Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di Pseudomonas aeruginosa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare piccole molecole che modulano i livelli intracellulari del secondo messaggero ciclico-di-GMP nel patogeno opportunista, Pseudomonas aeruginosa, per mezzo di uno screening bio-reporter ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a scoprire piccole molecole che interferiscono con la bioinformazione di Pseudomonas aeruginosa e altre particelle per mezzo della modulazione ciclica-di-GMP. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto robusta e versatile, consentendo lo screening di oltre 3.500 composti in 48 ore.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di nuove terapie potenzialmente sensibilizzanti a Pseudomonas aeruginosa, al sistema immunitario o agli antibiotici esistenti, esercitando una pressione minore e selettiva sui batteri. Innoculare cinque millilitri di brodo di lisogenia, o LB medium, con una singola colonia di P.aeruginosa, a sette gradi Celsius, agitando a 200 giri/min. Quindi, trasferire due millilitri di coltura notturna in 200 millilitri di terreno LB fresco in un pallone da un litro e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min.

Monitorare la densità ottica a 600 nanometri o OD 600, ogni 30 minuti, prelevando un campione da 1 millilitro dal pallone ed esaminandolo con uno spettrofotometro. Quando l'OD 600 raggiunge tra 0,3 e 0,5, posizionare 40 millilitri di coltura in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Pellettare le celle centrifugando a 8000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 40 millilitri di soluzione sterile di saccarosio ghiacciata sterile da 300 millimolari. Dopo aver centrifugato le cellule una seconda volta, risospendere in 20 millilitri di soluzione sterile di saccarosio 300 millimolare ghiacciata Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in 400 microlitri della soluzione di saccarosio da 300 millimolari. Raffreddare le celle con ghiaccio per 30 minuti, dopodiché sono pronte per l'elettroporazione.

Successivamente, aggiungere un microlitro di una soluzione di plasmide da 0,2 microgrammi per microlitro che codifica per il promotore CdrA al gene che codifica per la proteina fluorescente verde a 40 microlitri delle cellule elettrocompetenti preparate da P.Aeruginosa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri che è stata pre-raffreddata su ghiaccio. Miscelare la sospensione e trasferirla in una cuvetta per elettroporazione pre-raffreddata da 2 millimetri. Rimuovere l'umidità all'esterno della cuvetta con carta velina e posizionare la cuvetta nella camera del campione dell'elettroporatore.

Pulsare la soluzione con una tensione di 2,5 kilovolt, condensatori di 25 microfarad e una resistenza di 200 ohm. Rimuovere la cuvetta e aggiungere un millilitro di LB medium. Quindi, trasferire le cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min.

Dopo l'incubazione, distribuire aliquote da 10 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri di coltura su piastre sterili di agar LB fornite con ampicillina e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per una notte. Confermare l'espressione della GFP esaminando la piastra al microscopio a fluorescenza con un canale GFP standard. Raccogli una singola colonia e inocula cinque millilitri di LB. Dopo l'incubazione notturna, mescolare 0,5 millilitri di coltura notturna con 0,5 millilitri di glicerolo al 50% in una provetta con tappo a vite da 2 millilitri e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Due giorni prima dello screening, impiattare il ceppo di P.aeruginosa preparato da meno 80 gradi Celsius su una piastra di agar LB diffondendo delicatamente i batteri sulla piastra utilizzando un ciclo di inoculazione sterile. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius. La sera prima dello screening, inoculare una singola colonia di P.aeruginosa dalla piastra in 10 millilitri di LB di terreno in una provetta.

Incubare la pre-coltura per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Il giorno dello screening, preparare una sottocoltura dalla pre-coltura notturna diluendola prima con un terreno LB fresco fino a un OD 600 di 1,0, e poi diluendo ulteriormente con 5%LB fino a un OD 600 di 04. Aggiungere un'ancoretta magnetica sterile nel contenitore e mescolare la coltura alla velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente.

Ciò consente ai batteri di acclimatarsi al terreno prima di essere dispensati in piastre da 384 pozzetti. Per preparare il controllo positivo, aggiungere 20 microlitri di solfato di tobramicina a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura di controllo positivo nei pozzetti da A23 a P23.

Per preparare il controllo negativo, aggiungere 30 microlitri di dimetilsolfossido a 10 millilitri della sottocoltura preparata e mescolare delicatamente. Pipettare 40 microlitri di coltura a controllo negativo nei pozzetti da A24 a P24. Per ciascuna delle piastre inumidite con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 microlitri delle colture notturne diluite nei pozzetti da A1 a P22.

Sigillare le piastre con un tappo permeabile all'aria e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Circa 30 minuti prima della misurazione spettrofotometrica, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius per evitare la formazione di condensa. Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all'aria dalla piastra prima della lettura.

Quindi misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di assestamento di 0,2 secondi. Prima di misurare la fluorescenza, effettuare una regolazione automatica del guadagno e della focale in base al pozzetto di controllo negativo A24 e impostare il valore target del guadagno al 75%Selezionare la regolazione della messa a fuoco e il canale A a destra della finestra. Misurare la fluorescenza dal reporter GFP a un'eccitazione massima di 485 nanometri e un'emissione massima di 520 nanometri con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di stabilizzazione di 0,2 secondi.

Raccogli i dati da tutte le lastre esaminate. Le letture dei dati vengono salvate automaticamente come standard dal software di controllo del lettore di piastre. Per analizzare i dati, visualizzare le letture facendo clic sull'icona Mars all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica.

Recupera i dati facendo doppio clic sul numero di targa di interesse per accedere ai dati per l'analisi. Valutare l'uniformità e la riproducibilità del test utilizzando una robusta analisi Z prime. Quindi, calcolare la percentuale di inibizione della crescita e valutare la percentuale di inibizione del livello intracellulare di c-di-GMP come dettagliato nel protocollo di testo.

Questa figura descrive i dati grezzi rappresentativi per OD 600 e GFP dallo schermo ad alto rendimento. Ai valori del pozzetto è stata applicata una mappa termica con colori da caldi a freddi che indicano valori da bassi ad alti. I dati generati vengono analizzati per l'inibizione percentuale e sono rappresentati qui per entrambe le letture OD 600 e GFP.

Le piccole molecole che potenzialmente inibiscono la crescita e il c-di-GMP intracellulare tenderanno ad essere in verde, mentre le piccole molecole che potenzialmente promuovono la crescita e i livelli intracellulari di c-di-GMP tenderanno ad essere in rosso. I grafici a dispersione vengono utilizzati per confrontare la percentuale di inibizione ottenuta da ciascuna piccola molecola testata. Ogni piccola molecola è rappresentata da un piccolo punto e viene mostrata la distribuzione percentuale di inibizione per ciascuna delle letture OD 600 e GFP.

Per l'identificazione del colpo viene selezionato un cutoff più o meno del 50%. I potenziali riscontri sono evidenziati in rosso. I saggi dose-risposta vengono eseguiti su ogni composto interessante.

Qui, due composti identificati vengono testati in un saggio dose-risposta a 10 punti con una concentrazione massima di due millimolari e una serie di diluizioni a due volte. Adattando una funzione logistica a quattro parametri ai dati, si sono ottenuti valori di concentrazione inibitoria semi-massimali per ciascun composto di 158 micromolari e 193 micromolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di oltre 3.500 composti in 48 ore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare in modo robusto Pseudomonas aeruginosa alla ricerca di composti che interferiscono con la segnalazione ciclica-di-GMP. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le condizioni di screening comparabili quando si esegue lo screening per diversi giorni. Seguendo una schermata a punto singolo, l'esecuzione di una schermata di risposta dirsk utilizzando lo stesso protocollo può convalidare gli hit.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per identificare potenziali piccole molecole che interferiscono con le informazioni bifiche di Pseudomonas aeruginosa e la resistenza agli antibiotici. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per essere utilizzata per qualsiasi batterio di interesse e può essere modificata per esaminare altri output o input, come l'impatto sulla vitalità batterica. Infine, non dimenticare che lavorare con Pseudomonas aeruginosa può essere pericoloso.

E precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale dovrebbero essere sempre prese quando si esegue questa procedura.