Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di crioconservare e recuperare le cellule IPS in condizioni di coltura basate su feeder o senza feeder. Ciò si ottiene iniziando prima a impacchettare i tuoi IPC come faresti normalmente. Il secondo passo della procedura consiste nel trasferire le cellule nel mezzo di congelamento libero dal siero.

Il terzo passo della procedura consiste nel crioconservare come faresti normalmente. La fase finale della procedura consiste nello scongelare le cellule e iniziare la manutenzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il successo del congelamento e dello scongelamento delle cellule IPS nel terreno di congelamento libero del siero attraverso una morfologia sana e il recupero dopo lo scongelamento.

Ciao, sono Kate Wagner presso il sito GCO di Life Technologies. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché gli IPC possono essere molto sensibili al congelamento e al T fine. Ciò che rende questo protocollo più semplice è che la sostituzione del siero knockout può essere utilizzata durante l'intero flusso di lavoro.

Oggi la famiglia di prodotti KSR include un elenco completo di terreni e reagenti per colture feeder free e xeno free di cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. KSR può essere utilizzato per la crescita della derivazione, la crioconservazione, l'espansione e le prime fasi iniziali della differenziazione. Il seguente video vi mostrerà scongelarvi e congelarvi utilizzando KSR in una macchina senza Peter.

Per iniziare questa procedura. Prima scaldare in una quantità appropriata di terreno completo privo di alimentatore a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua, aspirare il terreno esaurito dal recipiente di coltura, che è un piatto da 60 millimetri. In questo caso, sciacquare due volte le cellule staminali pluripotenti indotte umane con DPBS.

Quindi aggiungere un millilitro di dispa al piatto. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aspirare la soluzione dispa e lavare delicatamente le cellule con DPBS.

Quindi, aggiungere un terreno completamente privo di alimentatore per coprire il piatto e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule di trasferimento delle cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Sciacquare la pietanza con fertilizzante completo di terreno libero, spruzzando delicatamente le cellule che non si sono staccate. Trasferire la soluzione di risciacquo nella stessa provetta da 15 millilitri contenente le cellule.

Sciacquare la pirofila una seconda volta con del fluido e tirare la soluzione di risciacquo con le celle a pellet mediante centrifugazione a 1000 giri/min per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Muovere delicatamente il tubo per rimuovere completamente il pellet della cella dal fondo del tubo.

Quindi aggiungere un millilitro di terreno di congelamento A, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Dopo la sospensione uniforme dei grumi, aggiungere un millilitro di mezzo di congelamento B alla provetta in modo gocciolante, facendo roteare delicatamente la sospensione cellulare per mescolare. Allocare un millilitro di sospensione cellulare in ciascuna cella di congelamento criogenica a meno 80 gradi Celsius durante la notte in una camera di isopropanolo.

Il giorno seguente, trasferire le fiale di cellule in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Scongelare rapidamente la fiala di cellule congelate mettendola in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa tre o quattro minuti fino a quando non rimane solo un piccolo pezzo congelato nella fiala. Dopo aver rimosso la fiala dal bagnomaria, spruzzare con isopropanolo al 70% per decontaminarla, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire asetticamente l'intero contenuto della fiala in una provetta conica da 15 millilitri.

Il passo successivo potrebbe essere l'aspetto più difficile della procedura. Il terreno libero dall'alimentatore deve essere aggiunto lentamente e con attenzione alle celle. Per ridurre lo shock osmotico Aggiungere lentamente quattro millilitri di terreno privo di alimentatore completo goccia a goccia alle celle nel tubo conico da 15 millilitri.

Mentre aggiungi il terreno, muovi delicatamente la provetta avanti e indietro per mescolare le cellule. Ciò ridurrà lo shock osmotico alle cellule. Il terreno completo privo di alimentatore può essere sostituito con un sostituto del siero knockout contenente terreno condizionato con metanfetamina o un terreno sostitutivo del siero knockout per l'uso con gli alimentatori, fare riferimento al testo del protocollo per le istruzioni sulla preparazione del terreno.

Una volta aggiunti tutti e quattro i millilitri di terreno, centrifugare le celle a 1000 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare con cura il sano senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet di cella in quattro millilitri di terreno completamente privo di alimentatore.

Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere delicatamente la sospensione cellulare goccia a goccia in un piatto di coltura da 60 millimetri rivestito con camion di gelt. Posizionare il piatto di coltura in un'incubatrice a 36-38 gradi Celsius con un'atmosfera umidificata dal 4 al 6% di anidride carbonica nell'aria. Agitare con cura il piatto da nord a sud, da est a ovest per distribuire uniformemente le cellule.

24 ore dopo il disgelo. Sostituire il terreno nel piatto con un terreno fresco. Successivamente sostituire il terreno esaurito ogni giorno fino a quando le cellule diventano confluenti di circa il 70-80%.

Questa immagine a contrasto mostra cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su piastre di coltura rivestite con gelt TRX utilizzando la sostituzione completa del siero, terreno privo di alimentatore. Le IPC presentano una morfologia simile alle cellule staminali embrionali umane caratterizzate da nuclei grandi e scarso citoplasma. Un esempio di cellule dopo lo scongelamento e la sostituzione del siero knockout.

Il terreno senza alimentatore su gelt TrackX è mostrato qui. Quando si segue questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le colonie cellulari della stessa dimensione. Quando si conserva la crioconservazione, questo migliora il recupero cellulare.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.