Name: Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri la mutagenesi sito-diretta per studiare interazioni RNA-RNA e RNA-proteina in Escherichia coli. Questo protocollo PCR a due o tre passaggi offre un metodo versatile ed economico per la ricerca genetica.

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Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.

1. selezione vettoriale
<ol><li>Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 - e 3-step.</li>
	<li>Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione.</li>
</ol>2. primer design per sito diretto mutagenesi
<ol><li>Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passaggio 2.2 e la PCR-step 3 Vai al punto 2.3.</li>
	<li>Disegnare primers per PCR 2-step.<ol>
<li>Disegno primer 1 e 3 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.</li>
		<li>Disegno primer 2 per introdurre mutazioni presso le sedi del desiderato e fiancheggiano la mutazione con 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Rendere il primer inverso se la mutazione è stato introdotto all'estremità 5' o in avanti se la mutazione è stato introdotto all'estremità 3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disegnare primers per PCR-step 3.<ol>
<li>Disegno primer 1 e 4 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.</li>
		<li>Disegno primer 2 e 3 di introdurre mutazioni presso sedi desiderata e fiancheggiano la mutazione da 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Primer, 2 e 3 sono invertire complementari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. l'amplificazione di PCR di tipo selvaggio del DNA per la clonazione
Nota: Per informazioni dettagliate sulla PCR, vedere6.
<ol><li>Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 (2-step PCR) o 1 + 4 (3-step PCR) e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere I. prodotto di PCR uso il programma PCR nella tabella 1.</li>
	<li>Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.<ol>
<li>Fare un'agarosi gel soluzione (2%) aggiungendo 2 g di agarosio per 100 mL di Tris-acetato-Acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (TAE) tampone 1x. Sciogliere l'agarosio facendo bollire in un forno a microonde. Aggiungere il bromuro di etidio colorante macchiatura del DNA (a una concentrazione finale di ~ 0,5 µ g/mL) a agarose gel soluzione per la visualizzazione.</li>
		<li>Eseguire il cast del gel dell'agarosi, inserirlo in un'unità di elettroforesi e caricare campioni PCR (mescolati con tintura di caricamento del DNA) e una scala di DNA di dimensioni note. Eseguire campioni a 75 W per 45 minuti, o fino a quando le bande sono separate in modo adeguato e visualizzate le fasce a un tavolo di ultravioletti (UV) o con un gel sistema di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).</li>
	<li>Conservare il DNA purificato a-20 ° C (in tampone Tris-EDTA (TE) – stoccaggio a lungo termine) o a 4 ° C (in dH2O – deposito a breve termine) fino al momento utilizzato nel passaggio 5.</li>
</ol>4. PCR per introdurre sito-diretta di mutazioni nel DNA
<ol><li>PCR per 2-step PCR (Vedi punto 4.2 per PCR-step 3)<ol>
<li>Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 se le mutazioni sono all'estremità 5' o 2 + 3 se le mutazioni sono in 3' fine e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II (Vedi tabella 1 per programma PCR).</li>
		<li>Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).</li>
		<li>Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando usato nel passaggio 5.</li>
		<li>Eseguire PCR6 utilizzando il prodotto di PCR II come l'iniettore con primer 3 se le mutazioni sono nell'estremità 5' o primer 1 se le mutazioni sono in estremità 3' e utilizzano come modello per ottenere il prodotto di PCR III il DNA wild-type (Vedi tabella 1 per programma PCR).</li>
		<li>Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).</li>
		<li>Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR per PCR-step 3<ol>
<li>Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 e 3 + 4 in reazioni separate e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II e III (vedere tabella 1 per programma PCR).</li>
		<li>Convalidare PCRs mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Purificare i prodotti di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).</li>
		<li>Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O).</li>
		<li>Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 4 e utilizzare 2-5 ng di entrambi i prodotti PCR II e III come i modelli (nella stessa reazione) per ottenere IV del prodotto PCR (Vedi tabella 1 per programma PCR).</li>
		<li>Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2. Nota: Non è insolito ottenere diverse bande non corretti (a volte può essere ridotto utilizzando meno modello). Tuttavia, i prodotti di PCR non corretti possono essere ignorati se la band correttamente dimensionata è asportata e gel-estratta.</li>
		<li>Se è corretta, purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).</li>
		<li>Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ricombinazione di wild type e mutanti versioni del DNA nel vettore selezionato
Nota: Per informazioni dettagliate sulla procedura, vedere7.
<ol><li>Digest purificato i prodotti di PCR I e III (da 2-step PCR) e/o IV (da 3-step PCR) usando gli enzimi di restrizione pertinenti.<ol>
<li>In 20 µ l di tampone di digestione 1x con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione, digest 200 ng del prodotto PCR a 37 ° C per 30-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare il prodotto di PCR digerito di estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2 O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.</li>
	<li>Digerire purificata vettoriale con enzimi di restrizione pertinenti e trattare con fosfatasi alcalina per diminuire vettoriale ri-legatura eventi. Non trattare i prodotti di PCR con fosfatasi alcalina.<ol>
<li>In 30 µ l di tampone di digestione con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione e 1 µ l della fosfatasi alcalina, digest 1.000 ng del vettore a 37 ° C per 30-60 min 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vettore digerito separato dal DNA dei rifiuti (ad es., uncut vettoriale e cut-out DNA) mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.</li>
	<li>Purificare il vettore digerito con estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.</li>
	<li>Lega i prodotti di PCR digeriti nel vettore digerito con le reazioni specificate nella tabella 2.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 2 h o una notte a 16 ° C.</li>
	<li>Trasformare ceppo destinatario (ad es., Escherichia coli K12) con reazioni di legatura.<ol>
<li>Crescere il ceppo a OD600= 0.3-0.5 e trasferimento un 1 mL della coltura come molti nelle provette da 1,5 mL come reazioni ligasi.</li>
		<li>Spin a 3.500 x g per 5 min e gettare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di trasformazione (10 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con 0,1 g/mL in polietilene glicole 3350, 5% dimetil solfato e 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Aggiungere la reazione di legatura e posizionare le provette in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Shock termico per 2 min a 42 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di LB le provette da 1,5 mL e permettere l'espressione fenotipica della resistenza agli antibiotico per almeno 45 min a 37 ° C.</li>
		<li>Girare le cellule a 3.500 x g per 5 min, scartare 1 mL di surnatante e risospendere le cellule nel surnatante rimanente.</li>
		<li>Le cellule sulle piastre del piatto con gli antibiotici adatti e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare trasformanti che harboring vettori con successo integrazione dell'inserto di DNA (ad esempio, mediante PCR utilizzando primers specifici del vettore e inserto).</li>
	<li>Convalidare la sequenza del DNA di sanger sequenziamento. Attenzione: Non utilizzare il primer stesso per la sequenza come usato per passo 5.9.</li>
</ol>6. utilizzando vettori costruiti per gli esperimenti in vitro o in vivo
<ol><li>Esperimento in vivo Nota: Questo è un esempio di utilizzo di un vettore per esprimere il tipo selvaggio/mutato RNA per caratterizzare la regolazione post-trascrizionale. Per ulteriori dettagli su macchiarsi occidentale, Vedi8.<ol>
<li>Crescere di ceppi di Escherichia coli K12 con vettori costruiti su mezzo adeguato e indurre l'espressione se necessario. Raccolta campioni mediante centrifugazione.</li>
		<li>Preparare i campioni per elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) sciogliendo il pellet cellulare in 1x tampone campione SDS (62,5 mM Tris-HCl a pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% di blu di bromofenolo, β-mercaptoetanolo 5%, 10% glicerolo) e far bollire a 95 ° C per 5 min. Nota: È possibile eseguire il cast un gel o utilizzare un gel prefabbricato disponibile in commercio. Quest'ultimo è stato utilizzato i risultati presentati in Figura 3 (Tabella materiali).</li>
		<li>Caricare 107 cellule di ogni campione in pozzetti separati (includere una scala di proteine) ed eseguire gel a 200 V, fino a quando le proteine sono separate (circa 45 min).</li>
		<li>Macchia le proteine su una membrana di cellulosa di trasferimento semi-secco a 80 mA per 1 h.</li>
		<li>Bloccare la membrana con una miscela di proteine (per esempio, 5% latte in polvere sciolto in 1 x Tween 20-Tris-buffered saline tampone (Immunotyping)).</li>
		<li>Aggiungere anticorpo primario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che la proteina di interesse (ad es., GFP, bandiera o proteina HIS-Tag) di destinazione e incubare per 1 h con agitazione delicata.</li>
		<li>Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.</li>
		<li>Aggiungere anticorpo secondario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che gli obiettivi gli anticorpi primari e consentire il rilevamento (ad es., perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari. Incubare per 1 h con agitazione delicata.</li>
		<li>Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.</li>
		<li>Visualizzare la membrana con una tecnica compatibile con gli anticorpi secondari (per esempio, da imaging dopo incubazione con una chemiluminescenza luminol-derivato, se è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato HRP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esperimento in vitro Nota: Questo è un esempio di utilizzo il vettore come un modello per trascrizione in vitro di RNA per caratterizzare le interazioni RNA-proteina. Per ulteriori dettagli su EMSA, vedere9.<ol>
<li>Rendere le trascrizioni in vitro utilizzando un T7 in vitro trascrizione kit (Tabella materiali) e vettori dal passaggio 5 come modelli.</li>
		<li>Separare i trascritti di RNA di pagina su un 4,5% 7m urea denaturante gel ed estrarre RNA direttamente dal gel di electro eluizione con tubi di dialisi (Tabella materiali).</li>
		<li>Etichetta di RNA (ad es., radiolabeling con γ -32P-ATP utilizzando chinasi di polinucleotide T4 (Tabella materiali) e purificare nuovamente con colonne (Tabella materiali). Attenzione: Prima di lavorare con materiale radioattivo, consultare il responsabile della sicurezza di radiazione locale.</li>
		<li>Mescolare etichettati-RNA con aumento delle concentrazioni di proteina in reazioni separate in un 1x buffer obbligatorio (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)). Nota: nei risultati presentati (Figura 4), 2 nM di radiomarcato csgD mRNA è stato mescolato con una sfumatura di proteina Hfq di 0 a 2 µM (concentrazione di monomero).</li>
		<li>Consentire di proteine e RNA per ibridare prima di caricare la miscela di ibridazione su un gel di poliacrilammide non-denaturante ed eseguire il gel per 1,5 h a 200 V.</li>
		<li>Visualizzare il gel con una tecnica compatibile con l'etichettatura dal punto 6.1.3. (ad es., da phosphoimaging se radiomarcatura è stato applicato).</li>
		<li>Quantificare l'intensità relativa delle bande spostate con una programma di elaborazione delle immagini e forma una curva (sigmoidale) ai dati utilizzando un grafico e il software di analisi dati (Tabella materiali). Basato sulla curva componibile, valori (Kd) costanti di dissociazione possono essere determinati automaticamente con il software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
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<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
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<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d'oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici de...

DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l'importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.
Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l'estremità 5' o estremità 3' del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.
L'approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l'estremità 5' e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all'estremità 3'. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l'estremità 5' o 3' estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).
Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l'estremità 5' e 3'. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).
Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L'uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un'altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA1,2 o proteina3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.
Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 - o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.
Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l'espressione della proteina di CsgD2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l'illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un'analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un'analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-GroEL prodotto nel coniglio</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Stazione di imaging su gel Oligo</td></tr><tr><td>di DNA personalizzato</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>Spettrofotometro per misurazioni di acidi nucleici</td></tr><tr><td>Colorante di caricamento su gel di DNA (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bromuro di etidio 1 %</td><td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Provette per dialisi per elettroeluizione</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit di trascrizione</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Sistema di elettroforesi</td></tr><tr><td>orizzontale Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topo</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Immunoglobuline di topo Citazione</td><td>Dako P0447</td><td>HRP anticorpo secondario coniugato</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>Purificazione dell'RNA</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Gel Bis-Tris per la separazione delle proteine</td></tr><tr><td>Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA polimerasi</td></tr><tr><td>PowerPac HC Alimentatore ad alta corrente</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobuline di coniglio</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP coniugato anticorpo secondario</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Strumento software per grafici e analisi dei dati</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>PCR macchina</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi New</td><td>England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligasi</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>tampone TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenesi sito-diretta per in vitro e in vivo esperimenti esemplificati con interazioni rna in escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l'interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L'approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l'approccio 2 - e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).

Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopropili...

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

La mutagenesi site-directed è utile per studiare le interazioni molecolari, come l'RNA-RNA e le interazioni con le proteine dell'RNA. Questo protocollo descrive come eseguire la mutagenesi diretta dal sito con un approccio PCR in due o 3 step. I principali vantaggi del metodo sono la diversità delle diverse mutazioni che possono essere incorporate, nonché una relativa facilità e costo per farlo.Per iniziare, usa il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer due, una e due, tre, specifiche per coppie di 2 step o primer tre, una e tre, quattro, specifiche per PCR in 3 step per ottenere il prodotto PCR uno. Per convalidare i prodotti PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio, creare un gel di agarosio al 2% sciogliendo due grammi di agarosio in 100 millilitri di tampone TAE 1X, utilizzando un forno a microonde. Aggiungere bromuro di etidio ad una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.Quindi gettare il gel di agarosio. Una volta solidificato, posizionarlo in un'unità di elettroforesi. Caricare una scala del DNA di dimensioni note e i campioni di PCR mescolati con colorante per il caricamento del DNA in pozzi.Eseguire campioni a 75 volt per 45 minuti. E visualizzare le bande su un transilluminatore UV o con un sistema di imaging in gel. Successivamente, purificare il prodotto PCR con un kit di estrazione del gel secondo il protocollo dei produttori e misurare la concentrazione del DNA purificato con uno spettrofotometro.Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 celsius nel tampone TE. Per iniziare la mutagenesi diretta dal sito con una PCR in 2 passi, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio, quindi il primer accoppia due, uno e due, due, per cinque mutazioni primer, o primer coppie due, due e due, tre per tre mutazioni primenti per ottenere il prodotto PCR due. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.Quindi usa il modello di DNA di tipo selvaggio e il prodotto PCR due come primer, insieme a primer due, tre per cinque mutazioni primenti, o primer due, uno per tre mutazioni primenti, per ottenere il prodotto PCR tre. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE.Per iniziare la mutagenesi diretta del sito con una PCR in 3 step, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, uno e tre, due per ottenere il prodotto PCR due. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre.Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Infine utilizzare da due a cinque nanogrammi di prodotti PCR due e tre come modello insieme alle coppie primer tre, una e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR quattro. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.Conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE. In questo studio, la mutagenesi diretta dal sito in 2 e 3 step è stata utilizzata per indagare le interazioni dell'RNA riguardo alla regolazione post trascrizionale del CsgD. Il CsgD di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre IA prodotto PCR, e il mcaS di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre prodotto PCR IB. Utilizzando una strategia PCR in 3 fasi, i prodotti PCR IIA e IIIA sono stati sintetizzati nei primi due passaggi e IVA nella terza fase per introdurre mutazioni in CsgD.Allo stesso modo, mutazioni gratuite dirette dal sito sono state introdotte in mcaS per produrre prodotti PCR IIB, IIIB, nei primi due passaggi, e IVB nel terzo passaggio. L'analisi western blot ha mostrato che mentre l'espressione di mcaS di tipo selvatico impedisce la traduzione di CsgD di tipo selvaggio, mutazioni in mcaS o CsgD alleviano la repressione osservata. Tuttavia, le mutazioni sia in CsgD che in mcaS impediscono la traduzione di CsgD.Utilizzando una strategia PCR in 2 step, i prodotti PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, sono stati sintetizzati nel primo passaggio e i prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, nella seconda fase per introdurre mutazioni all'intero DNA CsgD. I risultati dell'EMSA del legame HFQ con gli RNA di tipo selvatico e mutante csgD trascritti in vitro, sintetizzati utilizzando prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, hanno mostrato l'aumento dei valori KD degli alleli mutanti. Ciò dimostrò che il quartier generale poteva legarsi in modo meno efficiente ai mutanti.Inoltre hfq ha diversi siti di legame su CsgD, che è mostrato dai tre turni osservati per l'RNA di tipo selvaggio. Tuttavia, solo due siti di legame sono osservati per diversi RNA mutanti. Quindi l'approccio mutazionale diretto al sito identifica le strutture primarie e o secondarie dell'mRNA CsgD che sono importanti per il completo legame del quartier generale.Il metodo per la mutagenesi diretta dal sito qui descritto si basa sulla PCR. Buone pratiche pcr sono quindi cruciali per il metodo e potrebbero richiedere l'ottimizzazione per avere successo. La mutagenesi diretta dal sito è potente solo con tutti e tre i metodi come EMSA e Western Blotting.Altri metodi, ad esempio, includono vari saggi strutturali e alcuni saggi di attività, e studi di modifica post-traduzione.

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