Name: Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per identificare piccole molecole che modulano i livelli di c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa. Questa tecnica consente di testare oltre 3.500 composti in 48 ore per la scoperta di nuovi antibiotici.

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Ringraziamo il laboratorio Tolker-Nielsen per la generosa donazione di costrutti reporter utilizzati per sviluppare lo schermo. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Ryan per i loro utili commenti e la lettura critica del manoscritto. Il lavoro degli autori è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate dal Wellcome Trust (WT100204AIA borsa di studio senior a R.P.R. e borsa di dottorato 093714/Z/10/Z a K.N.R.).

Nota: Le procedure per la clonazione e la trasformazione del purificato c-di-GMP giornalista plasmide sono discussi altrove 12. 1. Generazione di GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain <ol><li> Seminare medio 5 ml di brodo lisogenia (LB) con una singola colonia di P. aeruginosa e incubare durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> Trasferimento 2 ml di coltura durante la notte in 200 ml di terreno LB fresco in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> Monitorare densità ottica a 600 nm (OD 600) ogni 30 min prelevando un campione 1 ml dalla muffola ed esaminare utilizzando uno spettrofotometro (come descritto in precedenza 12). </li><li> Quando la OD 600 raggiunge tra 0,3 - 0,5 porre 40 ml di coltura in un tubo da 50 ml conica per centrifuga. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 8.000 rpm per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante e re-sospensione le cellule in 40 ml di soluzione 300 mM di saccarosio ghiacciata, sterile. </li><li> Agglomerare le cellule una seconda volta mediante centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 20 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile. </li><li> Agglomerare le cellule per l&#39;ultima volta per centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 400 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile. Nota: La densità delle cellule, a questo punto dovrebbe essere di circa 1 x 10 11 unità formanti colonia per millilitro (CFU / ml). </li><li> Raffreddare le cellule in ghiaccio per 30 min, dopo di che sono pronti per l&#39;elettroporazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di una / ml pCdrA :: GFP C plasmide 12 soluzione 0,2 mg a 40 ml di P. cellule elettro-competente aeruginosa preparati sopra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga che è stato pre-raffreddata in ghiaccio. Mescolare la sospensione e trasferire in un pre-raffreddata, 2 millimetri distanza tra gli elettrodi, elettroporazione provetta. Nota: pCdrA :: GFP </em&gt; C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (MUT3) -T 0 -T 1, Amp r Gm R, che dà una lettura a fluorescenza del livello intracellulare di c-di-GMP in P. ceppi aeruginosa, è stato sviluppato e validato da Rybtke et al. 12. </li><li> Rimuovere l&#39;umidità all&#39;esterno della cuvetta con carta velina e posizionare la cuvetta nella camera del campione del electroporator. Pulse con una tensione di 2,5 kV, capacità di 25 uF e resistenza di 200 Ω. </li><li> Rimuovere la cuvetta e aggiungere 1 ml di terreno LB. Quindi, trasferire le cellule ad una sterile 1,5 ml provetta e incubare per 2 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> Distribuire 10 ml, 50 ml e aliquote di 100 microlitri della coltura su piastre LB-agar addizionato con ampicillina sterili (ad una concentrazione di 100 ug / ml), e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. </li><li> Confermare l&#39;espressione GFP (excitatisu a 485 nm, emissione a 520 nm), esaminando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza con un canale GFP normale e scegliere una singola colonia per inoculare 5 ml LB. Incubare per una notte come descritto al punto 1.1. Mescolare 0,5 ml della coltura durante la notte con 0,5 ml di glicerolo al 50% in 2 ml vite tubo orizzontale e conservare a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparazione della coltura starter per l&#39;inoculazione <ol><li> Due giorni prima che lo schermo, il piatto del P. ceppo aeruginosa (contenente la pCdrA :: GFP C plasmide) da -80 ° C archivio su una piastra di LB-agar (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml), diffondendo delicatamente i batteri sopra la piastra utilizzando un inoculo sterile ciclo continuo. Incubare la piastra per una notte a 37 ° C. </li><li> La sera prima della proiezione, inoculare una singola colonia di P. aeruginosa dalla piastra in 10 ml di terreno LB (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml) in una TUessere e incubare durante la notte pre-coltura a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> Il giorno della schermata, preparare una subcoltura dal overnight precoltura diluendo prima con terreno LB fresco ad una OD 600 di 1,0 e poi ulteriormente diluito con 5% LB ad un OD 600 di 0,04 (rapporto 1,25) . Nota: Il volume totale del mezzo inoculato dipende dal numero di piastre da testare. 5% LB è fatta diluendo 100% LB con tampone fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata. È importante sottolineare che i media (5% LB) consente l&#39;attivazione costitutiva della pCdrA :: GFP C in P. aeruginosa. </li><li> Aggiungere sterile ancoretta magnetica nel contenitore e mescolare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente, permettendo ai batteri di raggiungere la media prima di essere consegnato in piastre a 384 pozzetti. </li></ol> 3. Inoculazione e incubazione delle piastre da 384 pozzetti contenentipiccole molecole Nota: La sterilità e le buone tecniche asettiche sono di primaria importanza per le seguenti operazioni. <ol><li> Per preparare il controllo positivo (100% di inibizione), aggiungere 20 ml tobramicina solfato (25 mg / ml) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo positivo nei pozzetti A23 - P23 (Figura 2). </li><li> Per preparare il controllo negativo (0% di inibizione), aggiungere 30 ml dimetilsolfossido (DMSO) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo negativo nei pozzetti A24 - P24 (Figura 2). </li><li> Per ciascuna delle piastre stampate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 ml di colture overnight diluite (riportati nel passo 2.3) nei pozzetti A1 - P22 (Figura 2). Nota: Ciò può essere ottenuto utilizzando un gestore di liquido robot. A causa delle proprietà eterogenee di colture batteriche, è importante mantenere una agitazione continua e moderata per mantenere i batteri costantemente distribuiti nei media durante la distribuzione. Per fare questo, continuate a mescolare la cultura acclimatati dal punto 2.4 magneticamente durante l&#39;erogazione. </li><li> Sigillare le piastre con un sigillo copertura permeabile all&#39;aria e incubare per 6 ore a 37 ° C. Nota: La tenuta permeabile all&#39;aria è fondamentale per mantenere le condizioni immutabili attraverso tutti i 384 pozzi e per aggirare il potenziale di sviluppo dei gradienti di ossigeno attraverso la piastra. </li></ol> 4. misurazione della crescita (OD 600) e intracellulare c-di-GMP Livello (GFP) <ol><li> Circa 30 minuti prima misurazione spettrofotometrica, pre-riscaldare il lettore di piastre a 37 ° C per evitare la condensazione. </li><li> Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all&#39;aria prima di leggere. Misurare la densità ottica alla lunghezza d&#39;onda di 600 nm con un ambiente di 10 lampi al bene eun tempo di assestamento di 0,2 sec. </li><li> Prima di misurare la fluorescenza, fare un guadagno automatico e la regolazione focale sulla base di ben A24 (controllo negativo) e impostare il valore target di guadagno al 75% (Figura 2). <ol><li> Dal software di controllo lettore di piastre, cliccare sulla misurazione di inizio e cliccare su &#39;&#39; Focus e Regolazione guadagno IDS / Plate &#39;scheda&#39;. </li><li> Seleziona &#39;&#39; Messa a fuoco &#39;&#39; e &#39;&#39; canale A &#39;&#39; a destra sulla finestra. </li><li> Seleziona &#39;&#39; di regolazione del guadagno &#39;&#39; e &#39;&#39; Selected bene &#39;&#39;, e digitare &#39;&#39; 75 &#39;&#39; il &#39;&#39; valore obiettivo &#39;&#39;. Infine, scegliere bene A24 nel layout piatto prima di fare clic su &#39;&#39; avviare la regolazione &#39;&#39;. Una volta che la regolazione viene effettuata, cliccare su &#39;&#39; Avviare la misurazione &#39;&#39;. </li><li> Misurare la fluorescenza del reporter di GFP ad un massimi di eccitazione / emissione di 485/520 nm con una cornice di 10 flash al bene e un settlitempo ng di 0,2 sec. </li></ol></li><li> Raccogliere i dati provenienti da tutte le piastre esaminati. Nota: letture dati vengono salvati automaticamente come predefinita dal software di controllo lettore di piastre. <ol><li> Visualizzazione delle letture facendo clic sull&#39;icona &quot;Mars&quot; all&#39;interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica. </li><li> Recuperare dati da &quot;doppio clic&quot; sul numero di targa di interesse per accedere ai dati per l&#39;analisi. </li></ol></li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Valutare l&#39;uniformità e la riproducibilità del test utilizzando l&#39;analisi robusta z &#39;, che è la metriche più comuni di qualità segnalati per schermi high-throughput. Calcolare z robusta &#39;con la formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> Dove MAD (mediana Absolute deviazione) è una stima della deviazione standard, p è il controllo positivo (100% di inibizione) ed n è il controllo negativo (0% di inibizione) sia per OD 600 e GFP valori. Nota: Un saggio con un valore solido z &#39;(calcolato sia per OD 600 e GFP dati grezzi) maggiore o uguale a 0,5 è considerato come un saggio eccellente. </li><li> Calcolare% di inibizione della crescita mediante la formula: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> Dove Xi OD600 è il iterata valore di OD 600 di ciascun campione. % Di inibizione OD600&gt; 0, inibitore della crescita; % Di inibizione OD600 &lt;0, promotore della crescita. </li><li> Valutare l&#39;inibizione% del livello intracellulare di c-di-GMP utilizzando la formula (la variazione di unità di intensità di fluorescenza arbitraria vengono corretti per la variazione di densità cellulare): <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> Dove Xi GFP è il valore GFP iterata di ciascun campione. Inibizione% GFP&gt; 0, inibitore c-di-GMP; % &amp;# 160; Inibizione GFP &lt;0, c-di-GMP promotore. </li><li> Impostare una soglia di rilevamento per zone a 3 MAD dalla mediana (mediana ± 3 MAD), calcolato dal campione colto-out di ogni piatto, ipotizzando una distribuzione normale di punti di dati. Nota: Tuttavia, un ± 50% di inibizione cut-off può essere selezionato per saggi dose-risposta più riproducibili e precisi, se necessario. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Al fine di migliorare il trattamento di infezioni batteriche, è evidente che è necessaria una migliore comprensione del comportamento batterica a livello regolamentare molecolare. La procedura descritta qui sarà utile per microbiologi, biochimici e clinici che vogliono scoprire le piccole molecole che hanno il potenziale per manipolare o interferire con le concentrazioni cellulari di c-di-GMP nei batteri. Il metodo utilizza una marcatura già GFP recentemente sviluppato per monitorare i livelli cellulari di c-di-GMP in P. aeruginosa 12. Questa marcatura già è stato convalidato e dimostrato importante non influenzare la crescita del ceppo usato quando coltivate in 5% LB in PBS. L&#39;uso di uno schermo whole-cell per identificare piccole molecole che altera i livelli di c-di-GMP in vivo supera le maggiori difficoltà di destinazione-based drug discovery in termini di penetrazione molecola attraverso le membrane batteriche, in particolare attraverso quelli di batteri Gram-negativi . È importante sottolineare che, tegli saggio appare molto robusto come un valore solido z &#39;costantemente al di sopra di 0,5 è stata osservata in tutte le schermate fino ad oggi. Lo screening utilizzando questo protocollo rivelerà una serie di piccole molecole che inibiscono e / o promuovono intracellulari livelli di c-di-GMP in P. aeruginosa. Inoltre, questo test ha anche la possibilità di identificare battericide o batteriostatiche composti con conseguente diminuzione della OD 600 read-out. Sebbene non discusso nella sezione del protocollo, ci sono diverse considerazioni importanti per la preparazione dell&#39;esperimento. È importante tenere presente che la marcatura già GFP è basato su un plasmide. Sebbene il plasmide giornalista è noto per essere molto stabile in P. aeruginosa, può essere interrotta dopo continua ri-placcatura, quindi la necessità di utilizzare ceppi appena placcato da -80 ° C stock di glicerolo, e controllando espressione fluorescenza è critica. È inoltre molto importante per mantenere condizioni di crescita uniformi in tutto lo schermodal momento che eventuali fluttuazioni in queste condizioni potrebbero avere effetti a catena sullo schermo. Ciò include assicurandosi che i media e antibiotici sono premade in batch e utilizzato nel corso della schermata. Le colture batteriche non cresce (sulla base di OD 600 read-out) in modo uniforme è un problema comune per la maggior parte degli schermi high-throughput di questa natura. Questo può essere dovuto ad effetti di bordo o l&#39;erogazione di una coltura batterica non omogenea nelle piastre. Per i primi, assicurandosi che la tenuta di gas-permeabile viene utilizzato durante l&#39;incubazione è di vitale importanza. Mentre per quest&#39;ultimo, innescando il tubo conduttore liquido con un volume di coltura almeno tre volte si raccomanda il volume morto del tubo stesso. È fondamentale mantenere l&#39;agitatore magnetico a velocità minima durante l&#39;erogazione. Mentre monitoraggio e memorizzazione delle piastre a 384 pozzetti di crescita costante nel corso degli esperimenti è fondamentale, una situazione per evitare la sovrapposizione delle lastre durante l&#39;incubazione in quanto può causare unvoluto gradienti di ossigeno che portano ad un disallineamento nel modello di crescita. E &#39;anche importante assicurare che il veicolo DMSO usato come controllo negativo non influisce negativamente la crescita del ceppo di interesse. Molti di questi problemi associati con la crescita possono essere evitati eseguendo uno schermo finto con il ceppo batterico di interesse prima dello screening. Interpretazione dei dati anche merita considerazione visto che c-di-GMP risultati di inibizione sono calcolati dal cambiamento in unità di intensità di fluorescenza arbitrarie che deve essere corretto per il cambiamento di densità cellulare. Con questo in mente diverse formule matematiche per valutare i dati in uscita da questi esperimenti dovrebbero essere considerati. Ad esempio, un composto potrebbe apparire come inibitore c-di-GMP ma in realtà essere un inibitore della crescita o viceversa, richiedendo prudente interpretazione dei risultati identificati. Ci sono diversi inconvenienti e limitazioni che devono essere considerati durante lo sviluppo e le prestazioni di questohigh-throughput cell-based schermo. Ad esempio, le funzioni bio-reporter su una misura indiretta di cellulari livelli c-di-GMP utilizzando una sonda fluorescente cui proprietà rilevamento potrebbe potenzialmente essere influenzata da piccole molecole utilizzate in uno schermo. Un problema tangenziale è il fatto che il saggio basato su cellule non contiene informazioni relativamente al meccanismo dietro cambiamenti nei livelli di intracellulare c-di-GMP. Pertanto, importanti osservazioni da esperimenti devono essere confermati mediante un approccio di spettrometria liquida ad alta prestazione cromatografia di massa, che è considerato il metodo &quot;gold-standard&quot; per misurare intracellulari fluttuazioni c-di-GMP in batteri. Inoltre, il procedimento può fornire solo informazioni sul comportamento dei batteri coltivati ​​in vitro, le cellule batteriche coltivate nel contesto del host (in vivo) modificare rapidamente le loro attività a causa di questo ambiente. Inoltre, il processo di utilizzo di una marcatura già GFP significa che lo schermo non prendein considerazione lo stato fisiologico delle cellule batteriche. Tuttavia, il protocollo può essere adattato al monitoraggio microscopica dei singoli pozzetti durante il corso della schermata. Anche con tali considerazioni e limitazioni, questo saggio ad alta prestazione è ancora uno schermo robusto per piccole molecole capaci di interferire con livelli intracellulari di c-di-GMP. Poiché molte specie microbiche tra cui molti patogeni batterici sono stati studiati per caratterizzare la modulazione dei livelli intracellulari c-di-GMP, il protocollo può essere applicata a diverse specie batteriche e ampliato per lo studio dei più complessi modelli batteri multispecie. Il dosaggio può essere facilmente ottimizzato per altre specie batteriche cambiando le condizioni di crescita utilizzati, o possono essere adattati per leggere altre uscite utilizzando diversi bioreporters. Diversi tempi di incubazione possono essere applicati a seconda della fase di crescita di interesse. Tuttavia, quando scaling up o aumentare through-put, è importan<html> t da tenere a mente che i batteri saranno ancora in crescita durante i preparativi della piastra e le misure di read-out. Pertanto si raccomanda di schermare un massimo di 15 piastre alla volta utilizzando questo protocollo. Inoltre, utilizzando piastre con più di 384 pozzi potrebbe non consentire la crescita uniforme, che richiede un&#39;ulteriore ottimizzazione. Quando ridimensionamento del numero di piastre, può essere più appropriato per inoculare manualmente utilizzando una pipetta elettronica invece di un robot gestione dei liquidi. È chiaro che questo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare piccole molecole che disperdono biofilm, dato che i composti anti-biofilm interferiscono con segnalazione c-di-GMP. Il protocollo potrebbe anche essere rivisto per comprendere i vari aspetti della fisiologia batterica. Dato che la segnalazione c-di-GMP è prevalente nella maggior parte dei batteri, studiando le fisiologia di questi organismi usando questo protocollo possiamo identificare diversi stimoli chimici per determinare se i loro meccanismi di funzionamento richiedono segnalazione c-di-GMP. _content &quot;&gt; In sintesi, la robustezza e la versatilità dell&#39;approccio presentato in questo protocollo aiuterà l&#39;identificazione di modulatori chimici di c-di-GMP segnalazione in molti sistemi biologici.

Il rapido sviluppo di resistenza batterica agli antibiotici clinicamente importanti è una delle maggiori preoccupazioni che deve affrontare gli operatori sanitari in tutto il mondo. Questo fallimento degli antibiotici tradizionali ha spinto nuove ricerche per la materia chimico che può interferire con i processi batterici coinvolti nella virulenza e progressione della malattia 1. Un tale sistema di regolamentazione che utilizza il secondo messaggero intracellulare ciclico di-GMP (c-di-GMP) è recentemente diventato un bersaglio con validità promettente 2-4. E &#39;stato stabilito che questa seconda molecola segnale messaggero globale regola molte funzioni tra cui la resistenza agli antibiotici, l&#39;adesione, la formazione di biofilm e la malattia 2-4. Ora è inteso che il livello cellulare di c-di-GMP nella cellula batterica è controllato da sintesi e degradazione in cui due molecole di GTP sono usati per sintetizzare c-di-GMP by GGDEF dominio contenenti ciclasi diguanylate (DGCS) whereas degradazione c-di-GMP è catalizzata dalla fosfodiesterasi (PDE) che hanno sia un EAL o un dominio HD-GYP (recensione in (3, 5)). Le proteine ​​contenenti questi domini contengono spesso altri domini di segnalazione, suggerendo che la loro attività in fatturato c-di-GMP è regolata direttamente o indirettamente da stimoli ambientali o cellulari 3,5. Di conseguenza, c-di-GMP funzioni di segnalazione per collegare il rilevamento di diversi stimoli ambientali modifiche nel fenotipo batterica. c-di-GMP esercita il suo effetto normativo batteri a livello della trascrizione, post-trascrizione e post-traduzione da vari meccanismi 4. Una grande influenza di c-di-GMP in molte cellule batteriche è nella determinazione di batteri &#39;stile di vita&#39; e, in particolare, nel controllo delle transizioni tra cellule planctoniche motilità e cellule sessili attaccate alle superfici o organizzati in strutture multicellulari di biofilm 3,5. In generale, alta cellularlivelli di c-di-GMP sono associati con la formazione di biofilm e sessility, mentre bassi livelli cellulari favorire la motilità e la sintesi fattore di virulenza in molti batteri patogeni 3,5. Così, una conoscenza più dettagliata del funzionamento della segnalazione c-di-GMP poteva permettersi strategie per l&#39;inibizione della formazione di biofilm e virulenza in batteri patogeni. Questo è un compito arduo, dato che la maggior parte dei genomi batterici codificano numerose proteine ​​con GGDEF, EAL e / o domini HD-GYP (ad esempio P. aeruginosa ha oltre 40 proteine) e molteplici effettori 6,7. Tuttavia, anche con questa complessità, studi recenti dimostrano che le strategie di manipolazione di segnalazione c-di-GMP possono essere sviluppate a uno prevenire le infezioni resistenti agli antibiotici in via di sviluppo o li rendono suscettibili al sistema immunitario o un trattamento efficace per la co-somministrazione di antibiotici classici 2. In linea con questo, è stato sperimentalmente dimostrato che diminuzione artificialedi intracellulare c-di-GMP in vitro grown P. aeruginosa porta alla diminuita formazione di biofilm e una maggiore suscettibilità agli antimicrobici, mentre P. aeruginosa -developed biofilm su impianti di silicone, che si trova nella cavità peritoneale di topi, possono essere disperse in modo simile 8-11. Qui, descriviamo un high-throughput, saggio giornalista basato sulla fluorescenza per lo screening di piccole molecole che possono potenzialmente modulare i livelli cellulari c-di-GMP in P. aeruginosa (Figura 1). Il test si basa sulla misurazione c-di-GMP livelli cellulari utilizzando un reporter GFP precedentemente sviluppato la cui espressione è trascrizionalmente legata al c-di-GMP-reattiva CDRA promotore 12. Questo protocollo descrive la metodologia di espressione del costrutto reporter P. aeruginosa ceppo di interesse, piastra preparazione composto, cultura inoculazione in piastre da 384 pozzetti, condizioni di crescita, come noill i dettagli riguardanti la raccolta di dati, la gestione e l&#39;analisi (Figura 1). Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ai ricercatori di identificare nuovi composti potenzialmente mira c-di-GMP di segnalazione nei batteri, e per scopi di ricerca che mira a comprendere la biologia di P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Brodo di lisogenesi (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenesi con agar (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sodica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponato Soluzione salina, pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Tobramicina solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis Genesys 10S</td><td>Thermoscientific</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporatore con gap di 2 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>BioRad GenePulser XCell elettroporatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente Leica</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND barra di agitazione magnetica, PTFE, cilindrica con anello girevole (sterilizzare in autoclave prima dell'uso)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384 pozzetti, pareti bianche, piastre a fondo trasparente</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser di reagenti Multidrop Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Multidrop Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II Pipetta elettronica a 16 canali</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti sterili monouso da 100 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>Membrane permeabili all'aria AeraSeal</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>MKBQ1886</tr><tr><td>Lettore di piastre Pherastar (Versione software: 4.00 R4, Versione firmware: 1.13)</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-gmp segnalazione di<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

La resistenza batterica agli antibiotici tradizionali ha spinto i tentativi di ricerca per identificare nuovi bersagli farmacologici nelle vie di regolazione recentemente scoperti. I sistemi di regolamentazione che utilizzano intracellulare ciclica di-GMP (c-di-GMP) come secondo messaggero sono un tale classe di destinazione. c-di-GMP è una molecola di segnalazione si trovano in quasi tutti i batteri che agisce per regolare una vasta gamma di processi tra cui la resistenza agli antibiotici, la formazione di biofilm e virulenza. La comprensione di come c-di-GMP segnalazione controlli gli aspetti dello sviluppo di biofilm resistente agli antibiotici ha suggerito approcci per cui l&#39;alterazione delle concentrazioni cellulari del nucleotide o di interruzione di queste vie di segnalazione può portare alla formazione di biofilm ridotta o aumentata suscettibilità dei biofilm agli antibiotici. Descriviamo un semplice protocollo high-throughput marcatura già, sulla base di proteina fluorescente verde (GFP), la cui espressione è sotto il controllo del promotore reattivo c-di-GMP Cdra, Per lo screening rapido per le piccole molecole con la possibilità di modulare i livelli cellulari c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Questo semplice protocollo può schermo verso l&#39;alto di 3.500 composti entro 48 ore e ha la capacità di essere adattato a diversi microrganismi.

L&#39;approccio qui descritto permette un singolo ricercatore per schermare efficacemente e con successo una media di 3.500 composti entro un periodo di 48 ore. Una panoramica del protocollo di screening high-throughput è illustrata come un diagramma di flusso nella figura 1. Per l&#39;articolo corrente, abbiamo proiettato una biblioteca composta compatibile regola-di-cinque per i potenziali composti modulanti c-di-GMP ad una concentrazione finale di 600 micron . Tuttavia, ci sono molti disponibili in commercio droga-like e non-farmaco come insiemi composti che potrebbero essere utilizzati nel saggio. Questi set possono essere composti batteri concentrati o composti pool casuali ma ogni libreria avrebbero predicato proprietà fisico-chimiche e le caratteristiche assegnati come il set proiettato qui, che aveva gruppi funzionali polari e più centri stereogenici. In questo protocollo, i batteri vengono inoculati in piastra lungo con composti, un controllo positivo antibiotico e un veicolo DMSOcontrollo, secondo la disposizione mostrata nella figura 2. La Figura 3 illustra i risultati dello screening primario esemplificato da una singola piastra di libreria. OD rappresentativa 600 e dati grezzi GFP sono mostrati in Figura 3A e 3B rispettivamente. Una mappa di calore sfumatura di colore, con caldo (rosso) per il raffreddamento (verde) i colori che indicano basso ad alto OD valori 600 / GFP, è stato applicato ai valori così. Le mappe di calore sono stati generati in un foglio elettronico mediante l&#39;applicazione di una scala di formattazione condizionale di 3 colori che va dal basso OD 600 / GFP read-out fino al più alto OD 600 / GFP read-out. Low OD 600 e GFP valori relativi al controllo negativo DMSO corrispondono ad una inibizione della crescita e livelli di c-di-GMP, rispettivamente, mentre valori elevati relativi al controllo negativo DMSO corrispondono rispettivamente ad una promozione della crescita e livelli di c-di-GMP . I valori z robusta &#39;per OD 600 e GFP are calcolata secondo la formula di cui al protocollo (5.1). Dal momento che sono entrambi al di sopra di 0,5 (rispettivamente 0,694 e 0,761), la qualità del test è stato ritenuto affidabile e i dati sono stati ulteriormente analizzato. L&#39;inibizione% della crescita (OD 600) e intracellulare Livello C-di-GMP (GFP) sono calcolati dalle formule previste dal protocollo (5.2, 5.3). Dati rappresentativi sono mostrati in Figura 4A e 4B, rispettivamente. Una mappa di calore sfumatura di colore, con caldo (rosso) per il raffreddamento (verde) i colori che indicano basso dell&#39;inibizione alta%, è stato applicato ai valori così. Un grafico a dispersione di inibizione% (OD600 / GFP) dai singoli pozzi in base alla schermata principale è tracciata nella Figura 5A e 5B per OD 600 e dei dati GFP, rispettivamente. Un taglio-off ± 50% (indicato con linee tratteggiate) è selezionata per la rilevazione colpo. colpi potenziali basati su questa cut-off sono indicati con punti rossi. Due tipi di composti di interesse possono essere discerned dal saggio. Accessi identificati nella Figura 5A sono composti che inibiscono la crescita batterica, mentre risultati identificati nella Figura 5B sono composti che possiedono potenzialmente la capacità di modulare i livelli intracellulari di c-di-GMP. Due composti sono stati identificati come risultati rappresentativi per questo test. Questi sono composti A, un potenziale inibitore della crescita e composti B, un potenziale inibitore c-di-GMP. Il composto A corrisponde a ben F8 nelle figure 3 e 4, e aveva una inibizione del 72,5% in crescita. C&#39;era una inibizione corrispondente previsto nel ciclici livelli di-GMP. Composto B corrisponde a ben K3 nelle figure 3 e 4, e aveva una inibizione del 61% nel ciclici livelli di-GMP senza cambiamento nella crescita. Seleziona composti hit sono stati ulteriormente analizzati mediante un saggio dose-risposta 10 punti con una concentrazione superiore di 2 mM e serie di diluizioni doppie. IC 50 valori sono calcolati sulla base della dose-rispostacurve (Figura 6A e B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica: Installazione high-throughput per lo screening piccole molecole per il loro potenziale di modulare i livelli cellulari di c-di-GMP in P. aeruginosa. Questa panoramica mostra una rappresentazione step-by-step del protocollo utilizzato in questo test. Una colonia batterica P. aeruginosa è cresciuto durante la notte in una cultura di avviamento LB. Utilizzando un dispensatore di reagente, le cellule vengono inoculati in 384 pozzetti contenenti composti selezionati. Le piastre vengono incubate per 6 ore, dopo di che vengono misurati i valori di OD 600 e GFP. L&#39;utilizzo di questi-outs leggere, composti che influenzano i livelli cellulari di c-di-GMP può essere identificato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un</a>grande versione di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . Figura 2. A 384 pozzetti Mappa Utilizzato per la piccola molecola Screening Assay I composti dalla libreria (azzurro) sono aliquotati in pozzetti A1 - P22. Il &quot;controllo positivo&quot; (rosso) costituito da una concentrazione finale di 50 ug / ml di solfato di tobramicina viene aggiunto ai pozzetti A23 - P23 ed il &quot;controllo negativo&quot; (verde) contenente una concentrazione finale di 1% di DMSO viene aggiunta ai pozzetti A24 - P24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi per una piastra da 384 pozzetti screening. Rdati grezzi epresentative è per OD 600 (A) e GFP (B). Una mappa di calore sfumatura di colore, con acqua calda (Red: OD 600 = 0,65 o GFP = 250.000) per il raffreddamento (verde: OD 600 = 0,10 o GFP = 40.000) i colori che indicano basso a valori elevati, è stato applicato ai valori così. Wells che hanno minore OD 600 / GFP letture rispetto al controllo negativo DMSO tenderanno ad essere in rosso, mentre i pozzi che hanno elevati valori di DO 600 / GFP relativi al controllo DMSO tenderanno ad essere di colore verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante dei risultati per l&#39;inibizione percentuale calcolata per un piatto 384 pozzetti. I dati analizzati% di inibizione è rappresentata per entrambe le OD 600 (A) e GFP (B) read-out. Una mappa sfumatura di colore caldo, con caldo (Red: OD 600 = -150% o GFP = -20%) per il raffreddamento (verde: OD 600 = 100% o 100% = GFP) colori che indica bassa per alti valori di inibizione, è stato applicare ai valori così. Piccole molecole, che potenzialmente inibiscono la crescita e intracellulare c-di-GMP tenderanno ad essere di colore verde mentre le piccole molecole che promuovono potenzialmente crescita e intracellulari livelli di c-di-GMP tenderanno ad essere in rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> Figura 5. grafici a dispersione rappresentativi per% di inibizione (OD600 / GFP) ottenuti da ciascuna testata piccole molecole. Ogni piccola molecola è rappresentata da un punto e la distribuzione% di inibizioneper ciascuna delle OD 600 (A) e GFP (B) outs lettura è mostrato. Un cut-off ± 50% è stato selezionato per l&#39;identificazione colpo. I potenziali colpi sono evidenziati in rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> Figura 6. Risultati rappresentante di una dose -. La risposta del dosaggio due composti (potenziale inibitore della crescita A e potenziale c-di-GMP inibitore B) individuate dagli schermi precedenti sono ulteriormente testati in un saggio di dose-risposta 10 punti con una concentrazione superiore del 2 mM e serie di diluizioni duplice. Montaggio di una funzione logistica a quattro parametri per i dati risultanti IC50 valori di 158 micron e 193 micron, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ase clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Questo articolo descrive il saggio ad alta prestazione che è stato stabilito con successo per lo screening grandi librerie di piccole molecole per il loro potenziale capacità di manipolare i livelli cellulari di ciclico di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, che fornisce un nuovo potente strumento per la scoperta di nuovi farmaci antibatterici e test composto.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare molecole di piccole dimensioni che modulano i livelli intracellulari del secondo messaggero ciclico-di-GMP nel patogeno opportunistico Pseudomonas aeruginosa, mediante uno screening bio-rapporteur ad alto rendimento. Questo metodo può contribuire a scoprire molecole di piccole dimensioni che interferiscono con la bioinformazione di Pseudomonas aeruginosa e di altre particelle attraverso la modulazione del ciclico-di-GMP. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua elevata robustezza e versatilità, che permette lo screening di oltre 3.500 composti entro 48 ore.Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di nuove terapie che potenzialmente sensibilizzano Pseudomonas aeruginosa al sistema immunitario o agli antibiotici esistenti, esercitando al contempo una pressione selettiva minore sui batteri. Inoculare cinque millilitri di brodo lisogenico, o mezzo LB, con una singola colonia di P. aeruginosa, a sette gradi Celsius, sotto agitazione a 200 giri al minuto. Successivamente, trasferire due millilitri della coltura notturna in 200 millilitri di mezzo LB fresco in un matraccio da un litro, e incubare a 37 gradi Celsius sotto agitazione a 200 giri al minuto.Monitorare la densità ottica a 600 nanometri (OD 600) ogni 30 minuti prelevando un campione di 1 millilitro dal matraccio ed esaminandolo mediante spettrofotometro. Quando l'OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,5, trasferire 40 millilitri della coltura in un tubo conico da centrifuga da 50 millilitri. Pellettare le cellule centrifugando a 8000 rpm per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 40 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 300 millimolare fredda con ghiaccio. Dopo aver centrifugato le cellule una seconda volta, risospendere in 20 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 300 millimolare fredda con ghiaccio. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in 400 microlitri della soluzione di saccarosio 300 millimolare. Raffreddare le cellule su ghiaccio per 30 minuti, dopo di che saranno pronte per l'elettroporazione.Successivamente, aggiungere un microlitro di una soluzione di 0,2 microgrammi per microlitro di plasmide contenente il promotore CdrA al gene che codifica per la proteina fluorescente verde, in 40 microlitri di cellule elettrocompetenti di P. Aeruginosa preparate, contenute in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-raffreddato sul ghiaccio. Mescolare la sospensione e trasferirla in una cuvetta per elettroporazione pre-raffreddata con un intervallo tra gli elettrodi di 2 millimetri. Rimuovere l'umidità presente all'esterno della cuvetta con carta da laboratorio e posizionare la cuvetta nella camera del campione dell'elettroporatore.Sottoporre la soluzione a un impulso elettrico di 2,5 kilovolts, con una capacità di 25 microfarad e una resistenza di 200 ohm. Rimuovere la cuvetta e aggiungere un millilitro di mezzo LB. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto.Dopo l'incubazione, distribuire aliquote di 10 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri della coltura su piastre di agar LB sterili addizionate con ampicillina e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Verificare l'espressione di GFP esaminando la piastra al microscopio a fluorescenza con il canale GFP standard. Scegliere una singola colonia e inoculare in cinque millilitri di LB. Dopo l'incubazione notturna, mescolare 0,5 millilitri della coltura ottenuta con 0,5 millilitri di glicerolo al 50% in un tubo da 2 millilitri con tappo a vite e conservare a meno 80 gradi Celsius.Due giorni prima del test, piastrare il ceppo di P.aeruginosa preparato dal ceppo a meno 80 gradi Celsius su una piastra di agar LB, distribuendo delicatamente i batteri sulla piastra utilizzando un’ansa di inoculazione sterile. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius. La sera precedente il test, inoculare una singola colonia di P.aeruginosa dalla piastra in 10 millilitri di terreno LB in un tubo.Incubare la precoltura durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm. Il giorno dello screening, preparare una sottocoltura dalla precoltura notturna diluendola prima con mezzo LB fresco fino a un OD 600 di 1,0, e successivamente diluirla ulteriormente con LB al 5% fino a un OD 600 di 0,4. Aggiungere un’asta magnetica sterile nel contenitore e agitare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente.Questo consente ai batteri di acclimatarsi al mezzo prima che vengano distribuiti in piastre a 384 pozzetti. Per preparare il controllo positivo, aggiungere 20 microlitri di Solfato di Tobramicina a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura del controllo positivo nei pozzetti da A23 a P23.Per preparare il controllo negativo, aggiungere 30 microlitri di dimetilsolfossido a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura del controllo negativo nei pozzetti da A24 a P24. Per ciascuna delle piastre trattate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 microlitri delle colture diluite dell'over-night nei pozzetti da A1 a P22.Sigillare le piastre con un coperchio permeabile all'aria e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Circa 30 minuti prima della misurazione spettrofotometrica, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius per evitare la condensa. Rimuovere delicatamente il coperchio permeabile all'aria dalla piastra prima della lettura.Quindi misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri con un'impostazione di 10 lampi per pozzetto e un tempo di stabilizzazione di 0,2 secondi. Prima di misurare la fluorescenza, effettuare automaticamente una regolazione del guadagno e del fuoco basandosi sul pozzetto di controllo negativo A24 e impostare il valore obiettivo del guadagno al 75%. Selezionare la regolazione del fuoco e il canale A a destra della finestra. Misurare la fluorescenza del reporter GFP con un massimo di eccitazione di 485 nanometri e un massimo di emissione di 520 nanometri, utilizzando un'impostazione di 10 lampi per pozzetto e un tempo di stabilizzazione di 0,2 secondi.Raccogliere i dati da tutte le piastre esaminate. Le letture dei dati vengono salvate automaticamente come predefinito dal software di controllo del lettore di piastre. Per analizzare i dati, visualizzare le letture facendo clic sull'icona di Marte all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica.Recuperare i dati facendo doppio clic sul numero della piastra di interesse per accedere ai dati da analizzare. Valutare l'uniformità e la riproducibilità del saggio mediante un'analisi robusta del valore Z prime. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione della crescita e valutare la percentuale di inibizione del livello intracellulare di c-di-GMP come descritto nel protocollo testuale.Questa figura mostra dati grezzi rappresentativi di OD 600 e GFP ottenuti dallo screening ad alto rendimento. Ai valori delle pozzette &egrave; stato applicato una mappa termica con gradiente di colore che passa dal caldo al freddo per indicare valori da bassi ad alti. I dati generati sono stati analizzati in termini di percentuale di inibizione ed sono qui rappresentati sia per le letture di OD 600 che di GFP.I composti di piccole dimensioni che potenzialmente inibiscono la crescita e i livelli intracellulari di c-di-GMP tendono a essere in verde, mentre i composti di piccole dimensioni che potenzialmente favoriscono la crescita e i livelli intracellulari di c-di-GMP tendono a essere in rosso. I grafici a dispersione vengono utilizzati per confrontare la percentuale di inibizione ottenuta da ciascun composto di piccole dimensioni testato. Ciascun composto di piccole dimensioni è rappresentato da un piccolo punto e la distribuzione della percentuale di inibizione per ciascuna delle letture OD 600 e GFP viene mostrata.Viene selezionato un cutoff del più o meno 50% per l'identificazione dei risultati positivi. I potenziali risultati positivi sono evidenziati in rosso. Su ciascun composto interessante vengono eseguiti saggi di risposta alla dose.Qui, due composti identificati vengono testati in un saggio dose-risposta a dieci punti con una concentrazione iniziale di due millimolari e una serie di diluizioni due volte consecutiva. L'applicazione di una funzione logistica a quattro parametri ai dati ha prodotto valori di concentrazione inibitoria semimassima per ciascun composto pari a 158 micromolari e 193 micromolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per esaminare oltre 3.500 composti entro 48 ore.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare in modo robusto lo screening di Pseudomonas aeruginosa per individuare composti che interferiscono con la segnalazione del ciclico-di-GMP. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le condizioni di screening paragonabili quando lo screening viene eseguito in diversi giorni. A seguito di uno screening a concentrazione singola, eseguire uno screening di risposta in piastra utilizzando lo stesso protocollo può confermare i risultati positivi.Questa tecnica consente ai ricercatori di identificare potenziali molecole di piccole dimensioni che interferiscono con la formazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa e con la resistenza agli antibiotici. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per l'uso con qualsiasi batterio di interesse ed è suscettibile di modifiche per esaminare altri parametri in ingresso o in uscita, come l'impatto sulla vitalità batterica. Infine, non dimenticare che lavorare con Pseudomonas aeruginosa può presentare rischi.E devono sempre essere adottate precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Vengono descritte le tecniche per generare una libreria di peptidi corti in grado di attivare i mastociti tramite il recettore MRGPRX2. Le tecniche associate sono facili, poco costose e possono essere estese ad altri recettori cellulari.

Peptidi di screening che attivano MRGPRX2 utilizzando cellule HEK ingegnerizzate

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per identificare piccole molecole che modulano i livelli di c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa. Questa tecnica consente di testare oltre 3.500 composti in 48 ore per la scoperta di nuovi antibiotici.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di

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