Rifiuto di fluorescenza di fondo in risonanza e spontanea microspettroscopia Raman

Discutiamo la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza ultraveloci tutto-ottici di commutazione per isolare Raman da segnali di fluorescenza. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza utilizzando le energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri.

Lo scopo di questa procedura è quello di costruire un'andatura completamente ottica che passi la luce diffusa Raman rifiutando i segnali fluorescenti. Ciò si ottiene prima eccitando e polarizzando lo scattering Raman. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare la trave della pompa per azionare il cancello.

In terzo luogo, la pompa, il pistone e gli impulsi devono essere regolati in modo che si sovrappongano. La fase finale della procedura consiste nell'acquisire spettri tempo-dipendenti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la quantificazione e la classificazione biochimica attraverso l'analisi dei segnali di ramen con elevati rapporti segnale/rumore.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la rimozione software del fondo di fluorescenza, è che il rumore di ripresa prodotto dalla fluorescenza è significativamente ridotto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biologico e biomedico, come la caratterizzazione non invasiva della composizione chimica del fluor endogeno nelle cellule e nei tessuti batterici, la comprensione dei processi cellulari e delle malattie come il cancro, le malattie vascolari o neurodegenerative utilizzando marcatori intrinseci. Questo metodo può anche aiutare con lo sviluppo di nuove sonde che potrebbero essere utilizzate sia come etichette a fluorescenza che RAM, nonché per sensori medici non invasivi per l'analisi del sangue.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sui sistemi biologici per l'ingegneria biomedica. Può essere applicato anche ad altri campi come i biocarburanti, la ricerca o l'industria delle telecomunicazioni. I campioni biologici sono in genere posizionati su un cartiglio di copertura di spessore uno montato in una camera cellulare ATO Fluor.

I campioni liquidi, in particolare quelli tossici per l'uomo, vengono posti in una piccola bottiglia di vetro con un vetrino coprioggetto cementato all'apertura per mezzo di resina epossidica siliconica, che viene poi capovolta per la misurazione posizionare i campioni sul tavolino secondario montato sopra il tavolino del microscopio che ha un proprio controllo indipendente della messa a fuoco per acquisire spettri di ramen tempo-dipendenti, Innanzitutto, il fascio di eccitazione deve essere adeguatamente preparato. Inizia con la luce che emerge da un laser in zaffiro GI pulsato sintonizzabile da 2,4 watt. Ogni impulso nel treno di impulsi da 80 megahertz dovrebbe avere 30 nano joule di energia, un'ampiezza temporale di 140 femtosecondi e uno spettro centrato a 808 nanometri con una larghezza di banda spettrale di circa sei nanometri per evitare che le riflessioni posteriori rientrino nella cavità laser, la luce dovrebbe essere fatta passare attraverso un isolatore di Faraday, una piastra a semionda prima dell'isolatore di Faraday per consentire la regolazione continua della potenza totale inviata nel sistema.

Poiché sei nanometri sono una larghezza di banda troppo ampia per risolvere la maggior parte delle modalità ramen, il raggio viene inviato attraverso un filtro passa-banda molto stretto. Invialo a 808 nanometri. Quindi, usa un doppietto aromatico per concentrare la luce su un foro di beta bario di cinque millimetri.

Otto cristalli a metà della lunghezza d'onda da 808 nanometri a 404 nanometri. Posiziona il cristallo di bate beta bario in una montatura con controlli di punta e inclinazione montati su un tavolino di traslazione. Per massimizzare l'efficienza della conversione della lunghezza d'onda, il cristallo deve essere posizionato in modo simmetrico rispetto al fuoco del doppietto e con il suo asse del cristallo allineato alla polarizzazione del raggio in entrata.

Poiché l'efficienza della conversione della lunghezza d'onda dipende dalla polarizzazione, il controllo sulla quantità di luce inviata al campione può essere ottenuto posizionando una seconda piastra a semionda dopo l'isolatore di Faraday. Ruotando questa piastra d'onda, l'intensità della luce inviata al campione può essere regolata indipendentemente dall'intensità inviata nel raggio della pompa. La luce convertita in lunghezza d'onda viene quindi ricollimata da un secondo doppietto aromatico scelto in modo tale che il fascio eccitante sia abbastanza grande da riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio e diretto in un microscopio invertito per mezzo di due specchi direttivi.

L'obiettivo del microscopio definisce l'asse ottico per allineare il raggio di eccitazione a questo asse. Posizionare uno specchio nel piano del campione del microscopio. I due specchietti di sterzo vengono quindi regolati in modo iterativo mentre si osserva il raggio laser riflesso posteriore su una telecamera CCD collegata alla porta di imaging del microscopio.

Supponendo che l'immagine sulla fotocamera sia centrata sul campo visivo del microscopio, il raggio è in asse. Quando la macchia focale è centrata sul chip del microscopio e la traslazione dell'obiettivo lungo l'asse Z non cambia. Il punto centrale della diffusione del ramen a fascio defocalizzato si verifica quando il campione viene posizionato nel piano del campione e viene irradiato con luce laser.

Un filtro dicroico posto sotto l'obiettivo del microscopio separa l'onda spostata. Il ramen diffondeva la luce dal fascio di eccitazione dirigendo la luce diffusa dal ramen verso la porta laterale del microscopio. Il microscopio è stato modificato per rimuovere tutte le lenti all'interno di questo percorso, in modo tale che la luce del segnale emerga dal microscopio rivestito perché il raggio di segnale che emerge dal microscopio è più grande dell'apertura libera della ghiandola.

I polarizzatori di Thompson, un telescopio 0,47 volte costruito con due doppietti aromatici, vengono utilizzati per ridurre il fascio. La luce di segnalazione viene quindi polarizzata da un polarizzatore Thompson a ghiandola orientato a zero gradi rispetto alla verticale nel telaio del laboratorio e diretta verso uno specchio dicroico dove viene ricombinato con il fascio della pompa. Il fascio della pompa viene inviato in una linea di ritardo composta da due specchi perpendicolari l'uno all'altro, entrambi posizionati su uno stadio di traslazione lineare che può essere regolato per garantire la sovrapposizione temporale degli impulsi della pompa e del segnale.

Dopo la linea di ritardo, il fascio viene inviato attraverso una piastra intermedia e un polarizzatore orientato a 45 gradi rispetto alla verticale nel telaio del laboratorio. Ciò garantisce il corretto stato di polarizzazione del fascio della pompa quando raggiunge il mezzo non lineare. La luce viene quindi riflessa da due specchietti di sterzo, uno con comandi piezoelettrici, che dovrebbero essere utilizzati per regolare infine la posizione del raggio della pompa in modo che si sovrapponga spazialmente al raggio del segnale.

Per ottenere questa sovrapposizione, osservare la pompa e i raggi di segnale in due posizioni, una vicina e una lontana dallo specchio dicroico dove i raggi sono combinati utilizzando il primo specchio di sterzo per sovrapporre i due raggi nel punto vicino e lo specchio pizo per sovrapporre i raggi nel punto lontano, il raggio della pompa può essere reso esattamente coline con i raggi di segnale. Successivamente, il corrugato e il sistema di raccolta devono essere impostati per massimizzare il segnale temporizzato raccolto. Per fare ciò, la pompa e i fasci di segnale vengono prima fatti passare attraverso un filtro diic che ha un diametro esterno di sei a 404 nanometri per evitare che la luce di eccitazione residua si ecciti e si disperda all'interno del mezzo non lineare.

La pompa e i fasci di segnale vengono quindi focalizzati da un doppietto aromatico in un percorso di un centimetro di quarzo contenente il materiale non lineare, qualsiasi materiale non lineare, con un indice non lineare adeguatamente elevato e una risposta temporale adeguatamente breve può essere utilizzata. Qui. Per questi esperimenti, utilizziamo il solfuro di carbonio. La luce viene poi ricollimata da un secondo doppietto con una lunghezza focale identica al primo.

I fasci vengono quindi fatti passare attraverso un analizzatore Thompson a ghiandola su una montatura rotante, e quindi attraverso una serie di filtri di assorbimento e interferenza che combinati hanno un diametro esterno di 10 a 808 nanometri. Infine, la luce del segnale viene focalizzata da un doppietto aromatico in una fibra ottica multimodale da 50 micron, dove la fibra è montata in uno stadio che consente la traduzione in X, Y e Z.La fibra viene quindi accoppiata a uno spettrografo di imaging commerciale con telecamera CCD collegata per allineare il sistema di raccolta per massimizzare il segnale raccolto, impostare l'analizzatore a zero gradi e posizionare un campione di prova di toluene nel piano del campione, ottimizzare il segnale Raman raccolto regolando i controlli X, Y e Z del supporto in fibra per garantire una corretta sovrapposizione spaziale e temporale della pompa e dei fasci di segnale. Posizionare uno specchio nel piano del campione del microscopio.

Quindi rimuovere il filtro a 404 nanometri dal sistema. Ruotare l'analizzatore di 90 gradi in modo che il fascio retroriflesso a 404 nanometri venga inviato allo spettrografo con l'intensità regolata in modo tale da non saturare la fotocamera. A questo punto, con il raggio della pompa spento, ruotare l'analizzatore per ridurre al minimo il segnale trasmesso a 404 nanometri.

Quindi riaccendere il raggio della pompa e regolare lentamente lo stadio di ritardo fino a quando la trasmissione della luce a 404 nanometri inizia ad aumentare. Successivamente, ruotando iterativamente, lo stadio di ritardo, lo specchio piezoelettrico e i controlli X, y e Z della fibra per massimizzare il segnale perché il fascio retroriflesso di 404 nanometri e la luce diffusa Raman possono prendere percorsi leggermente diversi attraverso il sistema. Effettua le regolazioni finali posizionando un potente scatterer Raman come il toluene sullo stadio di campionamento, sostituendo il filtro Raman e modificando leggermente l'allineamento cambiando lo specchio elettrico pizo dello stadio di ritardo e i controlli X, Y e Z della fibra per ottimizzare il segnale Raman.

Ora il sistema è pronto per raccogliere spettri. Ciò richiede innanzitutto l'acquisizione di diverse curve di sfondo per correggere gli artefatti del sistema. Innanzitutto, con l'analizzatore impostato a zero gradi, il raggio di eccitazione acceso e il raggio della pompa spento.

Ottenere uno spettro non ato, quindi impostare l'analizzatore a 90 gradi e raccogliere uno spettro di fondo che rappresenta la luce diffusa che fuoriesce attraverso i polarizzatori. Quindi, con l'analizzatore che rimane a 90 gradi, spegnere il raggio di ramen e accendere il raggio della pompa. Raccogli un secondo spettro di fondo che rappresenta la quantità di luce della pompa che fuoriesce attraverso i filtri dicroici.

Infine, con tutti i laser spenti, raccogli uno spettro scuro di base che rappresenta il livello di corrente di buio della fotocamera e dell'elettronica. Infine, accendi tutti i raggi e raccogli uno spettro chiuso. Per ottenere il vero spettro della sola luce attraverso il cancello, i due spettri di fondo e lo spettro scuro devono essere sottratti da questo spettro chiuso.

Qui vediamo un diagramma schematico del sistema ondulatore. Il percorso del fascio della pompa è mostrato come una linea rossa continua mentre il percorso SHG è mostrato come una linea marina continua. Il percorso in cui il ramen e la fluorescenza si sovrappongono è mostrato in verde.

Mentre il percorso in cui la fluorescenza è stata temporaneamente filtrata è mostrato in giallo. Qui vediamo gli spettri grezzi della cumarina disciolta in olio da immersione. La curva rossa mostra lo spettro preso con il gate tenuto aperto con la curva nera mostra lo spettro preso con l'analizzatore allineato per la trasmissione minima e un raggio di pompa applicato.

La curva blu mostra lo spettro rilevato con l'analizzatore allineato per la trasmissione minima e l'assenza di fascio della pompa applicato, mentre la curva verde mostra lo spettro rilevato con solo il raggio della pompa applicato. Tutti gli spettri sono stati uniformi con un filtro gole KY di terzo ordine a 11 punti. Le linee tratteggiate magenta indicano la regione spettrale mostrata nel grafico seguente.

Qui vediamo spettri di cumarina disciolta in olio da immersione dopo sottrazione di fondo di fluorescenza. La curva rossa è lo spettro con il cancello tenuto aperto e la curva blu è lo spettro chiuso. Lo spettro gated mostra chiaramente l'alto numero d'onda contorto, la caratteristica del picco degli oli.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il laser deve prima avere un'energia di impulso sufficiente per guidare il ga e che il sistema richiede una squisita sovrapposizione spaziale e temporale dei due impulsi. Dopo aver visto questo video e aver letto il protocollo allegato, dovresti avere una buona comprensione di come separare il raggio laser in un raggio di eccitazione e curvo. Come sovrapporre queste due travi, sia spazialmente che temporalmente.

Come registrare un segnale di ramen tramite spettrografo e C, c, D e anche come visualizzare e analizzare il segnale di ramen. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come indossare occhiali laser durante il tentativo di questa procedura. Ulteriori norme di sicurezza si applicano per l'uso del materiale non lineare e per l'uso del campione specifico.