Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare la tossicità del peptide beta amiloide in un sistema modello InVivo. La riproducibilità e la relativa semplicità di questo test consentono di testare rapidamente i farmaci, le condizioni ambientali o le modificazioni genetiche sulla tossicità dell'amiloide-beta. Un fattore chiave nello sviluppo di questo test è la generazione di vermi transgenici di cl egan con espressione inducibile dalla temperatura muscolo-specifica del peptide beta amiloide.

Questa espressione sensibile alla temperatura è ingegnerizzata costruendo un transgene che contiene una regione non tradotta anormalmente lunga di tre prime che rende l'mRNA del transgene un bersaglio della sorveglianza dell'mRNA L'espressione di questo transgene è quindi scarsa nei vermi wild type con un sistema di sorveglianza dell'mRNA funzionale a causa della degradazione dell'mRNA del transgene. Se questo transgene viene introdotto in un background genetico che contiene una mutazione in un componente essenziale del sistema di sorveglianza dell'mRNA, l'espressione del transgene sarà significativamente più alta. Se il background genetico contiene una mutazione sensibile alla temperatura nel sistema di sorveglianza dell'mRNA, allora la propagazione di questo ceppo trenchgenic alla temperatura non permissiva bloccherà la degradazione dell'mRNA del gene trench e provocherà un'elevata espressione genica trench vermi trenchgenic che impiegano questo sistema per regolare l'espressione muscolare della parete corporea dell'aumento della temperatura del peptide beta amiloide da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, Provoca un elevato accumulo del peptide beta amiloide, disfunzione delle cellule muscolari e paralisi dei vermi, misurazione del tempo.

Ci vuole una popolazione di questi vermi trenchgenic per rimanere paralizzati dopo la temperatura. Upshift è un test sensibile per la tossicità dell'amiloide-beta. Ciò si ottiene realizzando nuove piastre per terreni di crescita di nematodi per il test di paralisi, che aiuta a ridurre al minimo le variabili ambientali che possono influenzare i tassi di paralisi.

Come secondo passo, le popolazioni sincronizzate per età di vermi trenchgenic o iniziati, questo riduce al minimo gli effetti della fase di sviluppo sull'espressione transgenica. Successivamente, quelli sincronizzati del terzo stadio larvale passano da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, aumentando la stabilità dell'mRNA del transgene e portando all'accumulo del peptide beta amiloide. Misurando il tempo che intercorre tra il passaggio verso l'alto e la paralisi per ciascun verme, si acquisisce il tasso di disfunzione muscolare, valutando così gli effetti tossici dell'accumulo di peptidi beta amiloidi, si ottengono risultati che mostrano l'effetto di trattamenti specifici sulla tossicità del peptide beta amiloide espresso endogenamente.

Quindi il vantaggio principale della nostra tecnica, rispetto all'utilizzo di modelli murini transgenici per valutare l'attività dei farmaci, è che possiamo fare il nostro molto più rapidamente e molto meno costoso. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Il punteggio di L quattro vermi in un test di paralisi è molto difficile da imparare.

Quindi, quando si segna un verme L 4 paralizzato, quello che si vuole osservare è il movimento isolato dell'alone della regione della testa del verme. Una volta che si muove e l'intero corpo del verme è paralizzato, lo considereremmo paralizzato. I saggi di paralisi vengono eseguiti su piastre di terreni di crescita standard per nematodi o NGM utilizzati abitualmente per la propagazione e la genetica di CL egan.

Per preparare le piastre in autoclave, la soluzione NGM contenente cloruro di sodio, agar e peptide in un pallone di erlenmeyer, quindi aggiungere le quantità appropriate delle seguenti soluzioni sterili che possono essere trovate nel protocollo scritto allegato. Aliquotare 10 millilitri di NGM liquido in ogni piastra di Petri da 60 millimetri per 15 millimetri. Lasciare solidificare l'NGM per una notte a temperatura ambiente.

Se si esegue il test per gli effetti di composti o estratti, aliquotare l'estratto su ciascuna piastra e utilizzare uno spandiconcime per distribuirlo uniformemente sulla superficie della piastra. Lasciare asciugare i piatti per una notte a temperatura ambiente. I volumi superiori a un millilitro richiederanno più tempo per asciugarsi.

Successivamente, individua ogni piastra con 250 microlitri di ceppo di e coli OP 50 coltivato in terreno LB durante la notte a una densità ottica da 0,4 a 0,6, lascia asciugare i batteri durante la notte a temperatura ambiente. L'età della placca ha un effetto significativo sul tasso di paralisi e, come tale, le placche più vecchie tendono a seccarsi. Le piastre devono essere versate entro una settimana dal test di paralisi.

Idealmente, si desidera utilizzare piastre che sono state versate tre o quattro giorni prima della deposizione delle uova sincrone, le piastre utilizzate in qualsiasi esperimento dovrebbero provenire tutte dallo stesso lotto, alterando le dimensioni del prato e/o i batteri altereranno anche il comportamento dei vermi. Ad esempio, HT one 15 viene utilizzato negli esperimenti RNAi. Tuttavia, questo può modificare la cinetica del test di paralisi.

Pertanto, è necessario utilizzare controlli interni che siano appropriati per il ceppo. CL 476 è più comunemente usato per il dosaggio di una paralisi beta indotta. Questo ceppo e altri modelli transgenici sono disponibili per i ricercatori accademici a un costo nominale dal Saint Ahadi Genetic Center.

Per massimizzare la sincronia per età della popolazione di test, è preferibile. Inizia con una generazione parentale sincronizzata. Una settimana prima di iniziare il test di paralisi della popolazione di prova, utilizzare un raccoglitore di vermi di platino per trasferire da 20 a 30 adulti gravi su diverse piastre NGM da 10 centimetri.

Spalmare con OP 50 per due ore deporre le uova a 16 gradi Celsius, che è la temperatura permissiva per CL 4 1 76. Rimuovi gli adulti GR e lascia che la progenie cresca per sette giorni, momento in cui saranno adulti gravi del secondo giorno. Secondo giorno gravità.

Gli adulti vengono utilizzati per preparare le popolazioni di test sincrone per età per ciascuna condizione sperimentale. L'obiettivo è quello di generare piastre triplicate contenenti vermi sincroni di età compresa tra 50 e 75 anni utilizzando un raccoglitore di vermi di platino Trasferisci da 10 a 12 al giorno, due adulti più gravi su piastre NGM da 60 millimetri macchiate con OP 50. Lascia che i vermi depongano le uova a 16 gradi Celsius per due ore, quindi raccogli gli adulti e lascia che le uova si schiudano e crescano a 16 gradi Celsius.

A questo punto, è meglio avere qualcuno che non valuterà le targhe per codificarle in modo che il punteggio sia cieco alle condizioni sperimentali. Lo stadio di sviluppo embrionale in cui vengono deposte le uova, che è approssimativamente lo stadio di 26 cellule per i vermi selvatici in condizioni ottimali, è una funzione dell'età adulta e della nutrizione. Se gli adulti gravitazionali utilizzati per la deposizione delle uova sono più vecchi o affamati, verranno deposte uova in fasi successive e la popolazione sincrona non sarà raggiunta, influenzando così la cinetica del test di paralisi.

È essenziale utilizzare colture batteriche monogeniche come l'e coli, OP 50 perché la contaminazione batterica di qualsiasi tipo può influire gravemente su questo test. La riproducibilità è massima se le piastre triplicate hanno un numero simile di vermi per indurre il transgene ed eseguire il test di paralisi. Sali di marcia a 25 gradi Celsius.

48 ore dopo la fine dell'uovo sincrono, il verme depone dovrebbe essere al terzo stadio larvale. Le piastre devono essere disposte senza impilarle in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per consentire alle piastre di raggiungere questa temperatura. Allo stesso tempo, inizia a valutare la paralisi dei vermi da 18 a 20 ore dopo l'inizio del passaggio verso l'alto.

A questo punto, tutti i vermi della popolazione dovrebbero aver raggiunto il quarto stadio larvale, continuare a segnare con incrementi di due ore fino a quando tutti i vermi su ciascuna delle piastre sono paralizzati. Per ragioni sconosciute, la paralisi non è uniforme su tutta la lunghezza del corpo. La regione della testa è l'ultima parte del verme a smettere di muoversi.

Pertanto, i vermi che hanno recentemente iniziato la paralisi non possono traslare attraverso la placca, ma possono muovere la testa, eliminando così i batteri intorno alla parte anteriore e lasciando un alone di batteri eliminati. Questi vermi diventano invariabilmente completamente paralizzati e quindi i vermi con aloni sono caratterizzati come paralizzati. Alcuni vermi non avranno aloni, ma non mostreranno nemmeno movimenti spontanei.

Questi vengono testati pungolandoli con il raccoglitore di viti senza fine. Se un verme pungolato non può subire la propagazione delle onde di tutto il corpo dopo l'incitamento, viene anche classificato come paralizzato per un punteggio efficiente. È più facile spostare i vermi paralizzati in un settore non macchiato del piatto in modo che non vengano involontariamente risegnati nel periodo di punteggio successivo.

Ciò consente anche ai vermi categorizzati in modo errato di dimostrare il movimento, consentendo una correzione del punteggio per generare una curva di paralisi. In ogni momento, la frazione di vermi su ciascuna piastra che non sono stati paralizzati viene convertita in percentuale e la percentuale media senza precedenti viene tracciata rispetto al tempo dal momento in cui è stato avviato lo spostamento verso l'alto. La curva risultante è formalmente analoga a una curva di sopravvivenza e quindi può essere analizzata utilizzando statistiche di sopravvivenza standard non parametriche.

Il passaggio verso l'alto dei vermi transgenici myo three A beta deve essere eseguito entro la metà del quarto stadio L affinché la paralisi possa iniziare. Il promotore Myo three è regolato dallo sviluppo. Una volta che i vermi hanno raggiunto la tarda età adulta, il livello di espressione è diminuito in modo significativo.

L'espressione del transgene viene bloccata se i vermi sono affamati, quindi è molto essenziale che i vermi siano ben nutriti durante l'esperimento. Non abbiamo mai osservato un verme paralizzato riprendersi in nessuna condizione. Dopo 12-16 ore di upshift, CL 41 76 si paralizza, indipendentemente dal fatto che lo si scarichi a 16 gradi di deformazione, l'upregulation CL 41 76 dell'espressione del transgene che causa la paralisi può verificarsi a temperature più basse.

Tuttavia, si prega di notare che il tasso di paralisi sarà influenzato nella sua tempistica. Il tasso di paralisi dipende dallo specifico ceppo transgenico utilizzato. Abbiamo costruito tre ceppi beta A che hanno un tasso di paralisi più veloce e più lento rispetto al CL 41 76 e, pertanto, è necessario regolare di conseguenza la finestra di punteggio per il test di paralisi.

Qui viene mostrato un grafico di una curva di paralisi per CL 4 1 76, sia non trattata che esposta a 6,27 millimolari di caffeina. Questo trattamento si traduce in un ritardo statisticamente significativo nella paralisi di circa quattro ore, che interpretiamo come indicativo della soppressione di una tossicità beta. In questo modello, questo esperimento ha analizzato gli effetti di un altro composto presente nel caffè.

Il grafico è tipico per i trattamenti che non influiscono sulla tossicità beta. Si noti che in entrambi gli esperimenti, circa la metà delle popolazioni di CL 4 1 76 non trattate sono paralizzate a 24 ore e la paralisi è completa a 28 ore. Questi sono i tempi tipici per la paralisi del controllo.

CL 4 1 7 6 popolazioni deviazioni significative da questa tempistica sono indicative di condizioni ambientali alterate o di delezione spontanea di copie transgeniche. Per ulteriori informazioni sul ceppo CL 4 1 76, consultare il protocollo allegato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere a mente l'età delle piastre, lo stadio della popolazione di vermi e la capacità di valutare il tasso di paralisi dei vermi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come utilizzare questo sistema di elgan marino per valutare attentamente la tossicità dell'amiloide-beta. Dovresti essere in grado di rilevare effetti piuttosto sottili su questa tossicità di una varietà di trattamenti ambientali o farmacologici. Le variabili di cui abbiamo parlato sono importanti da prestare attenzione perché ciò consentirà di eseguire il test in modo molto riproducibile e con una cinetica di paralisi costante.

Questo è in realtà molto importante se si desidera confrontare i risultati ottenuti in laboratorio in momenti diversi da persone diverse, o se si confrontano i risultati con quelli di altri ricercatori che utilizzano questo sistema di modelli.