di 12 ml di Media congelamento A (50% di 24ml) e 12 ml di B Media di congelamento (50% di 24ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Media A (12 ml): </td><td> 6 ml DMEM/F12 </td><td> 6 ml KSR </td></tr><tr><td> Congelamento Media B (12 ml): </td><td> 9,6 mL DMEM/F12 </td><td> 2,4 mL di DMSO </td></tr></tbody></table> La composizione finale del Medio Crioconservazione DMEM/F12 è del 65%, 25% KSR, e il 10% di DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol><li> Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento a 1below tabella per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Aspirare il terreno trascorso dalla nave cultura con una pipetta, e lavare le cellule due volte con D-PBS. </li><li> Aggiungere delicatamente preriscaldato soluzione dispasi alla nave cultura (ad esempio, 1 mL di soluzione dispasi per 60 mm piatto di cultura). Agitare il recipiente di coltura per ricoprire l&#39;intera superficie delle cellule. </li><li> Incubare il recipiente di coltura a 37 ° C per 3 minuti. </li><li> Rimuovere il recipiente dal termostato, aspirare la soluzione dispasi, e lavare delicatamente le cellule con D-PBS. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto cultura utilizzando un raschietto cellula, e trasferire le cellule in una provetta sterile centrifuga 15ml. </li><li> Lavare il piatto cultura due volte con KSR-FF, dolcemente &quot;spruzzo off&quot; tutte le cellule che non si sono staccati. Piscina di risciacquo medio con le cellule nel tubo 15ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule e smaltirlo. </li><li> Preparare una quantità sufficiente di cryovials. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti. </li><li> Picchiettare lievemente il tubo, per rimuovere completamente il pellet dal fondo del tubo e risospendere le cellule in A. Medio congelamento [pipettando gentilmente su e giù con un 5-mL sierologici pipetta]. A seguito di sospensione uniforme di grumi, aggiungere uguale volume di B Media congelamento ad esso, in maniera goccia a goccia, mentre rimestando delicatamente la sospensione cellulare per mescolare. Nota: A questo punto, le cellule sono in contatto con DMSO, e il lavoro deve essere eseguito in modo efficiente. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti. </li><li> Aliquota 1 ml di sospensione cellulare in ogni provetta Microbank ™. </li><li> Introdurre rapidamente le provette in un gelido Mr. [di congelare rapidamente] e trasferirlo a -80 ° C durante la notte. </li><li> Dopo una notte di stoccaggio a -80 ° C, trasferire le cellule a un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> IPSC disgelo flaconcino e il recupero delle cellule Nota: KSR-FF può essere sostituito con KSR contenenti MEF condizionata medio, o medio KSR per l&#39;uso con alimentatori. Vedere l&#39;appendice per le istruzioni per la preparazione dei media. Preriscaldare 10 ml di KSR-FF media in un tubo da 50 ml. <ol><li> Equilibrare la quantità appropriata di Geltrex rivestite piatti a temperatura ambiente ed aspirare il liquido dai piatti poco prima di placcaturar cellule. </li><li> Rimuovere con cura il hESC (o IPSC) fiala da serbatoio di stoccaggio di azoto liquido. </li><li> Rapido disgelo fiala congelata di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, fino a poco un piccolo pezzo rimane congelato nel flacone. </li><li> Spray fiala con il 70% di isopropanolo per decontaminare e trasferimento alla cappa sterile coltura di tessuti. </li><li> Trasferire asetticamente l&#39;intero contenuto del flacone in un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml. </li><li> Sciacquare la fiala con 1 ml di KSR-FF e aggiungere questo al tubo da 15 ml per centrifuga. </li><li> Lentamente, aggiungere 4 ml di KSR-FF goccia a goccia per le cellule nel tubo 15 ml conica. Mentre l&#39;aggiunta del mezzo, spostare delicatamente il tubo avanti e indietro per mescolare le cellule. (Questo riduce shock osmotico alle cellule). </li><li> Centrifugare il tubo di 15 ml con la sospensione cellulare a 1000rpm (200 x g) per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Con attenzione aspirare e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in fase di pre-riscaldato KSR-FF (ad esempio 4mL/60 piatto mm) con una pipetta da 5 ml e pipettare delicatamente le cellule su e giù fino a pellet cellulare è completamente dispersa. Una vitalità maggiore del 70% è previsto, se la vitalità è inferiore al 70%, può richiedere più tempo per le cellule di raggiungere confluenza. </li><li> Utilizzando la medesima pipetta, trasferire la sospensione cellulare goccia a goccia a Geltrex rivestite piatto cultura pre-equilibrati a temperatura ambiente. </li><li> Porre la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C, con un atmosfera umidificata da 4 a 6% di CO 2 in aria. Con attenzione nave vortice in direzione nord a sud, da est a ovest modello per distribuire uniformemente le cellule. </li><li> Delicatamente liquido cambiare il piatto cultura 24 ore post-disgelo e quindi giornalmente per rimuovere i detriti cellulari e per fornire nutrienti fresco fino a quando il piatto è circa il 70-80% confluenti. Per la cultura continua e passaging delle cellule iPS, fare riferimento al nostro protocollo dal titolo &quot;Alimentazione-Free Cultura e Passaging di cellule umane iPS usando completa sostituzione siero KnockOut alimentatore-Free Media&quot; </li></ol> Risultati attesi Le cellule dovrebbero essere circa il 70-80% confluenti prima di crioconservazione. Dispasi risultati digestione nel curling e piegatura delle colonie lungo i margini colonia. Dopo la raccolta le cellule sono congelati come piccoli ammassi in mezzi crioconservazione. Una volta che il flacone è scongelato, le cellule recuperare e allegare alla pre-rivestite piatto come grumi di piccole dimensioni. Crescono rapidamente porta a un piatto confluenti in 5-6 giorni. Tabella 1 - Volumi consigliati <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 35 millimetri Piatto </td><td> Piatto 60 millimetri </td><td> Dish 100 millimetri </td></tr><tr><td> Completa KnockOut SR media </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Geltrex Soluzione </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> D-PBS per il risciacquo </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">cliccare qui per vedere l&#39;appendice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Life Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Knockout</td><td></td><td>12660-012</td><td>Nota: vedere l'appendice per l'uso di prodotti DMEM alternativi GlutaMAX-I (N. Cat. 35050-061)</td></tr><tr><td>Sostituto Sierico KnockOut</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di Fattori di Crescita per Sostituto Sierico KnockOut</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, proteina ricombinante umana, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Nota: vedere l'appendice per alternative nei formati del bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;etanolo</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td></td><td>17105-041</td><td>Nota: vedere l'appendice per metodi alternativi di passaggio</td></tr><tr><td>Matrice Basale Geltrex hESC-Qualificata con Fattori di Crescita Ridotti, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Salina Fosfato-Tampone di Dulbecco&amp;rsquo;s (D-PBS) senza calcio e magnesio</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500 mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a Flusso Laminare Sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice impostata a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili graduate (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre da coltura cellulare trattate da 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di stoccaggio in azoto liquido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitori per congelamento in isopropanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crioprovetta da 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving e recupero di cellule umane ips usando knockout completa alimentatore-free siero sostituzione media

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

La scoperta nel 2006 che fibroblasti umani e mouse potrebbe essere riprogrammato per generare cellule iPS 1-3 con caratteristiche molto simili alle cellule staminali embrionali ha creato una nuova fonte preziosa di cellule pluripotenti per la scoperta di farmaci, terapia cellulare, e la ricerca di base. Mezzi di comunicazione GIBCO e reagenti sono stati in prima linea nella ricerca sulle cellule staminali pluripotenti da anni. Knockout DMEM integrato con sostituzione Knockout siero è il media di scelta per la crescita delle cellule staminali embrionali e ora di cellule iPS cultura 3-9. Il gold standard del sistema dei media può ora essere utilizzato per alimentazione priva di cultura con l&#39;aggiunta di Cocktail SR Factor Knockout crescita. Tradizionale ES umane e metodi di coltura delle cellule iPS richiedono l&#39;uso di mouse o strati alimentatore fibroblasti umani, o l&#39;alimentatore condizionata media. Questi metodi sono cultura alta intensità di lavoro, difficili da scalare ed è difficile mantenere anche le cellule indifferenziate a causa delle condizioni indefinito. Invitrogen ha sviluppato SR Knockout Cocktail fattore di crescita per consentire di transizione facilmente i fianchi e le colture cellulari hES alla rinfusa, senza pur mantenendo l&#39;uso di SR Knockout.

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

La scoperta del 2006 che i fibroblasti umani e murini potevano essere riprogrammati per generare cellule iPS 1-3 con qualità notevolmente simili alle cellule staminali embrionali...

L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare e recuperare cellule IPS in condizioni di coltura con o senza cellule di supporto. Questo viene ottenuto innanzitutto iniziando a preparare le tue cellule IPS come faresti normalmente. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trasferire le cellule in un mezzo di congelamento privo di siero.Il terzo passaggio della procedura consiste nel criopreservare come di consueto. L'ultimo passaggio della procedura è scongelare le cellule e iniziare la manutenzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano un congelamento e uno scongelamento riusciti delle cellule IPS in un mezzo di congelamento privo di siero, grazie a una morfologia sana e a un buon recupero dopo lo scongelamento.Ciao, sono Kate Wagner presso il sito GCO di Life Technologies. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché gli IPC possono essere molto sensibili al congelamento e alla temperatura fine. Quello che rende più semplice questo protocollo è che il sostituto del siero knockout può essere utilizzato in tutto il processo lavorativo.Oggi la famiglia di prodotti KSR comprende un'intera gamma di mezzi e reagenti per la coltura, con o senza cellule sentinella, libera da alimenti e libera da componenti xenogeni, delle vostre cellule staminali embrionali e delle cellule staminali pluripotenti indotte. KSR può essere utilizzato per la derivazione, la crescita, la criopreservazione, l'espansione e i primi passaggi iniziali della differenziazione. Il seguente video vi mostrerà come scongelare e congelare autonomamente utilizzando KSR in una macchina priva di Peter.Per iniziare questa procedura, riscaldare innanzitutto una quantità adeguata di mezzo completo privo di feeder a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Aspirare il mezzo usato dal contenitore di coltura, in questo caso una piastra da 60 millimetri. Risciacquare quindi le cellule staminali pluripotenti indotte umane due volte con DPBS.Quindi aggiungere un millilitro di dispa alla piastra. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aspirare la soluzione di dispa e lavare delicatamente le cellule con DPBS.Successivamente, aggiungere mezzo completo senza feeder fino a ricoprire la piastra e utilizzare una spatola per cellule per staccare delicatamente le cellule e trasferirle in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri. Risciacquare la piastra con mezzo completo senza feeder, spruzzando delicatamente per rimuovere eventuali cellule non staccate. Trasferire la soluzione di risciacquo nello stesso tubo da 15 millilitri contenente le cellule.Risciacquare la piastra una seconda volta con il mezzo e raccogliere questa soluzione di risciacquo insieme alle cellule pellettizzandole mediante centrifugazione a 1000 RPM per tre minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo.Quindi aggiungere un millilitro del mezzo di congelamento A, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Dopo aver ottenuto una sospensione uniforme degli aggregati, aggiungere un millilitro del mezzo di congelamento B al tubo in modo goccia a goccia, agitando delicatamente la sospensione cellulare con movimenti rotatori per favorire il mescolamento. Aliquotare un millilitro di sospensione cellulare in ciascuna provetta criogenica e congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius durante la notte in una camera contenente isopropanolo.Il giorno seguente, trasferire le provette con le cellule in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Scongelare rapidamente la provetta congelata immergendola in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa tre o quattro minuti, fino a quando nella provetta rimane solo un piccolo grumo ghiacciato. Dopo aver rimosso la provetta dal bagno a ultrasuoni, spruzzarla con isopropanolo al 70% per decontaminarla, quindi utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire asetticamente l'intero contenuto della provetta in un tubo conico da 15 millilitri.Il passaggio successivo potrebbe essere l'aspetto più difficile della procedura. Il mezzo senza feeder deve essere aggiunto lentamente e con attenzione alle cellule. Per ridurre lo shock osmotico, aggiungere lentamente quattro millilitri di mezzo completo senza feeder goccia a goccia alle cellule nel tubo conico da 15 millilitri.Aggiungendo il mezzo, muovere delicatamente il tubo avanti e indietro per mescolare le cellule. Questo ridurrà lo shock osmotico alle cellule. Il mezzo completo senza feeder può essere sostituito con mezzo condizionato al metionina contenente sostituto del siero knockout o con mezzo contenente sostituto del siero knockout da utilizzare con feeder; fare riferimento al testo del protocollo per le istruzioni sulla preparazione dei mezzi.Dopo aver aggiunto tutti e quattro i millilitri di mezzo, centrifugare le cellule a 1000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in quattro millilitri di mezzo completo privo di cellule nutrici.Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere delicatamente la sospensione cellulare, goccia a goccia, in una piastra da coltura da 60 millimetri rivestita con gelt trucks. Posizionare la piastra da coltura in un incubatore a 36-38 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata contenente dal 4 al 6% di anidride carbonica in aria. Ruotare con attenzione la piastra secondo un movimento da nord a sud e da est a ovest per distribuire uniformemente le cellule.24 ore dopo il scongelamento. Sostituire il mezzo nel piatto con mezzo fresco. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza di circa il 70-80%.Questa immagine di contrasto mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piatti da coltura rivestiti con gelt TRX, utilizzando un mezzo privo di siero e di cellule sentinella. Le cellule IPC presentano una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane, caratterizzata da nuclei grandi e citoplasma scarso. Un esempio di cellule dopo il scongelamento e la sostituzione del siero knockout.Qui è mostrato il mezzo senza feeder su gelt TrackX. Quando si segue questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le colonie cellulari delle stesse dimensioni. Questo migliora il recupero cellulare durante la criopreservazione.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Cellule germinali primordiali (PGC) sono precursori comuni di uova e sperma. PGC embrionale umano vengono specificati da cellule pluripotenti dell'epiblasto attraverso interazioni delle citochine. Qui, descriviamo un protocollo di 13 giorni di indurre le cellule umane transcriptomally PGC di somiglianza alla superficie dei corpi embryoid da cellule staminali pluripotenti di innescato-pluripotenza indotta.

Cellule staminali pluripotenti indotte generazione umana primordiale delle cellule di germe-come delle cellule sulla superficie dei corpi Embryoid da pluripotenza innescato

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'efficiente crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane.

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Impara a criopreservare e recuperare cellule iPS umane usando KnockOut SR in condizioni feeder-free o con feeder. Questo protocollo garantisce elevata vitalità cellulare post-scongelamento.

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

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