Name: Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Scopri la valutazione funzionale di biblioteche di mutagenesi satura di proteine utilizzando sequenziamento ad alto rendimento. Questo metodo consente di studiare vincoli biochimici ed evolutivi e ingegnerizzare nuove funzioni proteiche.

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<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
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<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti

Qui un protocollo è descritto per eseguire la valutazione funzionale di tutto il contenuto proteico librerie saturazione di mutagenesi, utilizzando la tecnologia di sequenziamento high-throughput. Un aspetto importante del metodo è l&#39;uso di primer ortogonali durante la clonazione. In breve, ogni posizione aminoacido è randomizzati per mutageno PCR, e mescolati tra loro in gruppi di posizioni la cui azione combinata sequenza lunghezza è ospitato da high-throughput sequencing. Questi gruppi sono clonati in vettori pla...

Mutagenesi è stato a lungo utilizzato in laboratorio per studiare le proprietà dei sistemi biologici e la loro evoluzione, e per la produzione di proteine ​​mutanti o organismi con funzioni avanzate e innovative. Mentre i primi approcci fatti valere metodi che producono mutazioni casuali negli organismi, l&#39;avvento della tecnologia del DNA ricombinante ha permesso ai ricercatori di introdurre modifiche a selezionare il DNA in modo specifico del sito, vale a dire., Sito-diretta mutagenesi 1,2. Con le tecniche attuali, tipicamente utilizzando oligonucleotidi mutageni in una reazione a catena della polimerasi (PCR), è relativamente facile per creare e valutare piccolo numero di mutazioni (ad es., Mutazioni puntiformi) in un dato gene 3,4. E &#39;molto più difficile tuttavia quando gli approcci obiettivo, per esempio, la creazione e la valutazione di tutti i possibili single-site (o di ordine superiore) mutazioni. Mentre molto si è appreso dai primi studi che tentano di valutare un gran numero di mutations nei geni, le tecniche utilizzate erano spesso laboriosa, ad esempio imponendo la valutazione di ogni mutazione indipendentemente con dialogo soppressore ceppi 5-7, o sono stati limitati nella loro capacità quantitativa causa della bassa profondità sequenziamento di Sanger sequenziamento 8. Le tecniche utilizzate in questi studi sono stati in gran parte soppiantato con metodi che utilizzano high-throughput tecnologia di sequenziamento 9-12. Questi concettualmente semplici approcci comportano la creazione di una libreria comprendente un gran numero di mutazioni, sottoponendo la libreria da uno schermo o di selezione per la funzione, e quindi profonde sequenziamento (es., Dell&#39;ordine di&gt; 10 6 sequenziamento legge) biblioteca ottenuta prima e dopo la selezione. In questo modo, i fenotipiche o idoneità effetti di un gran numero di mutazioni, rappresentati come il cambiamento nella frequenza popolazione di ciascun mutante, può essere valutato simultaneamente e quantitativamente. Abbiamo già introdotto un semp(. cioè, tutta-proteina librerie saturazione di mutagenesi) approccio per valutare le biblioteche di tutte le possibili singole mutazioni aminoacidiche di proteine ​​applicabili alle geni con una lunghezza superiore alla lunghezza di sequenziamento leggi 11,13: primo, ogni posizione amminoacido è randomizzato dal sito-mutageno PCR. Durante questo processo, il gene viene suddiviso in gruppi composti da posizioni contigue con una lunghezza totale alloggiati dalla piattaforma sequenziamento. I prodotti mutageni PCR per ciascun gruppo sono poi combinati, e ogni gruppo sottoposti indipendentemente per la selezione e high-throughput sequencing. Mantenendo una corrispondenza tra la posizione di mutazioni nella sequenza e la lunghezza di sequenza di lettura, questo approccio ha il vantaggio di massimizzare profondità sequenziamento: mentre si potrebbe semplicemente sequenziare tali librerie in finestre brevi senza divisione in gruppi (ad esempio, da un fucile standard. approccio sequenziamento), più letture ottenuta sarebbe wild-type e quindi il maggioranza di sequenziamento sprecato (ad esempio, per un intero proteico libreria saturazione mutagenesi di una proteina di 500 aminoacidi sequenziato in 100 aminoacidi (300 bp) finestre, al minimo 80% di letture sarà la sequenza wild-type). Qui, un protocollo è presentato che utilizza high-throughput sequenziamento per la valutazione funzionale del tutto-proteina librerie saturazione di mutagenesi, utilizzando l&#39;approccio di cui sopra (illustrato in Figura 1). È importante sottolineare che, si introduce l&#39;uso di primer ortogonali nel processo di clonazione biblioteca in codice a barre di ciascun gruppo sequenza, che consente loro di essere multiplexing in una libreria, sottoposti contemporaneamente a screening o selezione, e poi de-multiplex per sequenziamento profondo. Poiché i gruppi di sequenza non sono sottoposti a selezione indipendente, questo riduce il carico di lavoro ed assicura che ogni mutazione sperimenta lo stesso livello di selezione. TEM-1 β-lattamasi, un enzima che conferisce resistenza ad alto livelloantibiotici β-lattamici (ad es., ampicillina) nei batteri è utilizzato come sistema modello 14-16. Un protocollo è descritto per la valutazione di un intero proteico libreria mutagenesi saturazione del TEM-1 in E. coli sotto selezione a livello sierico approssimativo per una dose clinica di ampicillina (50 ug / ml) 17,18.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Prodotti di ricerca Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer per oligonucleotidi</td><td>Tecnologie integrate del DNA https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td></td><td>scala di 25 nmol, pBR322_AvrII di desalinizzazione standard</td></tr><tr><td></td><td>disponibili su richiesta</td><td></td><td>Plasmide pBR322 modificato per contenere il sito di restrizione AvrII a valle del gene TEM-1</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 pBR322_OP5</td><td>disponibili su richiesta</td><td></td><td>cinque plasmidi pBR322 modificati, ciascuno contenente una coppia di siti di priming ortogonali</td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>include 5 tamponi PCR e additivo PCR (potenziatore GC)</td></tr><tr><td>Tubo conico da 15 ml</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanale (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra PCR, 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione piastra a 96 pozzetti</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclatore a 96 pozzetti</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x colorante di caricamento gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore UV (FOTO/Analista ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>tampone EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>piastre per saggi a 96 pozzetti a parete nera e fondo trasparente</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente PicoGreen dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>reagente per quantificazione del dDNA, utilizzato nella fase 2.2.4 del protocollo</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre Victor 3 V</td> Kit di purificazione del DNA <td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore UV a lunghezza d'onda lunga</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Gel di agarosio tampone per l'estrazione del DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 elettrocompetente E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione dei plasmidi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR a 8 pozzetti</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit di test</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA reagente di quantificazione</td></tr><tr><td>Provette per saggi Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v2 (500 cicli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Sequenziatore da tavolo MiSeq</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternativa, si potrebbe sequenziare sulla piattaforma Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>il software FLASh</td><td>della John Hopkins University - software http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ open source</td><td></td> <td>per unire le letture paired-end dai dati di sequenziamento di nuova generazione</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

un protocollo per la valutazione funzionale del whole-protein saturazione mutagenesi biblioteche utilizzando high-throughput sequencing

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

La mutagenesi sito-diretta è stata a lungo utilizzata come metodo per interrogare la struttura, la funzione e l'evoluzione delle proteine. I recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento massivamente parallelo hanno aperto la possibilità di valutare gli effetti funzionali o di fitness di un gran numero di mutazioni contemporaneamente. Qui, presentiamo un protocollo per determinare sperimentalmente gli effetti di tutte le possibili mutazioni di un singolo amminoacido in una proteina di interesse utilizzando la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento, utilizzando come esempio l'enzima di resistenza agli antibiotici TEM-1 β-lattamasi di 263 aminoacidi. In questo approccio, una libreria di mutagenesi della saturazione dell'intera proteina viene costruita mediante PCR mutagena sito-diretta, randomizzando ogni posizione individualmente a tutti i possibili amminoacidi. La libreria viene quindi trasformata in batteri e selezionata per la capacità di conferire resistenza agli antibiotici β-lattamici. L'effetto fitness di ciascuna mutazione è quindi determinato dal sequenziamento profondo della libreria prima e dopo la selezione. È importante sottolineare che questo protocollo introduce metodi che massimizzano la profondità di lettura del sequenziamento e consentono la selezione simultanea dell'intera libreria di mutazioni, mescolando posizioni adiacenti in gruppi di lunghezza adattati da un sequenziamento ad alto rendimento della lunghezza di lettura e utilizzando primer ortogonali per codificare a barre ciascun gruppo. I risultati rappresentativi utilizzando questo protocollo sono forniti valutando gli effetti di fitness di tutte le mutazioni di singoli aminoacidi in TEM-1 a un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina. Il metodo dovrebbe essere facilmente estendibile ad altre proteine per le quali è in atto un saggio di selezione ad alto rendimento.

La mappa plasmide per cinque plasmidi pBR322 modificati contenenti siti di priming ortogonali (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) è mostrato in Figura 2A. Per verificare se i primer ortogonali sono specifici, PCR sono state eseguite utilizzando ciascuna coppia di primer ortogonali individualmente, insieme a tutti e cinque i plasmidi pBR322_OP1-5, o con tutti i plasmidi meno il plasmide corrispondente alla coppia di primer ortogonale. Il prodotto è stato ottenuto corretta solo quan...

Vi presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale delle biblioteche unico sito di saturazione di mutagenesi complete di proteine ​​che utilizzano high-throughput sequencing. È importante sottolineare che questo approccio utilizza coppie di primer ortogonali al multiplex di costruzione di biblioteche e sequenziamento. Risultati rappresentativi utilizzando TEM-1 β-lattamasi selezionato ad un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina sono forniti.

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere la valutazione funzionale di librerie complete di mutagenesi di saturazione a sito singolo di proteine, utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica e dell'evoluzione molecolare. Ad esempio, quali sono i vincoli biochimici, strutturali ed evolutivi sulle proteine?E come possiamo ingegnerizzare proteine con nuove funzioni? Il vantaggio principale di questa tecnica è che massimizza un numero di letture di sequenziamento utili in uno studio di mutagenesi della saturazione dell'intera proteina, mediante la costruzione e il sequenziamento di librerie multiplexing. Dopo aver preparato una piastra di PCR Master Mix secondo il protocollo del testo, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri dalle piastre a 96 pozzetti contenenti i primer di mutagenesi di senso precedentemente diluiti ai pozzetti affini nelle piastre PCR.Utilizzare un sigillo per piastre per coprire ogni piastra PCR e centrifugare a 200 g per due minuti. Quindi, trasferire le piastre PCR su un termociclatore ed eseguire il seguente programma. Dopo aver

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Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

I modelli di proteinopatia del lievito sono strumenti preziosi per valutare la tossicità e l'aggregazione delle proteine implicate nella malattia. Qui, presentiamo i metodi per lo screening delle librerie di varianti Hsp104 per i soppressori di tossicità. Questo protocollo potrebbe essere adattato per lo screening di qualsiasi libreria proteica per soppressori di tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

L&#39;isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Questo manoscritto descrive i protocolli clinici per due pannelli di sequenziamento di nuova generazione. Un pannello interroga le neoplasie ematologiche, mentre l'altro pannello prende di mira i geni comunemente mutati nei tumori solidi. La classificazione molecolare delle mutazioni driver nelle neoplasie umane offre preziose informazioni prognostiche e predittive.

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l'insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Proteine che legano specifiche sequenze di RNA giocano un ruolo critico nell'espressione genica. Caratterizzazione dettagliata di questi siti di legame è cruciale per la nostra comprensione della regolazione genica. Qui, è descritto un approccio passo-passo per mutagenesi di saturazione dei siti di legame delle proteine nel RNA. Questo approccio è rilevante per tutti i siti di legame delle proteine nel RNA.

Un approccio di mutagenesi romanzo saturazione: Unico passaggio caratterizzazione della proteina regolatrice siti in RNA usando fosforotioati di legame

Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'attività proteolitica di una proteasi fatturato intrinsecamente bassa attività, unico in un contesto cellulare. In particolare, questo metodo viene applicato per valutare l'attività proteolitica di PCSK9, un driver chiave del metabolismo lipidico cui attività proteolitica è richiesto per la sua funzione ipercolesterolemici ultimate.

Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato

La specificità della sequenza è fondamentale per la regolazione genica. Le proteine regolatorie che riconoscono sequenze specifiche sono importanti per la regolazione genica. La definizione di siti di legame funzionale per tali proteine è un problema biologico impegnativo. Un approccio iterativo per l'identificazione di un sito di legame per una proteina legante l'RNA è descritto qui ed è applicabile a tutte le proteine che legano l'RNA.

Esplorare lo spazio di sequenza per identificare i siti di legame per le proteine di legame dell'RNA regolamentare

Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.

Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Scopri la valutazione funzionale di biblioteche di mutagenesi satura di proteine utilizzando sequenziamento ad alto rendimento. Questo metodo consente di studiare vincoli biochimici ed evolutivi e ingegnerizzare nuove funzioni proteiche.

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