Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media
15 luglio 2010
Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.
L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare e recuperare cellule IPS in condizioni di coltura con o senza cellule di supporto. Questo viene ottenuto innanzitutto iniziando a preparare le tue cellule IPS come faresti normalmente. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trasferire le cellule in un mezzo di congelamento privo di siero.
Il terzo passaggio della procedura consiste nel criopreservare come di consueto. L'ultimo passaggio della procedura è scongelare le cellule e iniziare la manutenzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano un congelamento e uno scongelamento riusciti delle cellule IPS in un mezzo di congelamento privo di siero, grazie a una morfologia sana e a un buon recupero dopo lo scongelamento.
Ciao, sono Kate Wagner presso il sito GCO di Life Technologies. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché gli IPC possono essere molto sensibili al congelamento e alla temperatura fine. Quello che rende più semplice questo protocollo è che il sostituto del siero knockout può essere utilizzato in tutto il processo lavorativo.
Oggi la famiglia di prodotti KSR comprende un'intera gamma di mezzi e reagenti per la coltura, con o senza cellule sentinella, libera da alimenti e libera da componenti xenogeni, delle vostre cellule staminali embrionali e delle cellule staminali pluripotenti indotte. KSR può essere utilizzato per la derivazione, la crescita, la criopreservazione, l'espansione e i primi passaggi iniziali della differenziazione. Il seguente video vi mostrerà come scongelare e congelare autonomamente utilizzando KSR in una macchina priva di Peter.
Per iniziare questa procedura, riscaldare innanzitutto una quantità adeguata di mezzo completo privo di feeder a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Aspirare il mezzo usato dal contenitore di coltura, in questo caso una piastra da 60 millimetri. Risciacquare quindi le cellule staminali pluripotenti indotte umane due volte con DPBS.
Quindi aggiungere un millilitro di dispa alla piastra. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aspirare la soluzione di dispa e lavare delicatamente le cellule con DPBS.
Successivamente, aggiungere mezzo completo senza feeder fino a ricoprire la piastra e utilizzare una spatola per cellule per staccare delicatamente le cellule e trasferirle in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri. Risciacquare la piastra con mezzo completo senza feeder, spruzzando delicatamente per rimuovere eventuali cellule non staccate. Trasferire la soluzione di risciacquo nello stesso tubo da 15 millilitri contenente le cellule.
Risciacquare la piastra una seconda volta con il mezzo e raccogliere questa soluzione di risciacquo insieme alle cellule pellettizzandole mediante centrifugazione a 1000 RPM per tre minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per staccare completamente il pellet cellulare dal fondo del tubo.
Quindi aggiungere un millilitro del mezzo di congelamento A, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Dopo aver ottenuto una sospensione uniforme degli aggregati, aggiungere un millilitro del mezzo di congelamento B al tubo in modo goccia a goccia, agitando delicatamente la sospensione cellulare con movimenti rotatori per favorire il mescolamento. Aliquotare un millilitro di sospensione cellulare in ciascuna provetta criogenica e congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius durante la notte in una camera contenente isopropanolo.
Il giorno seguente, trasferire le provette con le cellule in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Scongelare rapidamente la provetta congelata immergendola in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa tre o quattro minuti, fino a quando nella provetta rimane solo un piccolo grumo ghiacciato. Dopo aver rimosso la provetta dal bagno a ultrasuoni, spruzzarla con isopropanolo al 70% per decontaminarla, quindi utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire asetticamente l'intero contenuto della provetta in un tubo conico da 15 millilitri.
Il passaggio successivo potrebbe essere l'aspetto più difficile della procedura. Il mezzo senza feeder deve essere aggiunto lentamente e con attenzione alle cellule. Per ridurre lo shock osmotico, aggiungere lentamente quattro millilitri di mezzo completo senza feeder goccia a goccia alle cellule nel tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungendo il mezzo, muovere delicatamente il tubo avanti e indietro per mescolare le cellule. Questo ridurrà lo shock osmotico alle cellule. Il mezzo completo senza feeder può essere sostituito con mezzo condizionato al metionina contenente sostituto del siero knockout o con mezzo contenente sostituto del siero knockout da utilizzare con feeder; fare riferimento al testo del protocollo per le istruzioni sulla preparazione dei mezzi.
Dopo aver aggiunto tutti e quattro i millilitri di mezzo, centrifugare le cellule a 1000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in quattro millilitri di mezzo completo privo di cellule nutrici.
Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere delicatamente la sospensione cellulare, goccia a goccia, in una piastra da coltura da 60 millimetri rivestita con gelt trucks. Posizionare la piastra da coltura in un incubatore a 36-38 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata contenente dal 4 al 6% di anidride carbonica in aria. Ruotare con attenzione la piastra secondo un movimento da nord a sud e da est a ovest per distribuire uniformemente le cellule.
24 ore dopo il scongelamento. Sostituire il mezzo nel piatto con mezzo fresco. Sostituire il mezzo usato ogni giorno successivamente fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza di circa il 70-80%.
Questa immagine di contrasto mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piatti da coltura rivestiti con gelt TRX, utilizzando un mezzo privo di siero e di cellule sentinella. Le cellule IPC presentano una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane, caratterizzata da nuclei grandi e citoplasma scarso. Un esempio di cellule dopo il scongelamento e la sostituzione del siero knockout.
Qui è mostrato il mezzo senza feeder su gelt TrackX. Quando si segue questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le colonie cellulari delle stesse dimensioni. Questo migliora il recupero cellulare durante la criopreservazione.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo protocollo descrive la procedura per la criopreservazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPS) utilizzando il mezzo di criopreservazione KnockOut SR e il loro recupero in un mezzo completo KnockOut SR senza feeder (KSR-FF) o in un mezzo KnockOut SR con feeder. Il metodo sottolinea l'importanza di una dimostrazione visiva a causa della sensibilità delle cellule iPS durante il congelamento e il scongelamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
- Tecniche di criopreservazione
Sfondo
- Le cellule iPS umane sono sensibili ai processi di congelamento e scongelamento.
- I prodotti KnockOut SR facilitano varie fasi della coltura di cellule staminali.
- Una corretta criopreservazione è fondamentale per mantenere la vitalità cellulare.
- Per le cellule iPS possono essere utilizzate condizioni di coltura con o senza cellule di supporto (feeder).
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per la criopreservazione di cellule iPS.
- Garantire un recupero efficace delle cellule dopo il scongelamento.
- Dimostrare l'utilizzo dei prodotti KSR durante tutto il processo operativo.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cellule iPS per la criopreservazione.
- Utilizzo di un mezzo di congelamento privo di siero per la conservazione delle cellule.
- Criopreservazione a -80 gradi Celsius seguita da conservazione in azoto liquido.
- Scongelamento e risospensione delle cellule in un mezzo completo privo di feeder.
Risultati principali
- Corretta congelazione e scongelamento di cellule iPS dimostrata da una morfologia sana.
- Le cellule hanno mantenuto vitalità e crescita sia in condizioni senza feeder che con feeder.
- L'efficacia del protocollo confermata tramite valutazione visiva del recupero cellulare.
- Il mantenimento di una dimensione uniforme delle colonie cellulari ha migliorato i tassi di recupero.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio sistematico alla criopreservazione di cellule iPS.
- I prodotti KnockOut SR sono efficaci per mantenere la salute cellulare durante il processo.
- Le dimostrazioni visive migliorano la comprensione e l'esecuzione del protocollo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La criopreservazione affidabile e il recupero di cellule iPS umane utilizzando un mezzo definito senza cellule di supporto affrontano direttamente le sfide relative alla scalabilità e alla standardizzazione nella scoperta precoce e nella ricerca traslazionale. Questo protocollo consente una banca cellulare pluripotente costante, sostenendo lo sviluppo di saggi robusti e applicazioni successive nei portafogli di scoperta di farmaci. I flussi di lavoro senza cellule di supporto riducono la variabilità biologica, aumentando la fiducia predittiva e il triage del portafoglio in punti critici di svolta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'archiviazione coerente di cellule pluripotenti per test ripetuti di ipotesi e analisi di percorsi molecolari.
- Riduce la variabilità biologica eliminando i strati di cellule nutritizie, favorendo la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici mantenendo la vitalità cellulare e la pluripotenza dopo il scongelamento.
- Consente una maggiore affidabilità predittiva nelle decisioni di screening e triage nelle fasi iniziali.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema standardizzato, privo di cellule sentinella, per preparare cellule iPS validate per saggi ad alto rendimento.
- Migliora la riproducibilità e la scalabilità dei saggi cellulare utilizzando componenti di mezzo definiti.
- Permette una valutazione affidabile dei composti assicurando il recupero di cellule sane e indifferenziate.
- Supporta il riutilizzo della piattaforma e la standardizzazione dei saggi tra i diversi team di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Mantiene modelli cellulari pertinenti alla malattia per studi traslazionali di biomarcatori quando si utilizzano cellule iPS derivate da pazienti.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, sostenendo un recupero e un’espansione cellulari robusti.
- Riduce il rischio di variabilità tra lotti nello sviluppo di modelli preclinici.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio fornendo fonti cellulari affidabili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di crioconservazione e recupero è adatto dalle prime fasi della scoperta fino alla ricerca preclinica, consentendo transizioni fluide tra le fasi di conservazione, espansione e impiego nei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico fornendo cellule sane e pluripotenti su richiesta.
- Screening: Fornisce cellule iPS pronte per i saggi, con morfologia e vitalità riproducibili, per letture quantitative.
- Analisi: Permette misurazioni costanti dello stato di salute e del recupero cellulare, favorendo il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la continuità nella modellizzazione delle malattie e nell'allineamento dei biomarcatori quando si utilizzano linee derivate da pazienti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile e privo di cellule nutrici per la gestione delle cellule pluripotenti in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi basati su cellule.
- Valore operativo: Standardizza la criopreservazione e il recupero, migliorando la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di prosecuzione/cessazione e una maggiore efficienza del capitale riducendo i rischi biologici in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta e traslazionali con una gestione del rischio adeguata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di cellule staminali pluripotenti e nelle tecniche di coltura senza feeder.
- Necessita dell'accesso a mezzi definiti, attrezzature per la criopreservazione e infrastrutture per il scongelamento controllato.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team riguardo alle dimensioni delle colonie cellulari e alle procedure di manipolazione per un recupero ottimale.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse linee di cellule iPS o modelli di malattia.
- Una gestione accurata dello shock osmotico è fondamentale per mantenere la vitalità cellulare dopo lo scongelamento.
