Name: Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Scopri come valutare la tossicità del peptide β-amiloide in vivo utilizzando un modello transgenico di Caenorhabditis elegans con espressione inducibile a temperatura nel muscolo. Questo saggio rapido ed economico permette di testare farmaci e modifiche genetiche.

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Vorremmo ringraziare i membri attuali e precedenti del laboratorio link che ha contribuito a sviluppare i protocolli descritti qui, in particolare Gin Fonte, che ha sviluppato il procedimento originale. Questo lavoro è stato supportato da riconoscimenti dal NIH (AG12423) e l&#39;Alzheimer Association (Premio Zenith) alla Cdl

1) Preparazione dei nematodi media di crescita piastre per test paralisi. Saggi di paralisi vengono eseguite sullo standard nematode crescita Media (NGM) piastre solitamente usata per C. elegans propagazione e genetica (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave NGM la soluzione contenente NaCl, Agar e Peptone in una beuta e aggiungere la quantità appropriata di sterili CaCl 2, uracile, colesterolo, 1M MgSO 4 e 1M KPO 4. Aliquota 10 ml di liquido in NGM ogni mm 60 x 15 mm piastra di Petri. Lasciare NGM a solidificare notte a temperatura ambiente. </li><li> Se il test per gli effetti dei composti / estratti, aliquota dell'estratto su ogni piatto e utilizzare una spatola per distribuire uniformemente l'estratto sulla superficie della piastra. Lasciare che l'estratto secco di notte a temperatura ambiente. Volumi oltre 1 ml richiederà più tempo per asciugare. </li><li> Spot ogni piatto con 250 ml di E. coli ceppo OP5O cresciuto nel Media LB durante la notte per una densità ottica di 0,4-0,6. Permettono ai batteri di asciugare durante la notte a temperatura ambiente. </li></ol> Variabili rilevanti L'età delle lastre ha un effetto significativo sul saggio paralisi, come vecchi piatti tendono ad asciugarsi. Usare piatti versato entro una settimana saggio paralisi. Per un risultato ideale, versare piastre 3-4 giorni prima dell'inizio delle popolazioni verme sincrono [vedi (2) qui sotto]. Per ogni esperimento, utilizzare solo piatti versato dalla stessa partita. Alterare le dimensioni del prato (cioè macchiato vs diffusione) e / o il tipo di batteri anche alterare il comportamento del worm. Saggi di paralisi può essere effettuata con metodi alternativi E. coli come fonte di cibo (per esempio, l'HT115 ceppo usato per l'alimentazione degli esperimenti di RNAi), ma questo può cambiare la cinetica di paralisi, il che richiede adeguati controlli interni. 2) Preparazione di Age-sincrono popolazioni Worm Ceppo CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aβ ​​minigene + rol-6 (su1006) gene marcatore] X è più comunemente usato per il saggio Aβ indotta dalla paralisi Questo ceppo e altri modelli transgenici sono disponibili. ai ricercatori universitari per una tassa nominale dalla Genetica Caenorhabditis Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Per massimizzare la sincronia età della popolazione sottoposta a test è preferibile iniziare con una generazione sincronizzato dei genitori. Una settimana prima di iniziare l'analisi della paralisi della popolazione prova, utilizzare un selettore a vite senza fine di platino per trasferire 20-30 adulti gravido su 10 piatti diversi NGM centimetri diffuso con OP50 per un uovo 2 ora giaceva a 16 ° C (la temperatura permissiva per CL4176 ). Rimuovere gli adulti gravido e consentire la progenie di crescere per 7 giorni, quando ormai saranno "secondo giorno" adulti gravido. </li><li> (Giorno 1) Gli adulti secondo giorno gravido vengono utilizzati per preparare l'età sincrono popolazioni di prova. Per ogni condizione sperimentale, l'oggetto è quello di generare piastre triplice copia contenente 50-75 anni-sincrono vermi. Utilizzando un selettore verme platino, il trasferimento 10-12 del 2 adulti giorno gravido su 60 millimetri (10 ml) piastre NGM macchiato con OP50. Lasciare che il worm per deporre le uova a 16 ° C per 2 ore, poi prendere via gli adulti e consentire uova a schiudersi e crescere a 16 ° C. A questo punto è meglio avere qualcuno che non sarà segnare le targhe di codice loro, in modo che il marcatore sarà cieco alle condizioni sperimentali. </li></ol> Variabili rilevanti La fase di sviluppo embrionale, quando uova vengono deposte (~ i 26-cell stadio per i vermi wild-type in condizioni ottimali) è una funzione dell'età adulta e della nutrizione. Se gli adulti gravido utilizzati per la preparazione della popolazione di età superiore o test sono affamati, uova fase successiva saranno stabilite, riducendo la sincronia età della popolazione e la riproducibilità della cinetica paralisi. E 'essenziale che mono-axenic (cioè, solo OP50 batteri) le culture sono utilizzati (contaminanti microbici può seriamente influire su questo test), e la riproducibilità è più alta se le piastre tre esemplari hanno un numero simile di vermi. 3) Transgene induzione e analisi Paralisi <ol><li> (Giorno 3) piastre cambio marce alte a 25 ° C 48 ore dopo la fine dell 'uovo sincrono laici; worm dovrebbe essere al terzo stadio larvale (L3). Piastre devono essere disposte senza accatastamento in un incubatore a 25 ° C per consentire tutte le lastre di raggiungere 25 ° C, allo stesso tempo. </li><li> (Giorno 4) Iniziare segnando la paralisi di vermi (ceppo CL4176) a 18-20 ore dopo l'inizio del cambio marcia. A questo punto, tutti i vermi nella popolazione dovrebbe avere raggiunto la larvale quarto (L4) stadio. Continuare ad ottenere in due ore con incrementi fino a che tutti i vermi su ciascuno dei piatti sono paralizzati. Per ragioni sconosciute, la paralisi non è nemmeno tutta la lunghezza del corpo: la regione della testa è l'ultima parte del worm di cessare in movimento. Così, wORM che hanno recentemente avviato la paralisi non può tradurre in tutto il piatto, ma può muovere la testa, aprendo i batteri intorno al loro anteriore e lasciando un "alone" di batteri cancellata. Questi worm inevitabilmente diventerà completamente paralizzato, e quindi worm con aloni sono classificati come paralizzati. Alcuni worm non avrà aloni, ma non anche mostrare movimento spontaneo: queste sono testati da incitando con il selettore worm. Se un worm pungolati non può subire una completa propagazione delle onde su sollecitazione del corpo, è anche notato come paralizzato. Per il punteggio efficiente, è più facile spostare il worm paralizzato per un settore senza macchia del piatto in modo che non sarà involontariamente rescored del prossimo periodo di punteggio. (Questo permette anche mis-classificati worm per dimostrare il movimento, consentendo una correzione di punteggio). </li><li> Per generare una curva di paralisi, in ogni fase la frazione di vermi su ogni piatto che non sono stati paralizzati viene convertito in una percentuale, e la media percentuale "unparalyzed" è rilevata in tempo di iniziazione salire di marcia. (Il razionale per la stampa in questo modo è che la curva risultante è formalmente analoga a una curva di sopravvivenza, e quindi possono essere analizzati utilizzando le normali non parametrica statistiche di sopravvivenza.) </li></ol> Variabili rilevanti Il cambio marcia di vermi myo-3/Aβ transgeniche deve avvenire prima che raggiungano la metà L4 fase di paralisi, che sarà avviata, in quanto il promotore myo-3 sia maturo e regolata, e ha notevolmente ridotto espressione in L4 in ritardo o vermi adulti. Allo stesso modo, l'espressione di questo transgene è bloccato se i vermi diventano affamati, quindi è essenziale che i vermi sono ben nutriti per tutto l'esperimento. Non abbiamo mai osservato un worm paralizzato per recuperare in qualsiasi condizione, e dopo 12-16 ore di salire di marcia, tutti CL4176 vermi paralizzare, anche se sono downshifted a 16 ° C. Nel ceppo CL4176, sovraregolazione sufficiente di espressione del transgene a causare paralisi può avvenire a temperature più basse (ad esempio, 20-25 ° C), anche se i tempi di paralisi sarà alterato. Il tasso di paralisi dipende dal ceppo specifico transgenici utilizzati (che abbiamo costruito ceppi myo-3/Aβ sia con i tassi più veloce e più lento rispetto CL4176), quindi con ceppi alternativa alla finestra di punteggio potrebbe essere necessario un aggiustamento. 4) Rappresentante Risultati Mostrato nella Figura 1 è un grafico di una curva di paralisi per CL4176, sia non trattati ed esposti a 6,27 mM caffeina (concentrazione finale in lamiera NGM). Il risultato è un trattamento in un ritardo statisticamente molto significativo nella paralisi di circa 4 ore, che noi interpretiamo come indicativi di soppressione di tossicità Aβ in questo modello. Mostrato nella Figura 2 è un esperimento indipendente saggiare gli effetti di Cafestol, un altro composto trovato nel caffè. Questo grafico è tipico per i trattamenti che non hanno impatto sulla tossicità Aβ. Si noti che in entrambi gli esperimenti circa la metà della popolazione non trattata CL4176 sono paralizzati a 24 ore, e la paralisi è completa di 28 ore. Questi sono tempi tipici per la paralisi del controllo CL4176 popolazioni. Deviazioni significative da questo momento sono indicativi di mutate condizioni ambientali o l'eliminazione spontanea di copie del transgene. (CL4176 contiene un cromosomicamente integrato serie transgenici con più copie del transgene myo-3/Aβ. Sebbene questo array transgenico è normalmente abbastanza stabile, la diffusione del ceppo a temperature&gt; 16 ° C selezionerà per i vermi rari che hanno subito un l'eliminazione spontanea di transgeni, con conseguente varianti che hanno ridotto l'espressione Aβ e dei risultati paralisi più lento.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva paralisi dei ceppi CL4176 vermi non trattati o esposti a 6,27 caffeina mM (Sigma). I tempi indicati sono da inizio del cambio marcia temperatura. Barre di errore = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curva di paralisi per CL4176 vermi esposti a 0,48 mM Cafestol (Sigma). Barre di errore = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo che abbiamo descritto può essere efficacemente utilizzato per test gli effetti dei composti sulla tossicità Aβ. Esempi pubblicati includono gli effetti costituenti dell&#39;estratto di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Composti che sono stati protettivo contro la tossicità Aβ in altri sistemi hanno anche dimostrato di essere protettivo in questo modello (ad esempio, la memantina, i nostri risultati non pubblicati). Una logica importante per stabilire questo modello è che gli strumenti genetici e molecolari ben sviluppato in C. elegans può essere usato per indagare i meccanismi di tossicità Aβ. Quindi, le mutazioni effetti specifici sulla tossicità Aβ può essere analizzati (ad esempio, l&#39;effetto di ridurre insulino-simile di segnalazione introducendo un daf-2 perdita di funzione di mutazione, Florez-McClure et al. 2007), e questo modello può anche essere usato per esaminare gli effetti di sovra-espressione transgeni (Fonte et al. 2008). Di recente abbiamo fatto ampio uso di questo modello per esaminare gli effetti sulla tossicità di singole sostituzioni aminoacidiche nella Aβ (dati non pubblicati). Il modello transgenico qui descritto analisi l&#39;effetto di acuta espressione Aβ sulla funzione delle cellule muscolari. Al tempo delle cellule muscolari e paralisi loro sarcomero sono intatte, il fenotipo paralisi non è il risultato della morte delle cellule muscolari. Tuttavia, dopo la paralisi (~ 48 ore dopo il cambio marcia iniziale) vi è una ripartizione di integrità muscolare e la morte dei vermi. Non abbiamo studiato questo effetto a valle di espressione Aβ o utilizzati come marker di tossicità. La Aβ modello inducibile espressione qui descritto non è appropriato per indagare trattamenti che modulano β-amiloide formazione di per sé. Anche se i vermi transgenici con la forma costitutiva espressione Aβ depositi di amiloide facilmente rilevabili (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), vermi transgenici con espressione inducibile Aβ raramente hanno depositi di amiloide e il fenotipo paralisi appare indipendente dalla deposizione di amiloide (Drake et al. 2003). I nostri risultati sono coerenti con la visione che la tossicità acuta dei risultati indotta da Aβ espressione l&#39;accumulo di Aβ solubile oligomerici, non deposizione di amiloide.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Quantity/2L </td><td> Azienda / Catalogo # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 2mg/ml in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Colesterolo </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 5mg/ml in etanolo (non in autoclave) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL in DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in DDH 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici c. elegans modello

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulo del peptide β-amiloide (Aβ) è generalmente ritenuto centrale per l&#39;induzione della malattia di Alzheimer, ma il meccanismo in questione (s) di tossicità sono ancora poco chiari. Aβ è depositato per via intramuscolare nella miosite inclusione dell&#39;organo, un grave miopatia umano. Il intensamente studiato verme nematode Caenorhabditis elegans può essere transgenically progettato per esprimere Aβ umano. A seconda del tessuto o la tempistica di espressione Aβ, vermi transgenici possono avere fenotipi facilmente misurabili che servono come lettura di tossicità Aβ. Per esempio, vermi transgenici con pan-neuronale espressione Aβ avere difetti è l&#39;apprendimento associativo (Dosanjh et al 2009.), Mentre i vermi transgenici con costitutiva muscolo-specifica espressione mostrano un progressivo, età-dipendente fenotipo paralisi (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particolarmente utile C. elegans modello si avvale di un sensibile alla temperatura mutazione del sistema di sorveglianza di mRNA ingegnere temperatura-inducibile espressione muscolare di un transgene Aβ, con conseguente paralisi fenotipo riproducibile su cambio marcia temperatura (Link et al. 2003). Trattamenti che contrastare la tossicità Aβ in questo modello [per esempio, espressione di un transgene di protezione (Hassan et al. 2009) o l&#39;esposizione a estratti di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] riproducibile alterare il tasso di paralisi indotta dalla temperatura salire di marcia di questi transgenici vermi. Qui si descrive il nostro protocollo per misurare il tasso di paralisi in questo C. transgenico elegans modello, con particolare attenzione alle variabili sperimentali che possono influenzare questa misura.

Il verme nematode intensamente studiato<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Può essere transgenically progettato per esprimere l&#39;umano peptide β-amiloide (Aβ). Espressione indotta di Aβ in<em&gt; C. elegans</emMuscolare&gt; porta ad un rapido, fenotipo paralisi riproducibile che può essere utilizzato per monitorare i trattamenti che modulano la tossicità Aβ.

Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

Si ritiene generalmente che l'accumulo del peptide $\beta$-amiloide (A$\beta$) sia centrale nell'induzione della malattia di Alzheimer, ma i meccanismi rilevanti...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la tossicità del peptide beta amiloide in un sistema modello InVivo. La riproducibilità e la relativa semplicità di questo saggio consentono un rapido test di farmaci, condizioni ambientali o modifiche genetiche sulla tossicità del peptide beta amiloide. Un fattore chiave nello sviluppo di questo saggio è la generazione di vermi transgenici di cl egan's con espressione muscolo-specifica indotta termicamente del peptide beta amiloide.Questa espressione sensibile alla temperatura è ottenuta ingegnerizzando un transgene che contiene una regione non tradotta tre primica insolitamente lunga, rendendo l'mRNA del transgene un bersaglio del sistema di sorveglianza dell'mRNA. L'espressione di questo transgene è pertanto scarsa nei vermi di tipo selvaggio dotati di un sistema di sorveglianza dell'mRNA funzionante, a causa della degradazione dell'mRNA del transgene. Se questo transgene viene introdotto in un contesto genetico che presenta una mutazione in un componente essenziale del sistema di sorveglianza dell'mRNA, l'espressione del transgene sarà significativamente più elevata. Se il contesto genetico presenta una mutazione sensibile alla temperatura nel sistema di sorveglianza dell'mRNA, allora la propagazione di questa linea transgenica alla temperatura non permissiva bloccherà la degradazione dell'mRNA del transgene e porterà a un'elevata espressione del transgene. I vermi transgenici che utilizzano questo sistema per regolare l'espressione del peptide beta-amiloide nei muscoli della parete corporea mostrano, con un aumento della temperatura da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, un elevato accumulo del peptide beta-amiloide, disfunzione delle cellule muscolari e paralisi dei vermi. La misurazione del tempo impiegato per questi effetti è utilizzata come indicatore.È necessaria una popolazione di questi vermi trenchgeni per osservare la paralisi dopo l'aumento della temperatura. Il test di paralisi costituisce un saggio sensibile della tossicità del beta amiloide. Questo risultato si ottiene preparando piastre fresche di terreno di crescita per nematodi per il saggio di paralisi, il che contribuisce a minimizzare le variabili ambientali che potrebbero influenzare i tassi di paralisi.Come secondo passaggio, vengono avviate popolazioni di vermi transgenici sincronizzati per età, minimizzando così gli effetti dello stadio di sviluppo sull'espressione del transgene. Successivamente, i vermi sincronizzati allo stadio larvale L3 vengono trasferiti da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, aumentando la stabilità dell'mRNA del transgene e inducendo l'accumulo del peptide beta amiloide. La misurazione del tempo trascorso dal trasferimento all'insorgenza della paralisi per ciascun verme consente di valutare la velocità di disfunzione muscolare, permettendo così di analizzare gli effetti tossici derivanti dall'accumulo del peptide beta amiloide; i risultati ottenuti mostrano l'effetto di trattamenti specifici sulla tossicità del peptide beta amiloide espresso endogenamente.Il principale vantaggio della nostra tecnica, rispetto all'uso di modelli di topo transgenici per saggiare l'attività di un farmaco, è che possiamo eseguirla molto più rapidamente e a un costo notevolmente inferiore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. L'assegnazione del punteggio ai vermi L4 in un saggio di paralisi è molto difficile da apprendere.Pertanto, quando si valuta un verme paralizzato di L4, ciò su cui ci si deve concentrare è il movimento isolato a cerchio della regione cefalica del verme. Una volta che questa parte si muove e l'intero corpo del verme è paralizzato, si considera il verme come paralizzato. I saggi di paralisi vengono eseguiti su piastre contenenti terreno di crescita nematodico standard, o NGM, comunemente utilizzato per la propagazione e la genetica di C. elegans.Per preparare le piastre da autoclavare, sterilizzare in autoclave la soluzione NGM contenente cloruro di sodio, agar e peptone in un matraccio erlenmeyer, quindi aggiungere le quantità appropriate delle seguenti soluzioni sterili, disponibili nel protocollo scritto allegato. Aliquotare 10 millilitri di NGM liquido in ciascuna piastra di Petri di 60 millimetri per 15 millimetri. Lasciare solidificare il NGM durante la notte a temperatura ambiente.Se si esegue il test sugli effetti di composti o estratti, aliquotare l'estratto su ciascuna piastra e utilizzare un'apposita spatola per distribuirlo uniformemente sulla superficie della piastra. Lasciare asciugare le piastre tutta la notte a temperatura ambiente. Volumi superiori a un millilitro richiederanno più tempo per l'essiccazione.Successivamente, aggiungere su ciascuna piastra 250 microlitri di ceppo di e coli OP 50 coltivato in brodo LB per tutta la notte fino a una densità ottica compresa tra 0,4 e 0,6; lasciare asciugare le piastre tutta la notte a temperatura ambiente. L'età della piastra influisce in modo significativo sulla percentuale di paralisi, e in particolare le piastre più vecchie tendono a seccarsi. Le piastre devono essere preparate entro una settimana dall'esecuzione del saggio di paralisi.È preferibile utilizzare piastre preparate da tre a quattro giorni prima; tutte le piastre con uova sincrone utilizzate in un esperimento devono provenire dallo stesso lotto. Modificare le dimensioni del prato batterico e/o il tipo di batteri può alterare il comportamento dei vermi. I saggi di paralisi possono essere eseguiti utilizzando ceppi alternativi di e coli. Ad esempio, HT one 15 viene utilizzato negli esperimenti di RNAi. Tuttavia, ciò potrebbe modificare la cinetica del saggio di paralisi.Pertanto, è necessario utilizzare controlli interni appropriati al ceppo. Il ceppo CL 476 è il più comunemente usato per il saggio della paralisi indotta da beta. Questo ceppo e altri modelli transgenici sono disponibili per i ricercatori accademici a un costo simbolico presso il Saint Ahadi Genetic Center.Per massimizzare la sincronia d'età della popolazione in esame, è preferibile iniziare con una generazione parentale sincronizzata. Una settimana prima di avviare il saggio di paralisi della popolazione in esame, utilizzare un trasferitore di worm in platino per trasferire da 20 a 30 adulti gravidi su diverse piastre NGM da 10 centimetri.Spargere con OP 50 e far deporre le uova per due ore a 16 gradi Celsius, che è la temperatura permissiva per CL 4 1 76. Rimuovere gli adulti GR e lasciare che la prole si sviluppi per sette giorni, al termine dei quali raggiungerà lo stadio di adulti gravidi di secondo giorno. Adulti gravidi di secondo giorno.Gli adulti vengono utilizzati per preparare popolazioni di prova di età sincronizzata per ciascuna condizione sperimentale. L'obiettivo è generare piastre in triplice replicato contenenti da 50 a 75 vermi di età sincronizzata utilizzando un trasferitore di vermi in platino. Trasferire da 10 a 12 adulti gravidi del giorno su piastre NGM da 60 millimetri inoculate con OP50. Lasciare che i vermi depongano le uova a 16 gradi Celsius per due ore, quindi rimuovere gli adulti e lasciare che le uova si schiudano e si sviluppino a 16 gradi Celsius.A questo punto, è preferibile che qualcuno che non valuterà le piastre provveda a codificarle, in modo che la valutazione avvenga in cieco rispetto alle condizioni sperimentali. Lo stadio di sviluppo embrionale al momento della deposizione delle uova, che corrisponde approssimativamente allo stadio di 26 cellule per vermi di tipo selvatico in condizioni ottimali, dipende dall'età e dalla nutrizione degli adulti. Se gli adulti utilizzati per la deposizione delle uova sono più anziani o sono stati sottoposti a digiuno, verranno deposte uova in stadi più avanzati e non si otterrà una popolazione sincrona, compromettendo così la cinetica del saggio di paralisi.È essenziale utilizzare colture batteriche monogeniche come e coli, OP 50, poiché qualsiasi contaminazione batterica può compromettere gravemente questo saggio. La riproducibilità è massima se le piastre in triplicato presentano un numero simile di vermi per indurre il transgene ed eseguire il saggio di paralisi. Portare le piastre a 25 gradi Celsius.48 ore dopo la fine della deposizione sincronizzata delle uova, i vermi dovrebbero trovarsi allo stadio larvale L3. Le piastre devono essere disposte senza essere impilate in un incubatore a 25 gradi Celsius, in modo che raggiungano questa temperatura. Allo stesso tempo, iniziare a valutare la paralisi dei vermi da 18 a 20 ore dopo l'inizio dell'aumento della temperatura.A questo punto, tutti i vermi della popolazione dovrebbero aver raggiunto lo stadio larvale quattro; continuare a valutare ogni due ore fino a quando tutti i vermi su ciascuna piastra non risultano paralizzati. Per motivi sconosciuti, la paralisi non si distribuisce in modo uniforme lungo la lunghezza del corpo. La regione cefalica è l'ultima parte del verme a cessare i movimenti.Pertanto, i vermi che hanno recentemente iniziato la paralisi non possono spostarsi attraverso la piastra, ma possono muovere la testa, rimuovendo così i batteri intorno alla loro estremit&agrave; anteriore e lasciando un alone di batteri eliminati. Questi vermi diventeranno invariabilmente completamente paralizzati e, di conseguenza, i vermi con aloni vengono classificati come paralizzati. Alcuni vermi non presenteranno aloni, ma non mostreranno neppure movimenti spontanei.Questi vengono testati pungendoli con il worm picker. Se un verme pungendo non è in grado di effettuare la propagazione dell'onda corporea completa, viene anch'esso considerato paralizzato ai fini di una valutazione efficiente. È più semplice spostare i vermi paralizzati in un settore della piastra senza spot, in modo che non vengano rivalutati accidentalmente nel successivo periodo di valutazione.Questo consente anche ai vermi classificati erroneamente di mostrare movimento, permettendo una correzione nel punteggio per generare una curva di paralisi. A ogni punto temporale, la frazione di vermi su ciascuna piastra che non sono ancora paralizzati viene convertita in una percentuale, e la percentuale media non paralizzata viene riportata in funzione del tempo trascorso dall'inizio dell'upshift. La curva risultante è formalmente analoga a una curva di sopravvivenza e può quindi essere analizzata utilizzando statistiche standard non parametriche per la sopravvivenza.L'upshift dei vermi transgenici myo three A beta deve essere eseguito entro la fase L4 intermedia affinché venga avviata la paralisi. Il promotore Myo three è regolato nello sviluppo. Una volta che i vermi hanno raggiunto la fase L4 tardiva o l'età adulta, il livello di espressione è notevolmente diminuito.L'espressione del transgene è bloccata se i vermi vengono privati del cibo, quindi è molto essenziale che i vermi siano ben nutriti per tutta la durata dell'esperimento. Non abbiamo mai osservato un verme paralizzato riprendersi in alcuna condizione. Dopo 12-16 ore di aumento della temperatura, CL 41 76 diventerà paralizzato, indipendentemente dal fatto che lo si riporti a 16 gradi; nella ceppa CL 41 76, l'upregolazione dell'espressione del transgene che causa la paralisi può verificarsi anche a temperature più basse.Tuttavia, si noti che la velocità di paralisi sarà influenzata nei suoi tempi. La velocità di paralisi dipende dalla specifica linea transgenica utilizzata. Abbiamo costruito tre ceppi di myo con A beta che presentano una velocità di paralisi rispettivamente più rapida e più lenta rispetto al CL4176, e pertanto è necessario regolare la finestra temporale di valutazione per il saggio di paralisi di conseguenza.Qui è mostrato un grafico della curva di paralisi per CL 4 1 76, sia non trattato che esposto a caffeina 6,27 millimolare. Questo trattamento determina un ritardo altamente significativo dal punto di vista statistico nella paralisi di circa quattro ore, che interpretiamo come indicativo di una soppressione della tossicità beta. In questo modello, questo esperimento ha analizzato gli effetti di un altro composto presente nel caffè.Il grafico è tipico per trattamenti che non influenzano la tossicità beta. Si noti che in entrambi gli esperimenti, circa la metà delle popolazioni di CL 4 1 76 non trattate sono paralizzate a 24 ore e la paralisi è completa entro 28 ore. Questi sono intervalli temporali tipici per la paralisi del controllo.Popolazioni CL 4 1 7 6: deviazioni significative da questi tempi indicano condizioni ambientali alterate o delezione spontanea di copie del transgene. Consultare il protocollo allegato per ulteriori informazioni sul ceppo CL 4 1 76. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante tenere presente l'età delle piastre, lo stadio della popolazione di vermi e la capacità di valutare la percentuale di paralisi dei vermi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea di come utilizzare questo sistema con l'alghe marine per saggiaire con attenzione la tossicità del beta amiloide. Si dovrebbe essere in grado di rilevare effetti piuttosto sottili su questa tossicità causati da diverse condizioni ambientali o trattamenti farmacologici. Le variabili di cui abbiamo parlato sono importanti da considerare perché permetteranno di eseguire il saggio in modo molto riproducibile e con una cinetica di paralisi costante.Questo è effettivamente molto importante se si desidera confrontare i risultati ottenuti nel proprio laboratorio in momenti diversi da persone diverse, oppure confrontare i propri risultati con quelli di altri ricercatori che utilizzano questo sistema modello.

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