Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare molecole di piccole dimensioni che modulano i livelli intracellulari del secondo messaggero ciclico-di-GMP nel patogeno opportunistico Pseudomonas aeruginosa, mediante uno screening bio-rapporteur ad alto rendimento. Questo metodo può contribuire a scoprire molecole di piccole dimensioni che interferiscono con la bioinformazione di Pseudomonas aeruginosa e di altre particelle attraverso la modulazione del ciclico-di-GMP. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua elevata robustezza e versatilità, che permette lo screening di oltre 3.500 composti entro 48 ore.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di nuove terapie che potenzialmente sensibilizzano Pseudomonas aeruginosa al sistema immunitario o agli antibiotici esistenti, esercitando al contempo una pressione selettiva minore sui batteri. Inoculare cinque millilitri di brodo lisogenico, o mezzo LB, con una singola colonia di P. aeruginosa, a sette gradi Celsius, sotto agitazione a 200 giri al minuto. Successivamente, trasferire due millilitri della coltura notturna in 200 millilitri di mezzo LB fresco in un matraccio da un litro, e incubare a 37 gradi Celsius sotto agitazione a 200 giri al minuto.

Monitorare la densità ottica a 600 nanometri (OD 600) ogni 30 minuti prelevando un campione di 1 millilitro dal matraccio ed esaminandolo mediante spettrofotometro. Quando l'OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,5, trasferire 40 millilitri della coltura in un tubo conico da centrifuga da 50 millilitri. Pellettare le cellule centrifugando a 8000 rpm per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 40 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 300 millimolare fredda con ghiaccio. Dopo aver centrifugato le cellule una seconda volta, risospendere in 20 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 300 millimolare fredda con ghiaccio. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in 400 microlitri della soluzione di saccarosio 300 millimolare. Raffreddare le cellule su ghiaccio per 30 minuti, dopo di che saranno pronte per l'elettroporazione.

Successivamente, aggiungere un microlitro di una soluzione di 0,2 microgrammi per microlitro di plasmide contenente il promotore CdrA al gene che codifica per la proteina fluorescente verde, in 40 microlitri di cellule elettrocompetenti di P. Aeruginosa preparate, contenute in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-raffreddato sul ghiaccio. Mescolare la sospensione e trasferirla in una cuvetta per elettroporazione pre-raffreddata con un intervallo tra gli elettrodi di 2 millimetri. Rimuovere l'umidità presente all'esterno della cuvetta con carta da laboratorio e posizionare la cuvetta nella camera del campione dell'elettroporatore.

Sottoporre la soluzione a un impulso elettrico di 2,5 kilovolts, con una capacità di 25 microfarad e una resistenza di 200 ohm. Rimuovere la cuvetta e aggiungere un millilitro di mezzo LB. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto.

Dopo l'incubazione, distribuire aliquote di 10 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri della coltura su piastre di agar LB sterili addizionate con ampicillina e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Verificare l'espressione di GFP esaminando la piastra al microscopio a fluorescenza con il canale GFP standard. Scegliere una singola colonia e inoculare in cinque millilitri di LB. Dopo l'incubazione notturna, mescolare 0,5 millilitri della coltura ottenuta con 0,5 millilitri di glicerolo al 50% in un tubo da 2 millilitri con tappo a vite e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Due giorni prima del test, piastrare il ceppo di P.aeruginosa preparato dal ceppo a meno 80 gradi Celsius su una piastra di agar LB, distribuendo delicatamente i batteri sulla piastra utilizzando un’ansa di inoculazione sterile. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius. La sera precedente il test, inoculare una singola colonia di P.aeruginosa dalla piastra in 10 millilitri di terreno LB in un tubo.

Incubare la precoltura durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm. Il giorno dello screening, preparare una sottocoltura dalla precoltura notturna diluendola prima con mezzo LB fresco fino a un OD 600 di 1,0, e successivamente diluirla ulteriormente con LB al 5% fino a un OD 600 di 0,4. Aggiungere un’asta magnetica sterile nel contenitore e agitare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente.

Questo consente ai batteri di acclimatarsi al mezzo prima che vengano distribuiti in piastre a 384 pozzetti. Per preparare il controllo positivo, aggiungere 20 microlitri di Solfato di Tobramicina a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura del controllo positivo nei pozzetti da A23 a P23.

Per preparare il controllo negativo, aggiungere 30 microlitri di dimetilsolfossido a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura del controllo negativo nei pozzetti da A24 a P24. Per ciascuna delle piastre trattate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 microlitri delle colture diluite dell'over-night nei pozzetti da A1 a P22.

Sigillare le piastre con un coperchio permeabile all'aria e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Circa 30 minuti prima della misurazione spettrofotometrica, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius per evitare la condensa. Rimuovere delicatamente il coperchio permeabile all'aria dalla piastra prima della lettura.

Quindi misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri con un'impostazione di 10 lampi per pozzetto e un tempo di stabilizzazione di 0,2 secondi. Prima di misurare la fluorescenza, effettuare automaticamente una regolazione del guadagno e del fuoco basandosi sul pozzetto di controllo negativo A24 e impostare il valore obiettivo del guadagno al 75%. Selezionare la regolazione del fuoco e il canale A a destra della finestra. Misurare la fluorescenza del reporter GFP con un massimo di eccitazione di 485 nanometri e un massimo di emissione di 520 nanometri, utilizzando un'impostazione di 10 lampi per pozzetto e un tempo di stabilizzazione di 0,2 secondi.

Raccogliere i dati da tutte le piastre esaminate. Le letture dei dati vengono salvate automaticamente come predefinito dal software di controllo del lettore di piastre. Per analizzare i dati, visualizzare le letture facendo clic sull'icona di Marte all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica.

Recuperare i dati facendo doppio clic sul numero della piastra di interesse per accedere ai dati da analizzare. Valutare l'uniformità e la riproducibilità del saggio mediante un'analisi robusta del valore Z prime. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione della crescita e valutare la percentuale di inibizione del livello intracellulare di c-di-GMP come descritto nel protocollo testuale.

Questa figura mostra dati grezzi rappresentativi di OD 600 e GFP ottenuti dallo screening ad alto rendimento. Ai valori delle pozzette è stato applicato una mappa termica con gradiente di colore che passa dal caldo al freddo per indicare valori da bassi ad alti. I dati generati sono stati analizzati in termini di percentuale di inibizione ed sono qui rappresentati sia per le letture di OD 600 che di GFP.

I composti di piccole dimensioni che potenzialmente inibiscono la crescita e i livelli intracellulari di c-di-GMP tendono a essere in verde, mentre i composti di piccole dimensioni che potenzialmente favoriscono la crescita e i livelli intracellulari di c-di-GMP tendono a essere in rosso. I grafici a dispersione vengono utilizzati per confrontare la percentuale di inibizione ottenuta da ciascun composto di piccole dimensioni testato. Ciascun composto di piccole dimensioni è rappresentato da un piccolo punto e la distribuzione della percentuale di inibizione per ciascuna delle letture OD 600 e GFP viene mostrata.

Viene selezionato un cutoff del più o meno 50% per l'identificazione dei risultati positivi. I potenziali risultati positivi sono evidenziati in rosso. Su ciascun composto interessante vengono eseguiti saggi di risposta alla dose.

Qui, due composti identificati vengono testati in un saggio dose-risposta a dieci punti con una concentrazione iniziale di due millimolari e una serie di diluizioni due volte consecutiva. L'applicazione di una funzione logistica a quattro parametri ai dati ha prodotto valori di concentrazione inibitoria semimassima per ciascun composto pari a 158 micromolari e 193 micromolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per esaminare oltre 3.500 composti entro 48 ore.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare in modo robusto lo screening di Pseudomonas aeruginosa per individuare composti che interferiscono con la segnalazione del ciclico-di-GMP. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le condizioni di screening paragonabili quando lo screening viene eseguito in diversi giorni. A seguito di uno screening a concentrazione singola, eseguire uno screening di risposta in piastra utilizzando lo stesso protocollo può confermare i risultati positivi.

Questa tecnica consente ai ricercatori di identificare potenziali molecole di piccole dimensioni che interferiscono con la formazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa e con la resistenza agli antibiotici. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per l'uso con qualsiasi batterio di interesse ed è suscettibile di modifiche per esaminare altri parametri in ingresso o in uscita, come l'impatto sulla vitalità batterica. Infine, non dimenticare che lavorare con Pseudomonas aeruginosa può presentare rischi.

E devono sempre essere adottate precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.