Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans
September 7th, 2021
Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.
L'uso dell'espressione tessuto-specifica di reporter fluorescente poliglutamina in C.elegans è significativo perché consente la scoperta e la caratterizzazione di regolatori di proteostasi nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione e la quantificazione del declino associato all'età della proteostasi cellulare in vivo, che è essenziale per ottenere una visione meccanicistica più profonda di come gli organismi mantengono il corretto ripiegamento e la funzione del proteoma e gli effetti dell'invecchiamento. Chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento delle malattie associate all'invecchiamento in cui la proteostasi è compromessa e per promuovere un invecchiamento sano.
Il collasso della proteostasi è un enorme problema clinico, in quanto è alla base dello sviluppo di malattie da misfolding proteico, tra cui Alzheimer, Parkinson, malattia di Huntington e sclerosi laterale amiotrofica. Inizia usando piastre di Petri da 6 centimetri di diametro per preparare cinque piastre di agar per ogni condizione di prova. Per gli esperimenti con RNAi, indurre la produzione di dsRNA in HT115 E.coli trasformato e utilizzare RNAi agar.
Utilizzare OP50 E.coli su agar NGM standard per esperimenti senza RNAi. Coltivare le colture di E.coli durante la notte a 37 gradi Celsius mentre si scuote a 220 RPM. Il giorno successivo, pellettiamo i batteri per centrifugazione a 2.400 G per 15-20 minuti, quindi aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet in un decimo del volume iniziale di lb.
Aliquota 200 microlitri di batteri concentrati su ogni piastra e lasciare asciugare le piastre aperte in un ambiente pulito fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito. Per sincronizzare i C.Elegans con il trattamento con ipoclorito, lavare due volte gli ermafroditi gravidi con tampone M9, quindi trasferirli in un tubo fresco e incubare in 5 millilitri di soluzione di ipoclorito per cinque minuti, agitandoli ogni minuto. Dopo l'incubazione, girare verso il basso gli animali e lavarli tre volte con il tampone M9.
Permettere agli embrioni di schiudersi in tubi durante la notte in 3 millilitri di soluzione M9 con rotazione a 20 gradi Celsius. Calcola la densità degli animali L1 facendo cadere 10 microlitri di soluzione L1 tre volte su una piastra di 6 centimetri e contando il numero di animali L1. Periodicamente, mescolare le soluzioni L1 per evitare che gli animali si depositino.
Semina 50 L1 un animale su ogni piatto, conta e registra il numero di semi e sposta le piastre in un incubatore a 20 gradi Celsius. In alternativa, per sincronizzare gli animali tramite la deposizione delle uova, posizionare da cinque a dieci giovani animali adulti gravidi su ciascun piatto per quattro-sei ore e consentire loro di depostare le uova fino a quando non ci sono circa 50 uova per piatto. Rimuovere tutti gli adulti gravidi e spostare le piastre con le uova in un'incubatrice a 20 gradi Celsius.
Far crescere gli animali fino allo stadio L4, che richiederà circa 40 ore a 20 gradi Celsius. Quindi aggiungere 50 microlitri di 160 volte FUDR. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto muscolare, scegli 20 animali e montali su un vetrino per microscopio con un tampone di agarose al 3% e una goccia di 5 microlitri di 10 millimolari di azide di sodio.
Dopo che tutti i vermi sono immobilizzati, immagina tutti i corpi degli animali usando una lente di ingrandimento 10 X. Utilizzare un filtro FITC o YFP e la stessa esposizione per ogni animale. Al termine, scartare le diapositive.
Conta il numero di fuochi nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile dimmer sullo sfondo. Nei giorni di punteggio, guarda le piastre con gli animali e registra il numero di animali paralizzati, quindi rimuovi gli animali paralizzati dal piatto.
Al completamento dell'esperimento, calcolare il tasso di paralisi per ogni condizione e tracciare la progressione della paralisi. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto neuronale, montare i vermi su un vetrino come descritto in precedenza e scattare immagini Z stack della testa degli animali su un microscopio composto utilizzando una lente di ingrandimento 40 X. Scartare le diapositive dopo l'imaging.
Dopo aver acquisito le immagini, appiattire le pile Z e utilizzarle per quantificare il numero di focolai nei neuroni situati nell'area dell'anello nervoso. Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP dai giorni 4, 6, 8 e 10. Il secondo giorno dell'età adulta, scegli 10 animali sincronizzati dalla piastra e posizionali su una goccia di 10 microliti di tampone M9 su un vetrino del microscopio.
Ripeti questo passaggio almeno quattro volte per ottenere un campione di 40 o più animali. Il video registra il movimento degli animali per un periodo di 30 secondi su uno stereomicroscopio con una videocamera capace. Una volta registrati tutti i video con gli animali da analizzare, riproduci il video e segna le curve del corpo di ciascun animale.
Traccia il numero di piegature del corpo per ogni animale in un grafico a colonne, dove ogni punto rappresenta il numero di piegature del corpo in 30 secondi sull'asse Y e le diverse condizioni testate sull'asse X. Il modello di ripetizione della poliglotamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. L'espressione di polyQ-YFP muscolo-specifica provoca l'accumulo di focolai fluorescenti che sono facili da quantificare sotto un semplice microscopio fluorescente di dissezione.
Gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all'interno del muscolo collassa a causa dell'effetto proteotossico del reporter. Il declino associato all'età della proteostasi neuronale può essere seguito quantificando direttamente la formazione aggregata e il declino delle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido. Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che la proteina chinasi interagente del dominio omeo, un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari.
La perdita di HPK-1 aumenta il numero di aggregati Q35-YFP che si accumulano durante l'invecchiamento. Gli animali di controllo hanno mostrato una media di 18 aggregati, mentre gli animali trattati con HPK1 null mutant e HPK1 RNAi hanno mostrato una media di 28 e 26 aggregati, rispettivamente. All'ottavo giorno dell'età adulta, dal 77 al 78% degli animali carenti di HPK1 erano paralizzati, rispetto al solo 50% del controllo.
Inoltre, è stato dimostrato che la sovraespressione di HPK1 regola la formazione di aggregati proteici e protegge gli animali che invecchiano dalla paralisi associata a Q35-YFP durante l'invecchiamento. Questo metodo misura il declino generale del proteoma all'interno di un tipo di cellula. Esistono molti metodi per valutare i cambiamenti in componenti specifici della rete prostatica.
Insieme, forniscono un quadro completo. La proteostasi in declino è un segno distintivo dell'invecchiamento. Questo approccio consente ai ricercatori di quantificare questo declino.
Se combinato con l'analisi genetica, è un potente strumento per la scoperta.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo studio indaga il declino della proteostasi come fattore chiave nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative, utilizzando un modello di C. elegans. Gli autori utilizzano l'espressione di reporter fluorescenti di poliglutamina specifica per i tessuti per misurare la proteostasi quantitativamente in vivo, permettendo approfondimenti sul declino cellulare associato all'età.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Invecchiamento
- Malattie neurodegenerative
- Proteostasi
Contesto
- Il declino proteostatico è collegato a malattie come l'Alzheimer e il Parkinson.
- Comprendere i meccanismi della proteostasi è cruciale per potenziali interventi terapeutici.
- L'uso di un modello di organismo multicellulare (C. elegans) aiuta nell'esame dei processi cellulari in vivo.
Metodi utilizzati
- Espressione di reporter fluorescenti di poliglutamina specifica per i tessuti
- Caenorhabditis elegans
- Microscopia per quantificare i foci e i tassi di paralisi
Risultati principali
- Lo studio rivela l'accumulo di aggregati fluorescenti nei tessuti muscolari e neuronali di C. elegans come segno di declino della proteostasi.
- La carenza di HPK-1 ha portato a una maggiore formazione di aggregati durante l'invecchiamento.
- Ha dimostrato una correlazione tra proteostasi e deterioramento della funzione motoria.
Conclusioni
- Questa ricerca evidenzia il ruolo critico della proteostasi nei processi di invecchiamento.
- I risultati forniscono preziose informazioni per sviluppare interventi per combattere le malattie legate al mal ripiegamento delle proteine legate all'invecchiamento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying tissue-specific proteostatic decline in C. elegans enables early-stage target validation for neurodegenerative disease mechanisms. The model provides quantitative, in vivo readouts of protein aggregation and functional decline, supporting predictive confidence in pathway modulation. This approach facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to proteostasis outcomes in an intact multicellular system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing age-associated proteostasis collapse in specific tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantification of fluorescent foci and locomotion defects as phenotypic readouts.
- Predictive Value: Correlates molecular changes with behavioral outputs, improving confidence in target relevance to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative imaging outputs for high-throughput screening of proteostasis modulators.
- Reproducibility: Uses synchronized worm populations and consistent imaging parameters to ensure reliable foci counting across conditions.
- Scalability: Adaptable to multi-well formats and automated imaging platforms for compound library evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models proteostasis decline underlying Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, and ALS, enabling target identification for protein misfolding diseases.
- Translational Continuity: Connects genetic hits (e.g., HPK-1) to autophagy and chaperone regulation, informing mechanistic pathways for therapeutic intervention.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of targets based on aggregate burden and paralysis progression, reducing false positives in lead selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, providing mechanistic insights after target identification and before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying tissue-specific proteostasis decline in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts (foci count, paralysis rate) for evaluating compound effects on protein homeostasis.
- Analytics: Enables statistical comparison of aggregation kinetics and functional decline across genotypes or treatment groups.
- Translational Research: Links molecular chaperone and autophagy pathways to phenotypic outcomes, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic proteostasis assessment across multiple disease-relevant tissues and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into proteostatic networks, reducing ambiguity in target validation for neurodegenerative indications.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative imaging-based assays with defined scoring criteria for foci and motility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular targets to functional decline in a physiologically relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by quantifying proteostasis rescue potential across neuronal and muscle tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, microscopy, and transgenic strain maintenance.
- Dependent on fluorescence microscopy systems with FITC/YFP filters and controlled environmental conditions for aging assays.
- Necessitates synchronization protocols and standardized scoring criteria for foci quantification and paralysis assessment.
- Adaptation across tissues relies on promoter-driven expression and may require optimization for signal-to-noise in different cellular contexts.
- Practical limitations include throughput constraints of manual imaging and variability in aggregate penetration depth in thick tissues.
