Diretto Evolution Metodo Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Creazione e screening
April 1st, 2016
Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di mostrare come costruire e selezionare librerie mutanti in Saccharomyces Cerevisiae per esperimenti di evoluzione diretta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'uso della creazione in laboratorio per esperimenti di evoluzione diretta mirati, come ad esempio come assegnare aree sovrapposte per l'assemblaggio e la clonazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua semplicità e robustezza poiché in un solo passaggio di trasformazione è possibile assegnare livelli di buona qualità.
Questo protocollo per la creazione e lo screening di librerie mutanti sarà dimostrato per una fungina aril-alcol ossidasi o AAO. Le regioni per l'evoluzione diretta focalizzata vengono prima scelte con l'aiuto di algoritmi computazionali basati sulla struttura cristallina disponibile o sui modelli di omologia dell'enzima. Due regioni di AAO saranno prese di mira per la mutagenesi casuale e la ricombinazione: la regione M1 e la regione M2.
Verrà eseguita la PCR mutagena per amplificare le aree mirate. Per promuovere lo splicing in vivo nel lievito, verranno create aree sovrapposte tra segmenti di circa 50 coppie di basi ciascuno sovrapponendo reazioni PCR delle regioni definite. Preparare PCR mutagene in volume da 50 microlitri, ciascuna contenente 46 nanogrammi di modello di DNA, 90 nanomolari ciascuno di primer senso e antisenso, 0,3 millimolari di DNTP, 3% di DMSO, 1,5 millimolari di cloruro di magnesio, 05 millimolari di cloruro di manganese e 05 unità per microlitro di na-polimerasi tack.
Utilizzare il seguente programma PCR: 95 gradi Celsius per due minuti, 95 gradi Celsius per 45 secondi, 50 gradi Celsius per 45 secondi e 74 gradi Celsius per 45 secondi per 28 cicli e 74 gradi Celsius per 10 minuti. Il resto del gene AAO, la regione HF, sarà amplificato mediante PCR ad alta fedeltà con le aree corrispondenti sovrapposte ai segmenti mutageni e/o le sporgenze vettoriali linearizzate.
Preparare la PCR ad alta fedeltà in un volume finale di 50 microlitri contenente 10 nanogrammi di DNA stampo, 250 nanomolari ciascuno di primer senso e antisenso, 0,8 millimolari di DNTP, 3% di DMSO e 02 unità per microlitro di DNA polimerasi ad altissima fedeltà iProof. Utilizzare il seguente programma PCR. 98 gradi Celsius per 30 secondi, 98 gradi Celsius per 10 secondi, 55 gradi Celsius per 25 secondi e 72 gradi Celsius per 45 secondi per 28 cicli e 72 gradi Celsius per 10 minuti.
Tutti i frammenti di PCR vengono poi purificati con un kit di estrazione con gel commerciale secondo il protocollo del produttore. Il passo successivo consiste nel linearizzare il vettore per creare regioni fiancheggianti di circa 50 coppie di basi omologhe alle cinque estremità prime e alle tre estremità prime del gene bersaglio. Preparare una miscela di reazione di linearizzazione da 20 microlitri contenente 2 microgrammi di DNA, 7,5 unità di BamH-one, 7,5 unità di XHO-one, 20 microgrammi di BSA e due microlitri di tampone 10x BamH-one.
Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore e 40 minuti. Successivamente, inattivare la reazione a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Per purificare il vettore linearizzato ed evitare la contaminazione con il plasmide circolare residuo, caricare la miscela di reazione di digestione nel mega-pozzetto di un gel di agarosio semi-preparativo a basso punto di fusione.
Caricare cinque microlitri della miscela di reazione nel pozzetto adiacente come reporter. Esegui l'elettroforesi del DNA a quattro gradi Celsius e cinque volt per centimetro tra gli elettrodi. Quindi separare il gel di agarosio corrispondente al mega-pozzetto e conservarlo a quattro gradi Celsius in un XTAE.
Colora la corsia con la scala dei pesi molecolari e il reporter. Visualizza le bande sotto la luce UV e intacca la posizione in cui si posiziona il vettore linearizzato. In assenza di luce UV e utilizzando la guida delle tacche nella corsia del reporter colorato, identificare il vettore linearizzato nel frammento del mega-pozzetto e asportarlo.
Estrarre il vettore linearizzato dall'agarosio e purificarlo con un kit di estrazione su gel commerciale secondo il protocollo del produttore. Successivamente, il vettore linearizzato purificato viene miscelato con i frammenti di PCR e questa miscela di DNA viene utilizzata per trasformare le cellule di lievito competenti utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. Placcare le cellule trasformate su piastre di dropout SC e incubarle a 30 gradi Celsius per tre giorni.
Per prepararsi a questo test, prelevare le singole colonie dalle piastre di dropout SC e trasferirle in piastre da 96 pozzetti contenenti 50 microlitri di terreno minimo per pozzetto. In ogni piastra inoculare la colonna numero sei con il tipo parentale come standard interno. Come controllo negativo, inoculare bene H-one riempito con terreni SC integrati con uracile con cellule viscerali ESI URA3 negative senza plasmide.
Coprite le piastre con i loro coperchi, avvolgetele in pellicola para e incubatele a 30 gradi Celsius in uno shaker umido per 48 ore. Dopo 48 ore, aggiungere 160 microlitri di terreno di espressione in ogni pozzetto e richiudere le piastre. Incubare per altre 24 ore.
Dopo la centrifugazione, le piastre utilizzano una multistazione robotica per la movimentazione dei liquidi per trasferire 20 microlitri di surnatante dai pozzetti di ciascuna piastra a una piastra replica. Aggiungere 20 microlitri di alcol P-metossibenzilico milimolare e 100 millimolari di tampone fosfato di sodio ph 6,0 a ciascun pozzetto. Mescolare brevemente le piastre con un miscelatore a 96 pozzetti e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 160 microlitri di FOX reagant a ciascuna piastra di replica e mescolare brevemente con il mixer. Leggere le piastre a 560 nanometri su un lettore di piastre. Incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando non si sviluppa il colore.
Misurare nuovamente l'assorbimento. L'attività relativa è calcolata dalla differenza tra il valore di assorbimento dopo l'incubazione e quello della misurazione iniziale normalizzato al tipo parentale per ciascuna piastra. Questa immagine rappresentativa del gel mostra il vettore linearizzato nella corsia due, il segmento PCR M1 nella corsia tre, il segmento PCR M2 nella corsia quattro, il segmento PCR HF nella corsia cinque e il vettore riassemblato in vivo linearizzato con NHE uno nella corsia sei.
Il prossimo gel mostra la mini-preparazione del plasmide del vettore riassemblato nella corsia due, il plasmide linearizzato con NHE uno nella corsia tre, il plasmide linearizzato con BamH uno e XHO uno nella corsia quattro e il plasmide linearizzato ottenuto mediante estrazione e purificazione del gel nella corsia cinque. I carichi mutazionali sono stati aggiustati campionando librerie mutanti con diversi paesaggi, calcolando il numero di cloni con meno del 10% dell'attività dell'enzima parentale e un'ulteriore verifica sequenziando un campione casuale di varianti attive e non attive. Una valutazione del limite di rilevabilità di questo test ha mostrato che il test era lineare in presenza di sorbitolo rappresentato da cerchi neri.
In assenza di sorbitolo rappresentato dai quadrati bianchi, la linearità era più persistente ma la risposta era più debole. È stata osservata una correlazione lineare tra la concentrazione di AAO e l'assorbanza. Con questo test è stata costruita una libreria di mutanti di 2.000 cloni.
Il quadrato in ombra indica i mutanti AAO con una secrezione e un'attività notevolmente migliorate contro l'alcol P-metossibenzilico. Una volta masterizzate, le librerie mutanti possono essere create in circa quattro ore se eseguite correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di assegnare le aree di sovrapposizione appropriate per ogni famiglia di PCR e vettore linearizzato per lo splicing e il clonaggio in vivo in un'unica fase di trasformazione.
Seguendo un approccio simile, è possibile eseguire altri metodi come il campionamento del DNA in vivo, la libreria di mutagenesi di saturazione o l'assemblaggio del DNA al fine di costruire librerie mutanti e/o vie metaboliche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della bioingegneria per esplorare attività, stabilità o persino per inventare infiniti tipi di interazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sfruttare questo dispositivo Saccharomyces Cerevisiae per la costruzione e lo screening di biblioteche
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Panoramica
Questo protocollo delinea la costruzione e lo screening di librerie mutanti in Saccharomyces cerevisiae per esperimenti di evoluzione diretta. Enfatizza un approccio semplice che permette una mutagenesi e una ricombinazione efficaci.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biotecnologia
- Ingegneria genetica
- Microbiologia
Sfondo
- L'evoluzione diretta è un metodo utilizzato per sviluppare proteine con caratteristiche desiderabili.
- Saccharomyces cerevisiae serve come organismo modello per questi esperimenti.
- La mutagenesi casuale e la ricombinazione sono tecniche chiave in questo processo.
- Gli algoritmi computazionali aiutano nella selezione delle regioni target per la mutagenesi.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un protocollo per la creazione e lo screening di librerie mutanti.
- Identificare aree sovrapposte per l'assemblaggio e il clonaggio nell'evoluzione diretta.
- Mirate regioni specifiche dell'ossidasi arile-alcol fungina (AAO) per miglioramento.
Metodi utilizzati
- Selezione di regioni target utilizzando algoritmi computazionali.
- Mutagenesi casuale delle regioni M1 e M2 di AAO.
- Screening delle librerie mutanti attraverso una singola fase di trasformazione.
- Valutazione della qualità dei mutanti risultanti.
Risultati principali
- Costruzione di successo di librerie mutanti in Saccharomyces cerevisiae.
- Identificazione di mutanti efficaci con caratteristiche desiderate.
- Dimostrazione della robustezza del protocollo.
- Informazioni sul processo di evoluzione diretta per AAO.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per gli studi di evoluzione diretta.
- Il targeting di regioni specifiche aumenta l'efficienza della mutagenesi.
- Questo approccio può essere applicato a varie proteine oltre AAO.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
