Name: Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di Escherichia Coli Utilizzando matrici sintetiche genetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Scopri la tecnologia eSGA per mappare le reti di interazione genica in Escherichia coli. Questo metodo ad alto rendimento permette di identificare relazioni funzionali tra geni batterici e vie metaboliche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Genome Canada, l&#39;Ontario Institute Genomica e Istituti canadesi di borse di ricerca per la salute e JG AE AG è un destinatario della borsa di studio Vanier Canada Graduate.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo delineato un graduale protocollo per l&#39;utilizzo di robot per studiare lo screening eSGA funzioni geniche batteriche a livello percorso interrogando GI. Questo approccio può essere utilizzato per studiare singoli geni sia interi sistemi biologici in E. coli. Cura l&#39;esecuzione delle fasi sperimentali di cui sopra, tra cui tutti i controlli del caso, e rigorosamente in maniera indipendente l&#39;analisi e la validazione dei dati GI sono aspetti chiave per il successo di eSGA nel fare nuove scoperte...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;I. Antibiotici&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;2. Mezzo Luria-Bertani&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>polvere di LB</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;3. Ceppi batterici e plasmidi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ceppo Hfr Cavalli &amp;#955;&lt;sub&gt;rosso&lt;/sub&gt; sistema (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Centro di Genetica, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Raccolta del ricevente F-</td><td>Progetto Nazionale di Risorse Biologiche (NBRP) del Giappone&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ipoporfico &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F- ceppi con etichetta SPA</td><td>Open biosistemi; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;4. Primer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Primer costanti desalati basati su pKD3</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Primer personalizzati desalati</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Primer personalizzati desalati</td><td></td><td></td><td>F2 e R2: regioni costanti di 20 nt basate sulla sequenza pKD3 e regioni di omologia personalizzate di 45 nt&lt;br/&gt; regione costante F2&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; Regione costante R2&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 e S2: regioni costanti di 27 nt per l'innesco dell'amplificazione del cassetto SPA-Cm e regioni di omologia personalizzate di 45 nt&lt;br/&gt; regione costante S1&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'&#039;&lt;br/&gt; regione costante S2&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F e KOCO-C: primer di 20 nt posizionati a 200 bp dal sito di delezione del gene non essenziale o del gene essenziale&lt;br/&gt; sito di inserimento del marcatore genico SPA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;5. Reagenti per PCR ed elettroforesi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Tampone PCR 10X</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di carico</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>Tampone TBE 10X</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>ladder di DNA</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;6. Kit per l'isolamento e la purificazione del DNA&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit per l'isolamento e la purificazione del DNA genomico</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;7. Attrezzatura per PCR, trasformazione e replica-pinning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Termostato cycler</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvetta per elettroporazione da 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;Agitatore per bagnomaria a 37 °C</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;incubatrice per piastre C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDA robot da banco</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pad con densità di pin 96, 384 e 1.536</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 o 384 perni lunghi</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;8. Attrezzature per l'Immagini&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Supporto per videocamera</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale, 10 megapixel</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatole luminose, Testrite 16&quot; x 24&quot; unità</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;9. Riciclo di piastre o tamponi &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>candeggiante al 10%</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanolo al 70%</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata sterile</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada ultravioletta</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;10. Materiale di laboratorio&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tubi in polipropilene da 50 ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubi microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml beute coniche</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubi sterili per coltura da 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Vial criogenici</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Piastre rettangolari</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre microtitolazione a 96 pozzetti e a 384 pozzetti</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Rullo per la sigillatura di piastre a pozzetti multipli</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>piastre</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Sigilli adesivi per piastre</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;congelatore C</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; escherichia coli</em&gt; utilizzando matrici sintetiche genetiche

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenotipi sono determinati da una serie complessa di fisica (ad esempio proteina-proteina) e funzionali (ad esempio gene-gene o genetico) interazioni (GI) 1. Mentre interazioni fisiche in grado di indicare quali proteine ​​batteriche sono associati come complessi, non necessariamente rivelano percorso a livello di relationships1 funzionali. GI schermi, in cui si misura la crescita dei doppi mutanti recanti due geni cancellati o inattivato e rispetto ai corrispondenti singoli mutanti, in grado di illuminare le dipendenze epistatiche tra loci e, quindi, fornire un mezzo per interrogare e scoprire nuove relazioni funzionali 2. Mappe a grande scala GI sono stati riportati per gli organismi eucarioti, come lievito 3-7, ma le informazioni GI rimangono sparse per procarioti 8, che ostacola l&#39;annotazione funzionale dei genomi batterici. A tal fine, noi e altri hanno sviluppato high-throughput quantitative batteriche metodi di screening GI 9, 10 </sup&gt;. Qui, presentiamo i passaggi chiave necessari per eseguire quantitativa E. coli sintetico Genetic Array (eSGA) Procedura di screening su un genoma scala 9, utilizzando naturale coniugazione batterica e ricombinazione omologa per generare sistemica e misurare l&#39;idoneità di un gran numero di doppi mutanti in un formato matrice colonia. Brevemente, un robot è utilizzato per trasferire , attraverso la coniugazione, cloramfenicolo (Cm) - segnato da alleli mutanti Hfr ingegneria (ad alta frequenza di ricombinazione) &#39;ceppi donatori in un array ordinato di kanamicina (Kan) - marcati F-destinatario ceppi. In genere, si usa la perdita di funzione singoli mutanti recanti non essenziali delezioni del gene (ad esempio, la collezione &#39;Keio&#39; 11) e le mutazioni geniche essenziali hypomorphic alleli (cioè conferiscono ridotta espressione della proteina, la stabilità, o attività 9, 12, 13) a interrogare le associazioni funzionali di geni non essenziali ed essenziali, resture rispettivamente. Dopo coniugazione mediata e conseguente scambio genetico mediante ricombinazione omologa, i mutanti risultanti doppie sono selezionati su terreno solido contenente entrambi gli antibiotici. Dopo conseguenza, le piastre vengono create digitalmente delle immagini e le dimensioni delle colonie sono quantitativamente valutato con un proprio sistema automatico di elaborazione delle immagini 14. IG si rivelano quando il tasso di crescita di un doppio mutante o è significativamente migliore o peggiore del previsto 9. Aggravanti (o negativo) GIS spesso il risultato tra la perdita-di-funzione mutazioni in coppie di geni provenienti da percorsi di compensazione che incidono sullo stesso processo essenziale 2. Qui, la perdita di un singolo gene è tamponata, in modo tale che sia mutante singolo è praticabile. Tuttavia, la perdita di entrambi i percorsi è deleteria e provoca letalità sintetica o malattia (ovvero crescita lenta). Viceversa, alleviare (o positivo) possono verificarsi interazioni tra i geni della via stessa o proteina complessa 2 comedelezione del gene o da solo è spesso sufficiente a perturbare la normale funzione della via o complesso tale che perturbazioni supplementari non ridurre l&#39;attività, e quindi la crescita, ulteriormente. Nel complesso, l&#39;identificazione sistematica e l&#39;analisi delle reti GI in grado di fornire, località turistiche, mappe globali delle relazioni funzionali tra un gran numero di geni, da cui percorso informazioni a livello di perdere per altri approcci possono dedurre 9.

I GI rivelano relazioni funzionali tra geni. Analogamente, poiché i geni appartenenti allo stesso percorso mostrano profili di GI simili e la similarità del profilo di GI rappresenta la congruenza dei fenotipi, possiamo raggruppare i geni funzionalmente correlati in percorsi attraverso il clustering dei loro profili di GI. L'integrazione delle reti di GI e di correlazione tra GI con informazioni sulle interazioni fisiche o altri dati associativi, come le relazioni di contesto genomico (GC), può inoltre rivelare l'organiz...

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Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

I fenotipi sono determinati da una serie complessa di interazioni fisiche (ad es. proteina-proteina) e funzionali (ad es. gene-gene o genetiche) (GI)1. Mentre...

L'obiettivo di questa procedura è studiare le relazioni funzionali tra geni e percorsi metabolici batterici. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando delle matrici di ceppi di ceia coli, ciascuno con una mutazione singola, che verranno sottoposti a coniugazione o accoppiamento. Il secondo passaggio consiste nella coniugazione dei mutanti singoli in formato matrice su piastre.Successivamente, si selezionano i mutanti doppi. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire le immagini delle piastre con mutanti doppi e nel quantificare le colonie di mutanti doppi per determinare il fitness dello ceppo. Infine, i dati sulla dimensione delle colonie vengono analizzati per calcolare i punteggi di interazione genetica e identificare geni, vie e processi funzionalmente interagenti.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mutagenesi casuale, è che possono essere create numerose ceppi mutanti doppi individuali. Inoltre, le interazioni tra molti geni possono essere valutate simultaneamente indipendentemente dalla dimensione del gene, dall'essenzialità o dalla fitness del mutante singolo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali n

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