Name: Diretto Evolution Metodo Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Creazione e screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come costruire e selezionare librerie di mutanti in Saccharomyces cerevisiae per esperimenti di evoluzione diretta. Questo metodo computazionale semplice e robusto permette di identificare enzimi con proprietà migliorate in un'unica fase di trasformazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal progetto della Commissione Europea Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; da un Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; e dai Progetti Nazionali Dewry [BIO201343407-R] e Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Biblioteca Edilizia <ol><li> Visita le regioni da sottoporre a MORPHING con l&#39;aiuto di algoritmi di calcolo basati sui modelli di struttura di cristallo o di omologia disponibili 18. <ol><li> Qui, indirizzare due regioni di AAO da Pleurotus eryngii per mutagenesi casuale e ricombinazione (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mentre amplificando il resto del gene (844 bp) di alta fedeltà PCR (Figura 1). Nota: Diversi segmenti possono essere studiati morphing in modo indipendente o combinata 16. </li></ol></li><li> Amplificare le zone interessate dal mutageno PCR. Creare zone tra i segmenti (~ 50 bp ciascuno) si sovrappongono sovrapponendo reazioni PCR delle regioni definite. <ol><li> Preparare mutageno PCR di segmenti target in un volume finale di 50 ml contenenti DNA stampo (0,92 ng / mL), 90 nM oligo senso (RMLN per segmento MI e AAO-BP per il segmento M-II), 90 nM di unntisense Primer (AAO-92C per il segmento MI e RMLC per il segmento M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO), 1,5 mM MgCl 2, 0,05 mM MnCl 2 e 0,05 U / ml Taq DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in Figura 1. </li><li> Utilizzare il seguente programma PCR: 95 ° C per 2 min (1 ciclo); 95 ° C per 45 sec, 50 ° C per 45 sec, 74 ° C per 45 sec (28 cicli); e 74 ° C per 10 min (1 ciclo). </li></ol></li><li> Amplificare le regioni non mutageni con ultra-alto polimerasi fedeltà e comprende anche le zone di sovrapposizione corrispondenti segmenti mutageni e / o sbalzi vettore linearizzati. <ol><li> Preparare miscele di reazione in un volume finale di 50 ml contenente: template DNA (0,2 ng / ml), 250 nM oligo senso HFF, 250 nM oligo antisenso HFR, 0,8 mM dNTP (0,2 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) e 0,02 U / ml iProof DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in &lt;strong&gt; Figura 1. </li><li> Utilizzare il seguente programma PCR: 98 ° C per 30 sec (1 ciclo); 98 ° C per 10 sec, 55 ° C per 25 sec, 72 ° C per 45 sec (28 cicli); e 72 ° C per 10 min (1 ciclo). Nota: Con le condizioni descritte in 1.2 e 1.3 sovrapposizioni di 43 bp (regione plasmide-M1); 46 bp (M1 regione regione-HF); 47 bp (HF regione-M2 regione) e 61 bp (M2 plasmide regione-) sono progettate (Figura 1) per favorire in vivo splicing nel lievito. </li><li> Purificare tutti i frammenti di PCR (mutageni e non mutageni) con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Linearizzare il vettore tale che regioni fiancheggianti di circa 50 bp sono creati che sono omologhi ai 5&#39;- e 3&#39;-estremità del gene bersaglio. <ol><li> Preparare una miscela di reazione linearizzazione contenente 2 mg di DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, 20 mg BSA e 2 ml di tampone Bam HI 10x in un volume finale di 20 ul. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 2 ore e 40 min. Successivamente, procedere con inattivazione a 80 ° C per 20 min. </li></ol></li><li> Purificare il vettore linearizzato mediante estrazione gel di agarosio per evitare la contaminazione con il plasmide circolare residua (Figura 2). <ol><li> Caricare la miscela di reazione di digestione nel mega-well di un basso punto di fusione gel semi-preparativa (0,75%, w: v) e un&#39;aliquota (5 ml) della miscela di reazione nella adiacente e reporter. </li><li> Run DNA elettroforesi (5 V / cm tra gli elettrodi, 4 ᵒC) e separare il gel corrispondente al mega-bene e conservarlo a 4 ᵒC in 1x TAE. </li><li> Macchia la corsia con la scala peso molecolare e il giornalista. Visualizzare le bande sotto la luce UV. Nick la posizione in cui i luoghi linearizzate vettore. Nota: Poiché la qualità del vettore linearizzato purificato è un critiFattore cal per ricombinazione di successo e di assemblaggio nel lievito, evitare di macchiare il gel per semi-preparativa elettroforesi del DNA. L&#39;uso di coloranti e raggi UV per l&#39;estrazione gel può influenzare la stabilità del vettore di DNA, compromettere l&#39;efficienza vivo ricombinazione in. In alternativa ai coloranti EtBr tossici, Gel Rosso e coloranti SYBR sono comunemente usati per il gel di colorazione. </li><li> In assenza di luce UV, di individuare il vettore linearizzato nel frammento mega-pozzetto utilizzando la guida dei nick nella corsia giornalista macchiato in modo che possa essere isolato. </li><li> Estrarre il vettore linearizzato da agarosio e purificarla con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore. Nota: utilizzare ad alta copia vettori navetta episomiale con marcatori di antibiotici e auxotrofia: In questo esempio abbiamo impiegato il uracile indipendente e ampicillina resistenza pJRoC30 vettore, sotto il controllo del promotore di lievito GAL1. </li></ol></li><li> Preparare un mi equimolarexture dei frammenti PCR e mescolare con il vettore linearizzato in un rapporto 2: 1, con non meno di 100 ng di plasmide linearizzato (prova differenti rapporti di biblioteca equimolare / vettore aperta per ottenere buone rese di trasformazione). <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza dei frammenti di PCR e vettore linearizzato a 260 nm e 280 nm per determinare la loro concentrazione e purezza. </li></ol></li><li> Trasformare cellule competenti di lievito con la miscela di DNA utilizzando un kit di lievito di trasformazione commerciale (vedi tabella per le forniture) in base alle istruzioni del produttore. <ol><li> Qui, usare una proteasi carente e URA3 - dipendente S. ceppo cerevisiae, BJ5465. Trasformare le cellule con il vettore circolarizzato parentale come standard interno durante lo screening (vedi sotto). Inoltre, controllare il fondo trasformando il vettore linearizzato in assenza di frammenti di PCR. Nota: In caso di rilevamento di livelli iniziali di secrezione bassi, usare S.cerevisiae proteasi ceppi carenti come BJ5465 per favorire l&#39;accumulo di proteina attiva in sovranatanti. Se l&#39;enzima bersaglio subisce hyperglycosylation, l&#39;uso di ceppi glicosilazione-deficienti (ad esempio, Δ kre2 che è solo in grado di associare piccoli oligomeri mannosio) potrebbe essere una scelta adatta. </li></ol></li><li> Piastra le cellule trasformate su SC piastre di abbandono e incubare a 30 ° C per tre giorni. Piastra (su SC piastre di abbandono integrato con uracile) URA3 - S. cellule cerevisiae prive plasmide come controllo negativo per lo screening (vedi sotto). </li></ol> 2. Alta-Throughput Screening Assay (Figura 3) <ol><li> Riempire un numero appropriato di sterili piastre da 96 pozzetti (23 piastre per analizzare una libreria di cloni 2.000) con 50 microlitri terreno minimo per pozzetto con l&#39;aiuto di un robot pipettamento. </li><li> Scegli singole colonie dalla SC-drop out piatti e trasferirli alle piastre a 96 pozzetti. <ol><li> In ogni piatto, inoculare numero di colonna 6 con il tipo parentale come standard interno e ben H1 con URA3 - S. cellule cerevisiae (in media SC supplementato con uracile) senza plasmide come controllo negativo. Nota: Beh H1 è riempito in particolare con i media di abbandono integrati con uracile. Un supporto vuoto pozzetto contenente senza cellule può essere preparata anche come controllo di sterilità aggiuntivo. </li></ol></li><li> Coprire le piastre con i loro coperchi e avvolgerli in Parafilm. Incubare le piastre per 48 ore a 30 ° C, 225 rpm e 80% di umidità relativa in un agitatore umido. </li><li> Rimuovere il Parafilm, aggiungere 160 ml di mezzo di espressione ad ogni pozzetto con l&#39;aiuto del robot pipettaggio, sigillare le piastre e incubare per altre 24 ore. Nota: terreno minimo e medio espressione sono preparati come riportato altrove 19. livelli di secrezione possono variare a seconda del gene in esame e, di conseguenza, tha incubazione devono essere ottimizzati in ogni caso a sincronizzare la crescita cellulare in tutti i pozzetti. </li><li> Centrifuga i piatti (master) a 2.800 x g per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire 20 ml di surnatante dai pozzetti della piastra master piastra replica utilizzando una movimentazione multistazione robotico liquido. Nota: Per favorire la secrezione di enzimi si consiglia di sostituire il segnale peptide nativo della proteina bersaglio da peptidi segnali comunemente utilizzati per l&#39;espressione eterologa in lievito (ad esempio, il fattore α prepro-leader, il leader del K 1 Killer tossina da S. cerevisiae, o anche versioni chimeriche di entrambi i peptidi 13). In alternativa, il peptide segnale nativo può essere evoluto esclusivamente per la secrezione nel lievito. </li><li> Aggiungere 20 ml di 2 mM p -methoxybenzylalcohol a 100 mM sodio fosfato tampone pH 6.0 con l&#39;aiuto del robot pipettamento. Mescolare le piastre brevemente con un 96-noill mixer piastra e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Con il robot pipettaggio, aggiungere 160 ml di reagente FOX per ciascuna piastra replica e mescolare brevemente con il mixer (concentrazione finale di miscela FOX nel pozzo: 100 mM xilenolo arancio, 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Aggiungere più additivi al reagente per migliorare la sensibilità, come co-solventi organici (DMSO, etanolo, metanolo) o sorbitolo 17. Qui, amplificare la risposta con l&#39;aggiunta di sorbitolo ad una concentrazione finale di 100 mM (Figura 4). </li></ol></li><li> Leggere le piastre (modalità end-point, t 0) a 560 nm su un lettore di piastre. </li><li> Incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando il colore si sviluppa e misurare nuovamente l&#39;assorbimento (t 1). <ol><li> Calcolare l&#39;attività relativa dalla differenza tra il valore Abs dopo incubazione e quella della misurazione iniziale normalizzati al pareTipo ntale per ogni piastra (Dt 1 - t 0). </li></ol></li><li> Sottoporre i migliori successi mutanti a due ri-proiezioni consecutive per escludere falsi positivi. Nota: Tipicamente, ri-proiezioni includono isolamento plasmidico dal lievito, amplificazione e purificazione in Escherichia coli, seguita da trasformazione di cellule di lievito fresco con il plasmide 19. Ogni clone selezionato è ri-proiettato in pentaplicate. </li></ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, abbiamo riassunto la maggior parte dei suggerimenti e trucchi impiegati nel nostro laboratorio per progettare enzimi dalla evoluzione diretta a S. cerevisiae (utilizzando AAO come esempio) in modo che possano essere adattati per l&#39;uso con molti altri sistemi enzimatici eucariotica semplicemente seguendo l&#39;approccio comune descritti qui. In termini di creazione di biblioteca, Morphing è un metodo rapido one-pot di introdurre e ricombinare le mutazioni casu...

Evoluzione molecolare diretto è un metodo affidabile, veloce e affidabile per progettare enzimi 1, 2., Attraverso cicli iterativi di casuali mutazioni, ricombinazione e lo screening, le versioni migliorate di enzimi possono essere generati che agiscono sui nuovi substrati, nelle reazioni romanzo, a non naturale ambienti, o anche per assistere alla cella di raggiungere nuovi obiettivi metabolici 3-5. Tra i padroni di casa utilizzate in evoluzione diretta, di birra lievito Saccharomyces cerevisiae offre un repertorio di soluzioni per l&#39;espressione funzionale di proteine ​​eucariotiche complesse che non sono altrimenti disponibili in controparti procarioti 6,7. Utilizzato esaustivamente in studi di biologia cellulare, questo piccolo modello eucariote ha molti vantaggi in termini di modificazioni post-traduzionali, la facilità di manipolazione e trasformazione di efficienza, che sono tutti tratti importanti per progettare enzimi dalla evoluzione diretta 8. Inoltre, l&#39;alta frequenzadi omologa ricombinazione del DNA a S. cerevisiae accoppiato al suo apparato a prova di lettura efficiente apre una vasta gamma di possibilità per la creazione di una biblioteca e di assemblaggio genica in vivo, favorendo l&#39;evoluzione dei sistemi diversi da singoli enzimi per vie artificiali complessi 9-12. Il nostro laboratorio ha trascorso gli ultimi dieci anni la progettazione di strumenti e strategie per l&#39;evoluzione molecolare di diverse ligninases nel lievito (ossidoriduttasi coinvolti nella degradazione della lignina durante il decadimento legno naturale) 13-14. In questa comunicazione, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e le librerie schermo mutanti in S. cerevisiae per un modello flavooxidase, arile-alcol ossidasi (AAO 15) -, che può essere facilmente tradotto a molti altri enzimi. Il protocollo prevede un metodo di evoluzione mirata-diretto (MORPHING: mutageni organizzata ricombinazione omologa processo da in vivo raggruppamento) assistito dall&#39;apparato cellula di lievito 16, unda test di screening molto sensibile basato sulla reazione di Fenton per rilevare l&#39;attività all&#39;AAO secreta nel brodo di coltura 17.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Terreni di coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinosio pentaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Lievito base azotata senza aminoacidi</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Lievito sintetico drop-out Medium Integratori senza uracile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. Reazioni PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM ciascuno</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polimerasi</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese(II) tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Per errore prono PCR</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>3. Linearizzazione plasmidica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI enzima di restrizione</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione Non I</td> New <td>England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Rosso</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Per la colorazione del DNA</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. Saggi FOX</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) ammonio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Alcool Anysil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX curva standard</td></tr><tr><td>Xilenolo Arancio sale disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. Agarosio gel stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Colorante per l'analisi del DNA</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a bassa temperatura di fusione</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>6. Kit e cellule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae ceppo BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Ceppo carente di proteasi con genotipo: MAT&alfa; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue cellule competenti</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>Per la purificazione e l'amplificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>Estrazione del gel di DNA</td></tr><tr><td>Kit plasmidico NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Kit miniprep a colonna</td></tr><tr><td>Kit di trasformazione del lievito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Incluso vettore di DNA (testicoli di salmone)</td></tr><tr><td>Zymoprep lievito plasmide plasmide miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Estrazione plasmidico da lievito</td></tr><tr><td><forte>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. Piastre</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Polistirene trasparente, non sterile, (per misure di attività)</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)</td></tr><tr><td>Coperchio per piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)</td></tr></tbody></table>

diretto evolution metodo<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant biblioteca creazione e screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae offre molti vantaggi interessanti nella progettazione di enzimi per applicazioni biotecnologiche, un processo che prevede la realizzazione, la clonazione e l&#39;espressione di biblioteche mutante, accoppiato ad alta frequenza omologa ricombinazione del DNA in vivo. Qui, vi presentiamo un protocollo per creare e biblioteche schermo mutanti di lievito in base l&#39;esempio di un fungina aril-alcol ossidasi (AAO) per migliorare la sua attività totale. Due segmenti proteici sono stati sottoposti ad evoluzione focalizzata diretto mediante mutagenesi casuale e in vivo ricombinazione DNA. Le sporgenze di ~ 50 bp fiancheggianti ogni segmento ammessi corretto rimontaggio del gene AAO-fusione in un vettore linearizzato dando luogo ad una completa plasmide autonomamente replicare. Librerie Mutant arricchiti con varianti funzionali AAO sono stati proiettati in S. surnatanti cerevisiae con un saggio ad alta sensibilità basato sulla reazione di Fenton. Il processo generale dicostruzione della libreria a S. cerevisiae qui descritto può essere facilmente applicato ad evolversi molti altri geni eucarioti, evitando reazioni PCR in più, in vitro di ricombinazione del DNA e legatura passi.

AAO da P. eryngii è un flavooxidase extracellulare che fornisce perossidasi fungine con H 2 O 2 per iniziare attaccare lignina. Due segmenti di AAO stati sottoposti a evoluzione focalizzata-diretto da MORPHING al fine di migliorare la sua attività e la sua espressione in S. cerevisiae 19. Indipendentemente dalle enzimi stranieri nutriti da S. cerevisiae, la questione più critica quando la costruzione di librerie di mutanti nel l...

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è mostrare come costruire e analizzare librerie di mutanti in Saccharomyces Cerevisiae per esperimenti di evoluzione diretta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella creazione in laboratorio per esperimenti mirati di evoluzione diretta, come ad esempio come assegnare aree sovrapposte durante l'assemblaggio e il clonaggio. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua semplicità e robustezza, poiché in un solo passaggio di trasformazione è possibile ottenere livelli di qualità elevata.Questo protocollo per la creazione e lo screening di librerie di mutanti verrà dimostrato per un'aril-alcol ossidasi fungina o AAO. Le regioni destinate all'evoluzione diretta mirata vengono innanzitutto scelte con l'aiuto di algoritmi computazionali basati sulla struttura cristallina disponibile o su modelli di omologia dell'enzima. Due regioni dell'AAO saranno bersaglio di mutagenesi casuale e ricombinazione: la regione M1 e la regione M2.La PCR mutagena verrà eseguita per amplificare le regioni bersaglio. Per favorire lo splicing in vivo nel lievito, verranno create aree sovrapposte tra segmenti di circa 50 paia di basi ciascuno sovrapponendo reazioni PCR delle regioni definite. Preparare reazioni PCR mutagene da 50 microlitri, ciascuna contenente 46 nanogrammi di stampo di DNA, 90 nanomolari di primer senso e antisenso, 0,3 millimolari di DNTP, 3% di DMSO, 1,5 millimolari di cloruro di magnesio, 0,5 millimolari di cloruro di manganese e 0,5 unità per microlitro di DNA polimerasi tack.Utilizzare il seguente programma PCR: 95 gradi Celsius per due minuti, 95 gradi Celsius per 45 secondi, 50 gradi Celsius per 45 secondi e 74 gradi Celsius per 45 secondi per 28 cicli, e infine 74 gradi Celsius per 10 minuti. La porzione rimanente del gene AAO, la regione HF, verrà amplificata mediante PCR ad alta fedeltà utilizzando aree corrispondenti che si sovrappongono ai segmenti mutagenici e/o ai prolungamenti del vettore linearizzato inclusi.Preparare la PCR ad alta fedeltà in un volume finale di 50 microlitri contenente 10 nanogrammi di DNA stampo, 250 nanomolar di primer senso e antisenso, 0,8 milimolar di DNTP, 3% di DMSO e 0,2 unità per microlitro di DNA polimerasi iProof ad altissima fedeltà. Utilizzare il seguente programma PCR: 98 gradi Celsius per 30 secondi, 98 gradi Celsius per 10 secondi, 55 gradi Celsius per 25 secondi e 72 gradi Celsius per 45 secondi per 28 cicli, e 72 gradi Celsius per 10 minuti.Tutti i frammenti di PCR vengono quindi purificati utilizzando un kit commerciale di estrazione da gel seguendo il protocollo del produttore. Il passaggio successivo consiste nel linearizzare il vettore per creare regioni adiacenti di circa 50 paia di basi omologhe alle estremità 5' e 3' del gene bersaglio. Preparare una miscela di reazione di linearizzazione da 20 microlitri contenente 2 microgrammi di DNA, 7,5 unità di BamH-uno, 7,5 unità di XHO-uno, 20 microgrammi di BSA e due microlitri di buffer 10x per BamH-uno.Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore e 40 minuti. Successivamente, inattivare la reazione a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Per purificare il vettore linearizzato ed evitare contaminazioni con il plasmide circolare residuo, caricare la miscela di digestione nel mega-poZZetto di un gel di agarosio a basso punto di fusione di tipo semi-preparativo.Caricare cinque microlitri della miscela di reazione nel pozzetto adiacente come reporter. Eseguire l'elettroforesi del DNA a quattro gradi Celsius e cinque volt per centimetro tra gli elettrodi. Successivamente, separare il gel di agarosio corrispondente al mega-pozzetto e conservarlo a quattro gradi Celsius in un XTAE.Colorare la corsia con il marcatore di peso molecolare e il reporter. Visualizzare le bande sotto luce UV e fare un'incisione nella posizione in cui si trova il vettore linearizzato. In assenza di luce UV e utilizzando le incisioni nella corsia del reporter colorata come guida, identificare il vettore linearizzato nel frammento del mega-well ed escinderlo.Estrarre il vettore linearizzato dall'agarosio e purificarlo utilizzando un kit commerciale per l'estrazione da gel, seguendo il protocollo del produttore. Successivamente, il vettore linearizzato purificato viene mescolato con i frammenti PCR e questa miscela di DNA viene utilizzata per trasformare cellule di lievito competenti, impiegando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. Piastrare le cellule trasformate su piastre SC dropout e incubarle a 30 gradi Celsius per tre giorni.Per preparare questo saggio, selezionare singole colonie dalle piastre SC prive di nutrienti e trasferirle in piastre a 96 pozzetti contenenti 50 microlitri di mezzo minimo per ogni pozzetto. In ciascuna piastra, inoculare la colonna numero sei con il tipo parentale come standard interno. Come controllo negativo, inoculare il pozzetto H1, riempito con mezzo SC supplementato con uracile, con cellule viscerali ESI URA3 negative prive di plasmide.Coprire le piastre con i loro coperchi, avvolgerle con pellicola trasparente e incubare a 30 gradi Celsius in uno shaker umido per 48 ore. Dopo 48 ore, aggiungere 160 microlitri di mezzo di espressione in ogni pozzetto e sigillare nuovamente le piastre. Incubare per ulteriori 24 ore.Dopo aver centrifugato le piastre, utilizzare un robot multi-stazione per il trattamento dei liquidi per trasferire 20 microlitri del sopranatante dalle pozzette di ciascuna piastra a una piastra replica. Aggiungere 20 microlitri di alcol p-metossibenzilico 2 millimolare e tampone fosfato di sodio 100 millimolare a pH 6,0 in ogni pozzetta. Mescolare brevemente le piastre con un agitatore per piastre a 96 pozzette e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere 160 microlitri del reagente FOX a ciascuna piastra di replica e mescolare brevemente con il mixer. Leggere le piastre a 560 nanometri su un lettore di piastre. Incubare le piastre a temperatura ambiente fino allo sviluppo del colore.Misurare nuovamente l'assorbanza. L'attività relativa viene calcolata a partire dalla differenza tra il valore di assorbanza dopo l'incubazione e quello della misurazione iniziale, normalizzata rispetto al tipo parentale per ogni piastra. Questa immagine rappresentativa di un gel mostra il vettore linearizzato nella corsia due, il frammento PCR M1 nella corsia tre, il frammento PCR M2 nella corsia quattro, il frammento PCR HF nella corsia cinque e il vettore ricostruito in vivo linearizzato con NHE uno nella corsia sei.Questo gel successivo mostra, nel pozzetto due, il mini-prep plasmidico del vettore ricomposto; nel pozzetto tre, il plasmide linearizzato con NHE uno; nel pozzetto quattro, il plasmide linearizzato con BamH uno e XHO uno; e nel pozzetto cinque, il plasmide linearizzato ottenuto mediante estrazione da gel e purificazione. Il carico di mutazioni è stato aggiustato campionando librerie di mutanti con diversi paesaggi genetici, calcolando il numero di cloni con un'attività enzimatica inferiore al 10% rispetto all'enzima parentale, e mediante ulteriore verifica tramite sequenziamento di un campione casuale di varianti attive e non attive. Una valutazione del limite di rilevazione di questo saggio ha mostrato che il saggio era lineare in presenza di sorbitolo, rappresentato dai cerchi neri.In assenza di sorbitolo, rappresentata dai quadrati bianchi, la linearità è risultata più persistente ma la risposta era più debole. È stata osservata una correlazione lineare tra la concentrazione di AAO e l'assorbanza. È stata costruita e sottoposta a screening una libreria di mutanti composta da 2.000 cloni mediante questo saggio.Il quadrato ombreggiato indica i mutanti di AAO con una secrezione e un'attività notevolmente migliorate contro l'alcol p-metossibenzilico. Una volta acquisita padronanza, le librerie di mutanti possono essere preparate in circa quattro ore, se l'operazione viene eseguita correttamente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di assegnare aree di sovrapposizione appropriate per ciascuna famiglia di PCR e per il vettore linearizzato, al fine di consentire lo splicing e il clonaggio in vivo in un unico passaggio di trasformazione.Seguendo un approccio simile, è possibile eseguire altri metodi come il campionamento del DNA in vivo, la libreria di mutagenesi per saturazione o l'assemblaggio del DNA al fine di costruire librerie di mutanti e/o percorsi metabolici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria biologica per esplorare attività, stabilità o addirittura inventare infiniti tipi di interazioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sfruttare questo dispositivo di Saccharomyces cerevisiae per la costruzione e lo screening di librerie.

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Un nuovo metodo evoluzione diretta specifico campo dell'ingegneria termostabilità stato sviluppato e validato per conseguenza enzimi bacteriolytic. Dopo un solo ciclo di mutagenesi casuale, un enzima evoluta bacteriolytic, PlyC 29C3, visualizzato superiore a due volte l'attività residua rispetto alla proteina wild-type, dopo incubazione temperatura elevata.

Un nuovo metodo di screening per l&#39;Evoluzione diretta di enzimi termostabili bacteriolytic

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico.  Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Le endonucleasi di restrizione con nuova specificità della sequenza possono essere sviluppate da enzimi che riconoscono una sequenza parzialmente degenerata. Qui forniamo un protocollo dettagliato che abbiamo usato con successo per alterare la specificità della sequenza dell'enzima NlaIV. Gli ingredienti chiave del protocollo sono la compartimentazione in vitro della reazione di trascrizione/traduzione e la selezione di varianti con nuove specificità di sequenza.

In Vitro Diretto Evoluzione di una restrizione Endonucleato con più stringente specificità

Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell'interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione della superficie del lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse.

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Scopri come costruire e selezionare librerie di mutanti in Saccharomyces cerevisiae per esperimenti di evoluzione diretta. Questo metodo computazionale semplice e robusto permette di identificare enzimi con proprietà migliorate in un'unica fase di trasformazione.

Diretto Evolution Metodo

Esplora altri video