Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di Escherichia Coli Utilizzando matrici sintetiche genetiche

L'obiettivo di questa procedura è studiare le relazioni funzionali tra geni e percorsi metabolici batterici. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando delle matrici di ceppi di ceia coli, ciascuno con una mutazione singola, che verranno sottoposti a coniugazione o accoppiamento. Il secondo passaggio consiste nella coniugazione dei mutanti singoli in formato matrice su piastre.

Successivamente, si selezionano i mutanti doppi. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire le immagini delle piastre con mutanti doppi e nel quantificare le colonie di mutanti doppi per determinare il fitness dello ceppo. Infine, i dati sulla dimensione delle colonie vengono analizzati per calcolare i punteggi di interazione genetica e identificare geni, vie e processi funzionalmente interagenti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mutagenesi casuale, è che possono essere create numerose ceppi mutanti doppi individuali. Inoltre, le interazioni tra molti geni possono essere valutate simultaneamente indipendentemente dalla dimensione del gene, dall'essenzialità o dalla fitness del mutante singolo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dei sistemi, come quelle relative alle funzioni geniche e al dialogo funzionale tra percorsi e processi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle infezioni batteriche, poiché la conoscenza dei geni e dei processi funzionalmente più centrali, nonché la comprensione di quali combinazioni di geni, vie e processi batterici, quando alterati, migliorano o riducono il fitness batterico, contribuiranno a sviluppare strategie di intervento più efficaci. Per iniziare questo protocollo, si utilizza un'amplicazione PCR nidificata in due passaggi per sostituire il frame di lettura aperto bersaglio con un marcatore di resistenza al cloramfenicolo proveniente dal plasmide PKD3, come descritto nella procedura scritta.

Verificare il prodotto previsto e purificare il frammento ottenuto mediante PCR seguendo il protocollo del produttore. Dopo l'eluzione del prodotto PCR in 30 microlitri di acqua distillata sterile, diluire fino a una concentrazione di circa 50 milligrammi per microlitro. Il prodotto purificato viene conservato a meno 20 gradi Celsius prima della trasformazione.

Successivamente, preparare le cellule competenti ad alta frequenza di ricombinazione o HFR Caval per la costruzione del donatore. Inoculare innanzitutto un millilitro di una coltura satura della notte precedente del ceppo HFR Cavalli in 70 millilitri di mezzo LB fresco con 35 microlitri di ampicillina 50 milligrammi per millilitro in un matraccio da 250 millilitri.

Incubare la coltura a 32 gradi Celsius agitando delicatamente a 220 giri al minuto fino a raggiungere una densità ottica compresa tra 0,5 e 0,6. Successivamente, trasferire la coltura in un bagno termico a 42 gradi Celsius per l'induzione termica del sistema di ricombinazione Lambda Red per 15 minuti con agitazione a 160 giri al minuto per arrestare l'induzione. Trasferire quindi la coltura in un bagno di ghiaccio tritato per 10-20 minuti a 160 giri al minuto.

Assicurarsi di mantenere le cellule fredde fino al termine della trasformazione. Dopo aver lavato e raccolto le cellule mediante centrifugazione come descritto nel protocollo scritto, decantare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di glicerolo al 10% freddo sul ghiaccio, in soluzione Eloqua. Distribuire le cellule in volumi di 50 microlitri in singole provette microcentrifuga da 1,5 millilitro precedentemente raffreddate e procedere immediatamente alla trasformazione.

Aggiungere 100 nanogrammi di cassetta di delezione genica purificata alle cellule competenti. Agitare leggermente il tubo e lasciare riposare la sospensione sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, trasferire la sospensione in un elettroporatore pre-raffreddato ed eseguire immediatamente l'elettroporazione della miscela cellulare.

Aggiungere un millilitro di mezzo SOC a temperatura ambiente e trasferire le cellule elettroporate nel mezzo in un tubo da coltura da 15 millilitri. Incubare le cellule a 32 gradi Celsius per un'ora con agitazione orbitale a 220 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule a 4.400 × g per cinque minuti.

A temperatura ambiente, rimuovere circa 850 microlitri del sopranatante e risospendere il pellet cellulare nel liquido rimanente. Distribuire le cellule su piastre di LB contenenti cloramfenicolo a 17 microgrammi per millilitro e incubare a 32 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, effettuare un'isolazione su coloni di due trasformanti singoli su piastre di LB con cloramfenicolo per confermare il mutante; effettuare inoltre un'isolazione sugli stessi trasformanti su piastre di LB con canamicina per confermare che i ceppi non siano resistenti alla canamicina.

Successivamente, il DNA viene amplificato con tre diversi set di primer di conferma della delezione come descritto nel protocollo scritto. Il primo set di primer è costituito da un primer forward di 20 nucleotidi situato 200 paia di basi a monte della regione target e da un primer reverse complementare al cassette di resistenza al cloramfenicolo. Questa amplificazione dovrebbe produrre un amplicone di 445 nucleotidi.

Il secondo set comprende un primer diretto, complementare alla sequenza del cassetta di resistenza al cloramfenicolo, e un primer di conferma del tratto laterale inverso, progettato per annealare 200 paia di basi a valle dell'estremità 3' del gene eliminato. Si prevede che questa reazione di amplificazione produca un amplicone di 309 nucleotidi. La terza PCR contiene entrambi i primer laterali a monte e a valle.

Questa reazione è necessaria per confermare che il ceppo selezionato non sia un diploide marziale in cui un locus genico sia stato sostituito dal cassette e un altro copia selvatica ancora presente. Questa amplificazione dovrebbe produrre un prodotto di 1,4 kb. La collezione di mutanti con delezione singola di geni non essenziali di e coli ke io viene replicata mediante piastramento robotico su piastre 24 384.

Becco, micropiastre contenenti 80 microlitri di terreno LB liquido per pozzetto. Integrate con 50 microgrammi per millilitro di canamicina per ospitare la ceppa di controllo del confine, utilizzata come controllo positivo e utile anche per la normalizzazione delle piastre e per la quantificazione automatica delle colonie. Rimuovere il terreno inoculato dai pozzetti più esterni di ogni piastra e trasferirlo su nuove piastre, lasciando vuoti i pozzetti più esterni.

Allo stesso modo, creare punti di controllo negativo rimuovendo due ceppi da una posizione diversa all'interno di ciascuna piastra e trasferendo i ceppi su una nuova piastra. Successivamente, riempire le pozzette vuote, inclusi i pozzetti di controllo perimetrali e i pozzetti di controllo negativo, con mezzo LV contenente 17 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Ci si aspetta che questi punti di controllo negativo siano vuoti nel ricevente e quindi nelle piastre doppio mutante.

Serve a garantire l'assenza di errori di elaborazione o di manipolazione delle piastre durante la numerazione, l'acquisizione di immagini o il posizionamento delle piastre. Dopo aver preparato il ceppo positivo del bordo come descritto nella procedura scritta, i ceppi dell'array e il ceppo positivo del bordo vengono coltivati per tutta la notte a 32 gradi Celsius con agitazione orbitale a 190 giri al minuto; il giorno seguente, riempire i pozzetti del bordo con circa 80 microlitri della coltura ottenuta dopo la notte di crescita. Le piastre assemblate possono essere utilizzate per l'accoppiamento come descritto nella sezione successiva.

In alternativa, per la conservazione a lungo termine, ogni pozzetto nelle piastre riceventi viene integrato con il 15% di glicerolo e il mezzo e il glicerol vengono mescolati. Le piastre vengono quindi conservate a meno 80 gradi Celsius. Iniziare la procedura di incrocio coltivando la ceppa donatrice HFR, portatrice della delezione genica in esame marcata con un cassetta di resistenza al cloramfenicolo, in coltura liquida ricca LB a 32 gradi Celsius per tutta la notte in presenza di 17 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo.

La collezione di mutanti ricettori TH ordinata è stata seminata in densità di 3 84 colonie su piastre solide di LB, supplementate con 50 microgrammi per millilitro di canamicina. In parallelo, il ceppo mutante donatore di interrogazione è stato inoculato in densità di 3 84 colonie su un numero uguale di piastre LB.

Supplementato con 17 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Incubare le piastre durante la notte a 32 gradi Celsius per coniugare i ceppi. Trasferire il donatore dalle piastre donatrici notturne da 84 colonie su piastre di LB solido.

Quindi, trasferisca le ceppi da una singola piastra recettore da 384 colonie, coltivate per una notte, sopra i donatori appena trasferiti. Incubare le piastre di coniugazione trasferite a 32 gradi Celsius per 16-24 ore. Successivamente, trasferisca ciascuna piastra di coniugazione in densità 384 su una singola piastra solida di LB contenente cloramfenicolo.

E può mycin ripetere questo processo fino a quando tutte le piastre di coniugazione sono state pinzate? Incubare le piastre della prima selezione appena pinzate per 16-36 ore a 32 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, ripinzare ciascuna piastra della prima selezione su una seconda piastra con doppia selezione farmacologica in formato 1536 SPOT, in modo che ciascuna colonia della prima selezione sia rappresentata da quattro colonie.

Sulla seconda piastra di selezione, incubare le piastre per 16-36 ore. A 32 gradi, fotografare le piastre finali di selezione per il doppio mutante per misurare quantitativamente la capacità di crescita dei mutanti e analizzare le interazioni tra coppie di geni. Poiché i geni appartenenti allo stesso percorso mostrano profili di GI strettamente correlati, i geni funzionalmente correlati possono essere raggruppati raggruppandoli in base alla somiglianza complessiva dei loro profili di punteggio S.

La similarità del profilo GI rappresenta la congruenza dei fenotipi in seguito alla mutazione di due geni e dovrebbe indicare se i due geni agiscono nello stesso percorso o in percorsi sovrapposti. Qui viene mostrata la distribuzione dei coefficienti di correlazione tra i profili GI di coppie di geni che codificano per proteine che interagiscono fisicamente rispetto a coppie di geni estratte casualmente. Viene mostrato un esempio di grafico a dispersione di profili genetici correlati per due trasportatori che formano un complesso eterotrimerico necessario per l'escrezione degli spermatozoi, come nel caso del gene ecoline del lievito.

Le interazioni allevianti con profili GI altamente correlati tendono a codificare vie che sono fisicamente associate o che agiscono in modo coerente all'interno di una stessa via biochimica. Qui viene mostrato un esempio rappresentativo in cui i componenti delle vie biosintetiche di ferro-zolfo ISC e SUF, funzionalmente ridondanti e coinvolte insieme in un processo essenziale, formano cluster distinti collegati tra loro da numerose interazioni aggravanti. È possibile utilizzare una misura statistica per individuare eventuali arricchimenti significativi di interazioni tra specifiche combinazioni di vie, integrando le reti GI con interazioni fisiche e altri dati di associazione funzionale, come il contesto genomico.

Le relazioni possono rivelare l'organizzazione di moduli funzionali di ordine superiore che definiscono i sistemi biologici fondamentali nei batteri. L'analisi dei cluster può essere applicata anche alle reti GI per prevedere le funzioni dei geni annotati. Poiché gli algoritmi di clustering variano.

Tuttavia, le assegnazioni funzionali presunte determinate mediante clustering richiedono una verifica sperimentale indipendente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di includere tutti i controlli positivi e negativi necessari. Seguendo questo approccio, altri metodi come la proteomica, esperimenti biochimici di conferma e la genomica chimica possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande riguardo le funzioni specifiche dei geni, nonché alla natura delle relazioni funzionali tra geni e vie metaboliche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire ceppi doppiamente mutanti, assemblare array di ceppi riceventi ed eseguire schermate ESGA per indagare le relazioni funzionali tra geni e processi in e coli.