Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere la valutazione funzionale di librerie complete di mutagenesi di saturazione a sito singolo di proteine, utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica e dell'evoluzione molecolare. Ad esempio, quali sono i vincoli biochimici, strutturali ed evolutivi sulle proteine?

E come possiamo ingegnerizzare proteine con nuove funzioni? Il vantaggio principale di questa tecnica è che massimizza un numero di letture di sequenziamento utili in uno studio di mutagenesi della saturazione dell'intera proteina, mediante la costruzione e il sequenziamento di librerie multiplexing. Dopo aver preparato una piastra di PCR Master Mix secondo il protocollo del testo, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri dalle piastre a 96 pozzetti contenenti i primer di mutagenesi di senso precedentemente diluiti ai pozzetti affini nelle piastre PCR.

Utilizzare un sigillo per piastre per coprire ogni piastra PCR e centrifugare a 200 g per due minuti. Quindi, trasferire le piastre PCR su un termociclatore ed eseguire il seguente programma. Dopo aver effettuato un'ulteriore PCR e diluito le reazioni, da uno a 100, trasferire un microlitro dai prodotti di PCR mutagena di primo ciclo miscelati e diluiti, ai pozzetti affini di nuove piastre PCR contenenti Master Mix.

Utilizzare un sigillo per piastre per coprire ciascuna piastra PCR. Centrifugare le piastre a circa 200 G per due minuti. Quindi trasferire le piastre al termociclatore ed eseguire lo stesso programma elencato in precedenza nel video.

Dopo aver verificato le dimensioni dei prodotti PCR e aver misurato le concentrazioni secondo il protocollo di testo, mescolare 100 nanogrammi di ciascun prodotto PCR della sottolibreria NNS in cinque gruppi di sottolibrerie NNS. Dopo aver eseguito le reazioni PCR della sottolibreria e aver digerito i vettori di clonazione nelle reazioni PCR, secondo il protocollo di testo, impostare le reazioni di ligazione seguendo queste linee guida per ciascun gruppo di sottolibreria NNS digerito, con il suo vettore di clonazione digerito con restrizione affine. Quindi, incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Una volta scongelate le cellule di E.coli elettrocompetenti, aggiungere dieci microlitri di cellule a ciascuna reazione di legatura purificata e trasferirle in una cuvetta di elettroprorazione. Elettroprorata le celle a 1,8 kilovolt, quindi aggiungere un millilitro di terreno SOB e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, risospendere 10 microlitri di ciascuna coltura di recupero in 990 microlitri di LB. E stendere 100 microlitri su piastre a coclea LB contenenti 12 microgrammi per millilitro di tetraciclina.

Per ogni coltura di recupero, preparare un pallone di coltura da 250 millilitri con 50 millilitri di LB e 50 microlitri di tet-stock. Trasferire il restante circa millilitro di coltura di recupero in un pallone. Incubare a 37 gradi Celsius e 200 giri/min durante la notte.

Dopo aver contato il numero di trasformanti riusciti sulle piastre e isolato il DNA plasmatico dalle colture notturne, mescolare insieme 100 nanogrammi di ciascun plasmide. Dopo aver trasformato la libreria del DNA secondo il protocollo di testo, diluire la coltura notturna della biblioteca a un OD-600 pari a 0,1. E aggiungi un millilitro a un pallone.

Incubare la coltura di preselezione a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. Monitorare periodicamente la crescita misurando l'OD-600, fino a quando non è uguale a 0,1. Trasferire 100 millilitri della coltura di preselezione in due provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 4.000 g per sei minuti, a quattro gradi Celsius.

Rimuovere la maggior parte del surnatante e unire i pellet in un unico tubo conico da 15 millilitri. Quindi, dopo aver ripetuto la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante. Agli altri due flaconi aggiungere la tetraciclina fino a una concentrazione finale di 12 microgrammi per millilitro.

E un volume della cultura di preselezione, tale che l'OD-600 finale sia uguale a 0,001. A un pallone, aggiungere un millilitro di 50 milligrammi per millilitro di ampicillina a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Questa è la cultura della selezione.

Durante l'incubazione delle colture a 37 gradi Celsius a 200 RPM, monitorare la crescita della coltura senza ampicillina fino a raggiungere un OD-600 pari a 0,1. Misurare anche l'OD-600 della cultura di selezione. Dopo aver diviso l'OD-600 della coltura di selezione in 0,1 e moltiplicato per 100, trasferire questo volume in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 4.000 g e quattro gradi Celsius per sei minuti.

Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, unire i pellet in un unico tubo prima di girare di nuovo e rimuovere tutto il surnatante. Per eseguire il sequenziamento ad alto rendimento, preparare un PCR Master Mix e trasferire 23 microlitri in 10 provette per PCR. Aggiungere un microlitro di 0,5 nanogrammi per microlitro di DNA plasmidico purificato dalla coltura di preselezione alle provette da uno a cinque.

E dalla cultura della selezione ai tubi dal sesto al decimo. Miscelare insieme 50 microlitri di primer ortogonali in avanti da 50 micromolari, da OP1F a OP5F, con i rispettivi primer ortogonali inversi, da OP1R a OP5R. Nello stesso ordine, trasferire un microlitro in provette PCR da una a cinque e da sei a 10.

Trasferire le provette per PCR al termociclatore ed eseguire il seguente programma. Quindi, diluire le reazioni della PCR 100 volte, trasferendo un microlitro da ciascuna provetta a 99 microlitri di acqua. Mescolare bene, quindi pipettare 99 microlitri dalle provette e gettare.

Mescolare insieme 50 microlitri di primer in avanti e in retromarcia. Quindi, trasferire un microlitro nelle provette PCR da una a cinque e da sei a 10. Quindi, dopo aver preparato un PCR Master Mix, aggiungere 23 microlitri a ciascuna provetta PCR ed eseguire il seguente programma.

Per eseguire le PCR finali per aggiungere le sequenze di indicizzazione, dopo aver diluito le reazioni PCR di 100 volte, come prima, e aver mantenuto un microlitro, aggiungere 23 microlitri di PCR Master Mix. Per le provette con modello originate dai gruppi di sottolibrerie NNS da uno a cinque, aggiungere rispettivamente 0,5 microlitri di primer diretti da 501F a 505F. Per le provette con dima risultanti dalle colture di preselezione e selezione, aggiungere 0,5 microlitri di primer inversi 701R e 702R.

Eseguire lo stesso programma PCR come appena indicato. Quindi, dopo aver misurato le concentrazioni di ciascuna reazione secondo il protocollo di testo, mescolare 100 nanogrammi di ciascun prodotto PCR in un'unica provetta per microcentrifuga. Dopo aver aggiunto il colorante di caricamento del gel 6X, caricare l'intero campione PCR combinato su un gel di agarosio al due percento.

E fai funzionare il gel a 100 volt, per 50 minuti. Utilizzando un illuminatore UV a lunghezza d'onda lunga, visualizzare, quindi asportare la fetta contenente il prodotto PCR di circa 360 coppie di basi. Purificare, sequenziare e analizzare il campione secondo il protocollo di testo.

La mappa plasmidica per i cinque plasmidi pBR322 modificati contenenti siti di priming ortogonali è mostrata qui. I test per la specificità dei primer ortogonali mediante PCR hanno dimostrato che il prodotto PCR corretto è stato ottenuto solo quando il plasmide corrispondente è stato incluso nella reazione. E in sua assenza non è stato ottenuto alcun prodotto di qualsiasi dimensione.

A seguito dell'elaborazione di un esperimento, sono state ottenute 6,2 volte 10 alla sesta lettura dalla condizione di preselezione e 6,3 volte 10 alla sesta lettura dalla condizione di ampicillina. I conteggi per ogni mutazione aminoacidica dalla condizione di preselezione mostrano una distribuzione log-normale. Questa figura illustra l'effetto di fitness relativo, FIA, per ogni mutazione in ogni posizione di TEM-one.

E la sua distribuzione è mostrata qui. Sotto selezione a 50 microgrammi per millilitro di ampicillina, la maggior parte delle mutazioni ha un effetto di fitness neutro, o quasi neutro. Corrispondente ai pixel bianchi qui e al grande picco qui.

Una piccola frazione di mutazioni a questa concentrazione di antibiotici ha effetti sostanziali sulla fitness. Come previsto, questi includono mutazioni all'interno dei residui attivi del sito altamente conservati. Al contrario, pochi pixel appaiono significativamente rossi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana. Se viene eseguito correttamente e tutti i reagenti sono disponibili. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimanere organizzati durante la clonazione per combinare i prodotti di PCR mutageni nei gruppi corretti e per clonare nei vettori corretti.

E durante la preparazione del sequenziamento, utilizzare i primer corretti. Estendendo questa procedura, le fasi principali del protocollo potrebbero essere modificate per esaminare le combinazioni di mutazioni, i diversi ambienti di selezione e altri sistemi proteici, al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti la dipendenza dal contesto genetico e ambientale delle mutazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del lavoro necessario per costruire una libreria di mutagenesi di saturazione dell'intera proteina e per valutare gli effetti funzionali di ciascuna mutazione contemporaneamente, utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etidio e la luce ultravioletta può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di parti di questo protocollo è necessario prendere sempre precauzioni come guanti, camice da laboratorio e schermo UV.