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Si inizia con batteri conservati in un stock di gliceroli, precedentemente cresciuti fino alla fase esponenziale iniziale per garantire stati fisiologici uniformi e una crescita riproducibile.
Aggiungi materiale di crescita e vortice per risospendere uniformemente i batteri.
Diluire serialmente la sospensione usando un mezzo fresco per ottenere un intervallo di densità cellulari iniziali.
Caricare i campioni nei pozzi interni di una piastra multi-pozzetto, lasciando i pozzi di bordo riempiti con mezzi vuoti per minimizzare la variabilità legata all'evaporazione.
Inserire la piastra in un set di lettura micropiastra per mantenere un movimento costante e una temperatura ottimale per la crescita batterica.
Man mano che i batteri si moltiplicano, la densità ottica o OD della coltura aumenta.
Misura il diametro esterno a intervalli fissi.
Si sottraggono i valori iniziali di OD ottenuti dai pozzi vuoti per correggere l'assorbenza di fondo.
Successivamente, calcola il tasso di crescita a partire dai valori consecutivi di OD misurati a intervalli di tempo definiti, consentendo una quantificazione ad alto rendimento e precisa della dinamica della crescita batterica.
Per la registrazione in tempo reale della crescita, aggiungere circa 25 millilitri di M63 a un serbatoio sterilizzato di reagenti. Poi, aggiungi 900 microlitri di M63 ai microtubi in preparazione per la produzione di diluizioni seriali. Successivamente, aggiungi 900 microlitri di M63 alla scorta di glicerolo scongelata e al vortice.
Trasferire 100 microlitri della diluizione a 10 volte in un altro microtubo contenente 900 microlitri di M63 e vortice. Ripeti questo passaggio fino a raggiungere il numero desiderato di diluizioni. Ora, riempi i pozzi al bordo di una micropiastra a fondo piatto sterilizzato da 96 pozzi con 200 microlitri di M63, usando una pipetta a otto canali.
Caricare 200 microlitri di ciascun campione diluito nei pozzi delle micropiastre secondo la tabella di riferimento. Per evitare strati di allocazione dovuti al riscaldamento e all'efficienza di semina, non utilizzare mai i pozzi ai margini della micropiastra per i tuoi campioni e caricare lo stesso campione in più pozzi in posizioni diverse della microplacca. Posiziona la micropiastra a 96 pozzi sul lettore di piatta.
Apri Read Now nella Task Manager e scegli il programma. Clicca su Ok per iniziare a misurare. Infine, salva la registrazione come nuovo file sperimentale per l'analisi dei dati.