Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di Escherichia Coli Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Lo scopo di questa procedura è quello di studiare le relazioni funzionali tra geni e vie batteriche. Ciò si ottiene preparando prima una serie di ceia coli, singoli ceppi mutanti che verranno coniugati o accoppiati. Il secondo passo consiste nel coniugare i singoli mutanti in un formato array su piastre.

Successivamente, vengono selezionati i doppi mutanti. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare le piastre a doppio mutante e quantizzare le colonie di doppi mutanti per determinare l'idoneità alla deformazione. Infine, i dati sulle dimensioni delle colonie vengono analizzati per calcolare i punteggi di interazione genetica e identificare geni, percorsi e processi funzionalmente interagenti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la mutagenesi casuale, è che è possibile creare molti singoli ceppi di doppi mutanti. Inoltre, le interazioni tra molti geni possono essere valutate simultaneamente indipendentemente dalla dimensione del gene, dall'essenzialità o dalla fitness del singolo gene mutante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi, come quelle relative alle funzioni geniche e al crosstalk funzionale tra percorsi e processi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle infezioni batteriche perché la conoscenza della maggior parte dei geni e dei processi funzionalmente centrali, nonché la comprensione di quali combinazioni di geni, percorsi e processi batterici quando perturbati migliorano o riducono la fitness batterica aiuteranno a sviluppare le strategie di intervento più efficaci per iniziare questo protocollo. Nidificato in due passaggi. L'amplificazione PCR viene impiegata per sostituire il frame di lettura aperto target con un marcatore di resistenza al cloramfenicolo dal plasmide PKD tre, come descritto nella procedura scritta.

Confermare il prodotto atteso e la PCR purificare il frammento ottenuto seguendo il protocollo del produttore. Dopo aver eluito il prodotto PCR in 30 microlitri di acqua distillata sterile, diluire a circa 50 milligrammi per microlitro di concentrazione. Il prodotto purificato viene conservato a meno 20 gradi Celsius prima della trasformazione.

Successivamente, preparare le cellule competenti ad alta frequenza di ricombinazione o HFR Caval per la costruzione del donatore. Per prima cosa inoculare un millilitro di una coltura notturna satura del ceppo HFR Cavalli in 70 millilitri di terreno LB fresco con 35 microlitri di 50 milligrammi per millilitro. Ampicillina in un pallone da 250 millilitri.

Incubare la coltura a 32 gradi Celsius agitando delicatamente a 220 giri/min fino ad ottenere una densità ottica di circa 0,5-0,6. Quindi trasferire la coltura in un bagno d'acqua per l'induzione del calore del sistema di ricombinazione Lambda Red a 42 gradi Celsius per 15 minuti con agitazione a 160 giri/min per arrestare l'induzione. Trasferire la coltura in un bagnomaria di ghiaccio ghiacciato raffreddato per 10-20 minuti a 160 giri/min.

Assicurati di mantenere le celle fredde fino a dopo la trasformazione. Dopo aver lavato e raccolto le cellule mediante centrifugazione come descritto nel protocollo scritto, decantare la senna e risospendere il pellet in 500 microlitri di glicerolo Eloqua ghiacciato al 10%. Le celle in volumi da 50 microlitri in singole provette pre-raffreddate da 1,5 millilitri e procedono immediatamente alla trasformazione.

Aggiungere 100 nanogrammi di delezione genica purificata, cassetta alle cellule competenti. Muovi il tubo e lascia che la sospensione rimanga sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi trasferire la sospensione in un elettro veterinario per elettroporazione pre-raffreddato, azionare immediatamente la miscela di celle.

Aggiungere un millilitro di terreno SOC a temperatura ambiente e trasferire le cellule elettroporate nel terreno in una provetta di coltura da 15 millilitri. Incubare le cellule a 32 gradi Celsius per un'ora con agitazione orbitale a 220 giri/min. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule di 4, 400 volte G per cinque minuti.

A temperatura ambiente, rimuovere circa 850 microlitri di supinato e risospendere il pellet di cella nel liquido rimanente. Distribuire le cellule su piastre LB contenenti 17 microgrammi per millilitro, cloramfenicolo e incubare a 32 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente strisciare due singoli trasformanti su piastre di cloramfenicolo LB per la conferma mutante strisciare gli stessi trasformanti su piastre di micina LB può confermare che i ceppi non sono resistenti alla micina.

Successivamente, il DNA viene amplificato con tre diversi set di primer di conferma knockout come descritto nel protocollo scritto. Il primo set di primer è costituito da un primer anteriore fiancheggiante a 20 nucleotidi situato 200 paia di basi a monte della regione bersaglio e da un primer inverso, che è complementare alla cassetta di resistenza al cloramfenicolo. Si prevede che questa amplificazione produca un amplicone a 445 nucleotidi.

Il secondo set include un primer in avanti, una sequenza di cassette di resistenza al cloramfenicolo in ginocchio e un primer di conferma per il fiancheggiamento inverso, progettato per anelare 200 paia di basi a valle delle tre estremità prime del gene deleto. Si prevede che questa reazione di amplificazione produca un amplicone a 309 nucleotidi. La terza PCR contiene primer di fiancheggiamento sia a monte che a valle.

Questa reazione è necessaria per confermare che il ceppo selezionato non è un diploide midollare con un locus genico sostituito dalla cassetta e un altro duplicato, ma per il resto una copia genica wild type ancora presente. Si prevede che questa amplificazione produca un prodotto da 1,4 KB. La collezione di mutanti di delezione genica non essenziale e coli ke io è replica pind roboticamente a 24 384.

Bene, micropiastra contenente 80 microlitri di terreno LB liquido per pozzetto. Integrata con 50 microgrammi per millilitro di micina per fare spazio al ceppo di controllo delle frontiere, che mancava come controllo positivo e aiutava nelle normalizzazioni delle piastre e nella quantizzazione automatizzata delle colonie. Rimuovere il terreno inoculato dai pozzetti più esterni di ciascuna piastra e trasferirlo in nuove piastre, lasciando vuoti i pozzetti più esterni.

Allo stesso modo, crea punti di controllo negativi rimuovendo due ceppi da una posizione diversa all'interno di ciascuna piastra e trasferendo i ceppi su una nuova piastra. Quindi, riempire i pozzetti vuoti, compresi i pozzetti di controllo dei confini e i pozzetti di controllo negativo, con terreni LV contenenti 17 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Ci si aspetta che questi punti di controllo negativi siano vuoti nel ricevente e quindi doppie piastre mutanti.

Servono a garantire che non si verifichino errori di elaborazione o di manipolazione delle lastre durante la numerazione, l'imaging o l'appuntamento delle lastre. Dopo aver preparato il ceppo positivo al bordo come descritto nella procedura scritta, i ceppi dell'array e il ceppo positivo al bordo vengono coltivati durante la notte a 32 gradi Celsius con agitazione orbitale a 190 giri/min il giorno successivo, riempiono i pozzetti del bordo con circa 80 microlitri della coltura notturna. Le piastre assemblate possono essere utilizzate per l'accoppiamento come descritto nella sezione successiva.

In alternativa, per la conservazione a lungo termine, ogni pozzetto nelle piastre riceventi viene integrato con glicerolo al 15% e il terreno e il glicerolo vengono miscelati. Le piastre vengono quindi conservate a meno 80 gradi Celsius. Iniziare la procedura di accoppiamento coltivando il ceppo del donatore HFR, recante la delezione del gene query contrassegnata con cassetta di resistenza al cloramfenicolo durante la notte a 32 gradi Celsius in terreno liquido LB ricco con 17 microgrammi per millilitro di pin cloramfenicolo.

Il TH ha ordinato la raccolta di mutanti riceventi in 3 84 densità di colonie su piastre LB solide. Integrato con 50 microgrammi per millilitro di micina in lattina. In parallelo pin il ceppo mutante query donatore in 3 84 densità di colonie sullo stesso numero di piastre LB.

Integrato con 17 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Incubare le piastre per una notte a 32 gradi Celsius per coniugare i ceppi. Fissare il donatore dalle 3 piastre del donatore notturno della colonia 84 su piastre LB solide.

Quindi appuntare i ceppi da una singola piastra ricevente notturna di 3 84 colonie sui donatori appena appuntati. Incubare le piastre di coniugazione appuntate a 32 gradi Celsius per 16-24 ore. Quindi, appuntare ciascuna piastra di coniugazione a densità 384 su una singola piastra LB solida contenente cloramfenicolo.

E la micina può ripetere questo processo fino a quando tutte le placche di coniugazione non sono state appuntate? Incubare le prime piastre di selezione appena appuntate per 16-36 ore a 32 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, riappuntare ogni prima piastra di selezione su una seconda piastra di selezione a doppia droga in formato 1536 SPOT in modo che ogni prima colonia di selezione sia rappresentata da quattro colonie.

Sulla seconda piastra di selezione, incubare le piastre per 16-36 ore. A 32 gradi oss fotografare le piastre di selezione dei doppi mutanti finali per misurare quantitativamente la fitness di crescita dei mutanti e per analizzare le interazioni tra le coppie di geni. Poiché i geni nello stesso percorso mostrano modelli gastrointestinali strettamente correlati, i geni funzionalmente correlati possono essere raggruppati raggruppandoli in base alla somiglianza complessiva dei loro profili di punteggio S.

La somiglianza del profilo gastrointestinale rappresenta la congruenza dei fenotipi in seguito alla mutazione di due geni e dovrebbe essere indicativa del fatto che i due geni agiscano nella stessa via o in una via sovrapposta. Qui viene mostrata la distribuzione dei coefficienti di correlazione tra i profili GI delle coppie di geni che codificano proteine fisicamente interagenti rispetto alle coppie di geni estratti casualmente. Un esempio di scatterplot di profili genetici correlati per due trasportatori che formano un complesso eterotrimerico necessario per l'escrezione degli spermatozoi è mostrato come con l'esibizione del gene dell'ecolina del lievito.

Alleviare le interazioni con profili gastrointestinali altamente correlati tende a codificare percorsi che sono fisicamente associati o che agiscono in modo coerente in un percorso biochimico comune. Qui viene mostrato un esempio rappresentativo in cui i componenti delle vie di biosintesi del ferro e dello zolfo ISC e SUF, funzionalmente ridondanti, che partecipano congiuntamente a un processo essenziale, formano cluster distinti che sono collegati tra loro da estese interazioni aggravanti. Una misura statistica può essere utilizzata per trovare un arricchimento significativo per le interazioni tra specifiche combinazioni di percorsi, l'integrazione delle reti GI con le interazioni fisiche e altri dati di associazione funzionale, come il contesto genomico.

Le relazioni possono rivelare l'organizzazione di moduli funzionali di ordine superiore che definiscono i sistemi biologici fondamentali nei batteri. La cluster analysis può essere applicata anche alle reti GI per prevedere le funzioni dei geni annotati. Poiché gli algoritmi di clustering variano.

Tuttavia, le assegnazioni funzionali putative determinate attraverso il clustering richiedono una verifica sperimentale indipendente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere tutti i positivi e i negativi necessari Seguendo questa procedura. Altri metodi come la proteomica, gli esperimenti di follow-up biochimico e la genomica chimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su specifiche funzioni geniche e sulla natura delle relazioni funzionali tra geni e percorsi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire ceppi doppi mutanti, assemblare array di riceventi ed eseguire screening ESGA per studiare le relazioni funzionali tra geni e processi nell'e coli.