Name: Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Impara un protocollo di crioconservazione ottimale per cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane. Questo metodo migliora i tassi di sopravvivenza post-scongelamento per terapie retiniche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (81970816) a Mei Jiang; la National Natural Science Foundation of China (82201223) a Xinyue Zhu; e il piano d'azione per l'innovazione scientifica e tecnologica della Commissione per la scienza e la tecnologia di Shanghai (2014090067000) a Haiyun Liu.

1. Dissociazione cellulare
<ol><li>Mantenere le cellule RPE come descritto in precedenza17,22. NOTA: Tutte le cellule vengono coltivate a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per tutta la durata dei protocolli.</li>
	<li>Preparare la quantità necessaria di PBS e terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 ° C e porre il reagente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare la soluzione di coltura e lavare le piastre due volte con 1 mL di PBS preriscaldato per pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare alle piastre a 6 pozzetti e digerire le cellule a 37 °C per 15 minuti. Dopo l'incubazione, osservare al microscopio le cellule che si restringono e brillano ai bordi per confermare la fine della digestione. NOTA: La dissociazione a base di tripsina non è raccomandata in quanto offre una bassa vitalità cellulare.</li>
	<li>Pipettare delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta da 1 mL per dissociare le cellule e diluire la sospensione cellulare con terreno di coltura preriscaldato (senza Y-27632) in un rapporto di 1:10. Quindi, centrifugare le celle a temperatura ambiente per 3 minuti a 250 × g.</li>
	<li>Versare rapidamente il surnatante dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2 mL del terreno di coltura e risospendere le cellule 10-15 volte con una pipetta.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione a cella singola e calcolare il numero di cellule. NOTA: Una sospensione a cella singola è essenziale per un conteggio accurato delle cellule e una densità di semina uniforme delle cellule dopo lo scongelamento.</li>
</ol>2. Determinazione dello stadio cellulare ottimale per la crioconservazione
NOTA: Poiché lo stato cellulare varia tra i metodi di differenziazione e le linee cellulari, la fase esponenziale delle cellule RPE coltivate in diversi laboratori deve essere determinata prima del congelamento.
<ol><li>Scongelare un flaconcino di soluzione di matrice di membrana basale su ghiaccio a 4 °C per una notte. Diluire la matrice in 12 mL di DMEM/F-12 freddo e mescolare bene. Aggiungere un vetrino coprioggetti per pozzetto e rivestire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,25 ml di soluzione diluita. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C prima dell'uso e aspirare la soluzione di rivestimento appena prima di galvanizzare le cellule. NOTA: Le istruzioni per il volume dell'aliquota sono specifiche per lotto in base alla concentrazione proteica e si trovano nella scheda tecnica del prodotto.</li>
	<li>Seminare le singole cellule RPE della fase 1.7 sui vetrini coprioggetto rivestiti con matrice di membrana basale a una densità di 105/cm2 in 1 mL di terreno di coltura. Aggiornare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Nei punti temporali indicati (1, 3, 5, 7 e 11 giorni dopo il passaggio), incubare le cellule RPE con 10 μM di EdU nel terreno per 24 ore. Fissare, permeabilizzare e colorare le cellule con il cocktail di reazione come descritto nel manuale per rilevare l'EdU incorporata.</li>
	<li>Acquisisci immagini da cinque campi casuali sotto un microscopio a fluorescenza e calcola la percentuale di cellule EdU-positive. Traccia le corrispondenti curve proporzionale-tempo EdU-positive per generare una curva di crescita. Quindi, determinare la finestra di congelamento o la fase esponenziale per ogni linea cellulare in base alla curva di crescita. NOTA: La morfologia esagonale delle celle ristabilita indica che le cellule escono dalla fase esponenziale.</li>
</ol>3. Crioconservazione
<ol><li>Seguendo i passaggi da 1.1 a 1.7, con la differenza che il tempo di digestione diminuisce a 5 minuti, centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 3 minuti a 250 × g.</li>
	<li>Scartare il surnatante versandolo rapidamente dopo la centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare nel terreno di crioconservazione a una densità di 2 × 106 cellule/mL e trasferire 1 mL di sospensione cellulare in fiale criogeniche da 1,2 mL.</li>
	<li>Collocare immediatamente le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento, congelarle a -80 °C durante la notte per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 °C/min, quindi trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>4. Scongelamento
<ol><li>Riscaldare il terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 °C e preriempire 10 mL di terreno di coltura preriscaldato in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Scongelare rapidamente le fiale criogeniche prelevate direttamente dal deposito di azoto liquido utilizzando un sistema di scongelamento automatizzato.</li>
	<li>Versare 0,5-1 mL di terreno di coltura preriscaldato nella fiala criogenica per garantire che le cellule congelate si adattino gradualmente al nuovo ambiente. Quindi, trasferire 1,5-2 mL di sospensione cellulare in 10 mL di terreno di coltura in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule a 250 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare il surnatante versandolo rapidamente dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 2 mL di terreno di coltura preriscaldato e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro per determinare i tassi di recupero e sopravvivenza utilizzando l'esclusione standard del blu di tripano (colorazione blu di tripano allo 0,4%).</li>
	<li>Coltura delle cellule su superfici rivestite di matrice di membrana basale a una densità di 105 cellule vitali/cm2 in un terreno di coltura integrato con Y-27632 (concentrazione finale: 10 μM). Rimuovere Y-27632 dopo 24 ore.</li>
	<li>Per determinare il tasso di attacco, dissociare nuovamente le cellule e contare il numero di cellule 24 ore dopo lo scongelamento.</li>
</ol>5. Convalida della fase di congelamento ottimale
<ol><li>Per convalidare la fase di congelamento ottimale determinata nella fase 2.4, scongelare le cellule RPE congelate in diversi punti temporali e coltivare per 28 giorni. Raccogliere le cellule per l'analisi qPCR e immunocolorazione per valutare l'espressione dei marcatori RPE come precedentemente descritto17.</li>
</ol>

Avanzamento della crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane

<ol><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).</li>
<li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthamology%22%5BJournal%5D)">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%3A+Development%2C+injury+responses%2C+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).</li>
<li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cell+transplantation%2C+biomaterials%2C+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li>
<li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li>
<li>Da Cruz,, L,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Li, Q. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).</li>
<li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li>
<li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems%3A+an+opinion+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+%28Neuro-2a%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).</li>
<li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).</li>
<li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off+the+shelf+cellular+therapeutics%3A+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%3A+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).</li>
<li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation%3A+a+focus+on+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Nel presente studio, viene descritto un protocollo di congelamento-scongelamento di successo per le cellule RPE derivate da hESC per la ricerca e le esigenze cliniche. A differenza della linea cellulare di RPE immortalizzata, ARPE-19, le cellule RPE con fenotipo epiteliale e funzione caratteristici adeguati, come le cellule RPE derivate da cellule staminali, sono più sensibili alla crioconservazione. Meno del 32% delle cellule è rimasto a 24 ore dopo lo scongelamento se non adeguatamente conservato17</s...

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato pigmentato di cellule necessario per mantenere la corretta funzione della retina1. La disfunzione e la morte dell'EPR sono strettamente associate a molte malattie degenerative della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la malattia di Stargardt 2,3. La terapia sostitutiva dell'EPR è uno dei regimi terapeutici più promettenti per queste malattie 4,5,6,7. Una fornitura stabile di cellule RPE del donatore è vitale per la terapia cellulare. Le cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) sono una fonte cellulare ideale per la terapia cellulare perché imitano la funzione delle cellule RPE primarie e possono produrre una fornitura teoricamente illimitata8. Tuttavia, il processo di differenziazione è laborioso e la durata di conservazione delle cellule RPE ottenute è relativamente breve a causa della successiva transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Pertanto, la crioconservazione delle cellule RPE derivate da hESC è un passaggio indispensabile per lo stoccaggio a lungo termine e la distribuzione su richiesta9.
Il danno cellulare indotto dalla crioconservazione può inavvertitamente compromettere l'efficacia terapeutica10,11. Pertanto, recenti studi sulla crioconservazione hanno proposto che le condizioni ottimali di conservazione criogenica dovrebbero essere determinate durante la progettazione di terapie cellulari12. Il successo della crioconservazione garantisce un recupero cellulare efficiente, un'elevata vitalità e il ripristino della funzione cellulare dopo il ciclo di congelamento-scongelamento. Tuttavia, studi precedenti sulla crioconservazione dei monostrati aderenti di cellule di mammifero hanno riportato tassi di sopravvivenza altamente variabili (35%-95%) dopo lo scongelamento 13,14,15. Molti fattori influenzano notevolmente i risultati della crioconservazione, in particolare durante la fase di congelamento16,17. Ricerche recenti hanno dimostrato che le cellule RPE congelate in diversi momenti hanno mostrato un recupero vario dopo lo scongelamento17. Per quanto ne sappiamo, mancano studi sulla determinazione della finestra temporale di congelamento ottimale per le cellule RPE derivate da cellule staminali. In diversi studi, le cellule sono state congelate in varie fasi: alcune cellule sono state congelate poco dopo il passaggio o prima della confluenza o della pigmentazione 8,15,18, mentre altre sono state congelate in altri punti temporali 9,19,20,21. Inoltre, non ci sono prove chiare del fatto che la fase o lo stadio delle cellule RPE utilizzate per la crioconservazione influenzi la funzione dell'RPE dopo lo scongelamento. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che la fase esponenziale della crescita cellulare (P2D5) è la fase migliore per la crioconservazione delle cellule RPE derivate da hESC in termini di vitalità cellulare e recupero delle proprietà e delle funzioni cellulari17.
Il metodo qui stabilito mira a crioconservare l'RPE derivato da hESC in una fase ottimale per ottenere la migliore conservazione in termini di vitalità e funzione cellulare dopo lo scongelamento. Utilizzando il saggio di marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) per rilevare la fase esponenziale della sintesi del DNA prima della crioconservazione, le cellule RPE scongelate hanno mostrato una vitalità e un tasso di attaccamento del >80%, espressione genica specifica per RPE, morfologia cellulare polarizzata, secrezione di fattori derivati dall'epitelio pigmentato, resistenza transepiteliale appropriata e capacità fagocitaria 8,17,22. Sebbene questo protocollo si concentri sulle cellule RPE derivate da hESC e non tutte le cellule terapeutiche siano crioconservate allo stesso modo, la strategia del congelamento nella fase esponenziale può essere applicata a molte altre cellule terapeutiche.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit di proliferazione cellulare per imaging, Alexa Fluor 488 Colorante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento criogenico</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Biolife Solutions</td><td>07930</td><td>terreno di crioconservazione #1</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Genxin</td><td>Selcell YB050050</td><td></td><td>terreno di crioconservazione #2</td></tr><tr><td>Cellule staminali embrionali umane</td><td>fornite da Wicell, USA</td><td>Linea</td><td></td>cellulare</tr><tr><td>H9 Matrigel, matrice qualificata hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice a membrana basale</td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di scongelamento cellulare ThawSTAR CFT2</td><td>BioLife Solutions</td><td>AST-601</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Soluzione blu 0,4%</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TryPLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>12563029 reagente di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>XVIVO-10 terreno Lonza</td><td></td><td>BEBP04-743Q</td><td>terreno di coltura RPE</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) sono fonti cellulari superiori per la terapia di sostituzione cellulare in individui con malattie degenerative della retina; Tuttavia, gli studi sulla conservazione stabile e sicura di queste cellule terapeutiche sono scarsi. La vitalità cellulare altamente variabile e il recupero funzionale delle cellule RPE dopo la crioconservazione sono i problemi più comunemente riscontrati. Nel presente protocollo, abbiamo mirato a ottenere il miglior tasso di recupero cellulare dopo lo scongelamento selezionando la fase cellulare ottimale per il congelamento in base alle condizioni sperimentali originali. Le cellule sono state congelate nella fase esponenziale determinata utilizzando il saggio di marcatura della 5-etinil-2'-deossiuridina, che ha migliorato la vitalità cellulare e il tasso di recupero dopo lo scongelamento. Cellule stabili e funzionali sono state ottenute poco dopo lo scongelamento, indipendentemente da un lungo processo di differenziazione. I metodi qui descritti consentono la conservazione e lo scongelamento semplici, efficienti ed economici delle cellule RPE derivate da hESC. Sebbene questo protocollo si concentri sulle cellule RPE, questa strategia di congelamento può essere applicata a molti altri tipi di cellule differenziate.

Qui, le cellule RPE derivate da hESC a P1D35 sono state fatte passare e seminate a una densità di 105/cm2. Entro una settimana dalla semina, la caratteristica morfologia esagonale e la pigmentazione sono andate perse durante la fase di ritardo (circa 2 giorni). Le cellule RPE hanno gradualmente riadottato la morfologia esagonale nella fase esponenziale (circa 5 giorni, Figura 1A) e sono entrate nella fase di decelerazione (circa 6 giorni) con una morfologia più poligona...

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'efficiente crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane.

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Il nostro laboratorio mira a comprendere meglio i meccanismi molecolari delle malattie retiniche, con particolare attenzione ai bisogni medici insoddisfatti dei pazienti. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare trattamenti efficaci, come le terapie a base di cellule staminali, per loro. La crioconservazione delle cellule RPE derivate da cellule staminali è un passo importante per la terapia sostitutiva dell'RPE.Attualmente, le cellule vengono congelate in varie fasi, con conseguenti tassi di sopravvivenza altamente variabili per lo scongelamento. Questo è necessario per determinare lo stadio cellulare ottimale per il congelamento di queste cellule. Il nostro protocollo fornisce un modo semplice, efficiente ed economico per congelare le cellule RPE determinando la fase esponenziale delle cellule RPE per il congelamento.È meno dipendente da metodi differenziati o linee cellulari.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Questo protocollo descrive come produrre cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) da cellule staminali pluripotenti. Il metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e di piccole molecole per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in RPE immaturi in quattordici giorni e RPE maturo, funzionale dopo tre mesi.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

La produzione di cellule specializzate della retina da cellule staminali pluripotenti è un punto di svolta nello sviluppo della terapia a base di cellule staminali per malattie retiniche. Il presente documento descrive un metodo semplice per una generazione efficiente dei organoids della retina e dell'epitelio pigmentato retinico per la ricerca di base, traslazionale e clinica.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Impara un protocollo di crioconservazione ottimale per cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane. Questo metodo migliora i tassi di sopravvivenza post-scongelamento per terapie retiniche.

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale (Video) | JoVE Journal

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Esplora altri video