Rifiuto di fluorescenza di fondo in risonanza e spontanea microspettroscopia Raman

Lo scopo di questa procedura è costruire un gate puramente ottico che trasmetta la luce diffusa Raman reiettando al contempo i segnali fluorescenti. Questo risultato si ottiene innanzitutto eccitando e polarizzando la diffusione Raman. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare il fascio pompa per attivare il gate.

In terzo luogo, è necessario regolare la pompa, il raggio e gli impulsi in modo che si sovrappongano. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'acquisire spettri temporizzati. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano la quantificazione e la classificazione biochimica mediante l'analisi dei segnali Raman con elevati rapporti segnale-rumore.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la rimozione software dello sfondo fluorescente, è la significativa riduzione del rumore di conteggio prodotto dalla fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori biologico e biomedico, come la caratterizzazione non invasiva della composizione chimica di fluorocromi endogeni in cellule batteriche e tessuti, la comprensione di processi cellulari e malattie come il cancro, le malattie vascolari o quelle neurodegenerative, attraverso l'uso di marcatori intrinseci. Questo metodo potrebbe inoltre essere utile nello sviluppo di nuovi sonde che potrebbero essere utilizzate sia come marcatori fluorescenti sia come marcatori RAM, nonché per sensori medici non invasivi destinati all'analisi del sangue.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui sistemi biologici per l'ingegneria biomedica, può essere applicato anche ad altri settori come la ricerca sui biocarburanti o l'industria delle telecomunicazioni. I campioni biologici vengono tipicamente posizionati su un coprivetrino di spessore numero uno montato in una camera per cellule ATO Fluor.

Campioni liquidi, in particolare quelli tossici per l'uomo, vengono posti in un piccolo flacone di vetro con un coprioggetto fissato all'apertura mediante resina epossidica al silicone, che viene quindi capovolto per la misurazione. Posizionare i campioni sullo stadio secondario montato sulla parte superiore dello stadio del microscopio, il quale dispone di un controllo del fuoco indipendente. Per ottenere spettri Raman con gate temporale, innanzitutto il fascio di eccitazione deve essere opportunamente preparato. Si parte dalla luce emessa da un laser a zaffiro pulsato accordabile da 2,4 watt. Ogni impulso nel treno di impulsi a 80 megahertz deve avere un'energia di 30 nanojoule, una larghezza temporale di 140 femtosecondi e uno spettro centrato a 808 nanometri con una larghezza spettrale di circa sei nanometri. Per evitare che le riflessioni indietro rientrino nella cavità del laser, la luce deve passare attraverso un isolatore di Faraday. Posizionare una piastra a semionda prima dell'isolatore di Faraday per consentire la regolazione continua della potenza totale inviata nel sistema.

Poiché una larghezza di banda di sei nanometri è troppo ampia per risolvere la maggior parte delle bande Raman, il fascio viene inviato attraverso un filtro passa-banda molto stretto. Inviarlo a 808 nanometri. Successivamente, utilizzare un doppietto aromatico per focalizzare la luce su un beta borato di bario di cinque millimetri.

Otto cristalli dimezzano la lunghezza d'onda da 808 nanometri a 404 nanometri. Posizionare il cristallo di barium borato beta in un supporto con controlli di inclinazione e rotazione montato su uno stadio di traslazione. Per massimizzare l'efficienza della conversione della lunghezza d'onda, il cristallino deve essere posizionato in modo preciso e simmetrico rispetto al fuoco del doppietto e con il suo asse cristallino allineato alla polarizzazione del fascio in ingresso.

Poiché l'efficienza della conversione della lunghezza d'onda dipende dalla polarizzazione, è possibile controllare la quantità di luce inviata al campione posizionando una seconda piastrina a mezzo onda dopo l'isolatore Faraday. Ruotando questa piastrina, l'intensità della luce inviata al campione può essere regolata indipendentemente dall'intensità del fascio di pompaggio. La luce a lunghezza d'onda convertita viene quindi ricollimata da un secondo doppietto aromatico scelto in modo che il fascio eccitante sia sufficientemente ampio da riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio ed è indirizzata in un microscopio invertito mediante due specchi di puntamento.

L'obiettivo del microscopio definisce l'asse ottico per allineare il fascio di eccitazione a questo asse. Posizionare uno specchio nel piano del campione del microscopio. I due specchi di orientamento vengono quindi regolati in modo iterativo osservando il fascio laser riflesso all'indietro su una telecamera CCD collegata alla porta di imaging del microscopio.

Assumendo che l'immagine sulla fotocamera sia centrata sul campo visivo del microscopio, il fascio è in asse. Quando il punto focale è centrato sul chip del microscopio e la traslazione dell'obiettivo lungo l'asse Z non cambia. Il punto centrale dello scattering Raman defocalizzato si verifica quando il campione viene posizionato nel piano del campione e viene irradiato con luce laser.

Un filtro dicromatico posizionato al di sotto dell'obiettivo del microscopio separa l'onda spostata. La luce diffusa Raman viene separata dal fascio di eccitazione, indirizzando la luce diffusa Raman verso la porta laterale del microscopio. Il microscopio è stato modificato per rimuovere tutte le lenti presenti in questo percorso, in modo che la luce del segnale emerga dal microscopio rivestita, poiché il fascio del segnale in uscita dal microscopio è più grande dell'apertura libera della guarnizione.

I polarizzatori di Thompson, un telescopio 0,47 volte costruito con due doppietti aromatici, viene utilizzato per ridurre le dimensioni del fascio. La luce del segnale viene quindi polarizzata da un polarizzatore di Thompson orientato a zero gradi rispetto alla verticale nel sistema di riferimento del laboratorio e indirizzata verso uno specchio dicromatico, dove viene ricombinata con il fascio pompa. Il fascio pompa viene inviato in una linea di ritardo composta da due specchi disposti ad angolo retto l'uno rispetto all'altro, entrambi posizionati su una guida di traslazione lineare che può essere regolata per garantire l'allineamento temporale tra gli impulsi pompa e segnale.

Dopo la linea di ritardo, il fascio viene inviato attraverso una lamina semitrasparente e un polarizzatore orientati a 45 gradi rispetto alla verticale nel sistema di riferimento del laboratorio. Questo garantisce lo stato di polarizzazione corretto del fascio pompa quando raggiunge il mezzo non lineare. La luce viene quindi riflessa da due specchi di puntamento, uno dei quali dotato di controlli piezoelettrici, che deve essere utilizzato per regolare definitivamente la posizione del fascio pompa in modo che sovrapponga spazialmente il fascio segnale.

Per ottenere questo sovrapposizione, osservare i fasci di pompa e di segnale in due posizioni, una vicina e una lontana dallo specchio dicromatico in cui i fasci vengono combinati, utilizzando il primo specchio di orientamento per sovrapporre i due fasci nel punto vicino e lo specchio piezoelettrico per sovrapporre i fasci nel punto lontano, in modo da rendere il fascio di pompa esattamente collineare al fascio di segnale. Successivamente, occorre impostare il sistema di corrugazione e raccolta per massimizzare il segnale raccolto con gate temporale. A tale scopo, i fasci di pompa e di segnale vengono prima fatti passare attraverso un filtro dicroico con una densità ottica (OD) pari a sei a 404 nanometri, per evitare che qualsiasi luce residua di eccitazione possa eccitare e disperdersi all'interno del mezzo non lineare.

I fasci pompa e segnale vengono quindi focalizzati da un doppietto aromatico in una cella di quarzo con un cammino ottico di un centimetro contenente il materiale non lineare; qualsiasi materiale non lineare, purché dotato di un indice non lineare sufficientemente elevato e di una risposta temporale sufficientemente breve, può essere utilizzato. Per questi esperimenti, utilizziamo solfuro di carbonio. La luce viene poi ricollimata da un secondo doppietto con una lunghezza focale identica al primo.

I fasci vengono quindi fatti passare attraverso un analizzatore gland Thompson montato su un supporto rotante e successivamente attraverso un insieme di filtri ad assorbimento e interferenziali che combinati presentano una densità ottica (OD) di 10 a 808 nanometri. Infine, la luce del segnale viene focalizzata da un doppietto aromatico in una fibra ottica multimodale da 50 micron, dove la fibra è montata su un supporto che permette traslazioni lungo gli assi X, Y e Z. La fibra viene quindi accoppiata a uno spettrografo commerciale per immagini dotato di una telecamera CCD per allineare il sistema di raccolta al fine di massimizzare il segnale raccolto, impostare l'analizzatore a zero gradi e posizionare un campione di prova di toluene nel piano del campione, ottimizzando il segnale Raman raccolto mediante regolazione dei comandi X, Y e Z del supporto della fibra per garantire un corretto sovrapposizione spaziale e temporale dei fasci di pompaggio e del segnale. Posizionare uno specchio nel piano del campione del microscopio.

Quindi rimuovere il filtro da 404 nanometri dal sistema. Ruotare l'analizzatore a 90 gradi in modo che il fascio retro-riflesso a 404 nanometri venga inviato allo spettrografo con l'intensità regolata in modo da non saturare la fotocamera. A questo punto, con il fascio di pompaggio spento, ruotare l'analizzatore per minimizzare il segnale trasmesso a 404 nanometri.

Quindi riaccendere il fascio pompa e regolare lentamente la fase di ritardo finché la trasmissione della luce a 404 nanometri non inizia ad aumentare. Successivamente, regolare in modo iterativo la fase di ritardo, lo specchio piezoelettrico e i controlli X, Y e Z della fibra per massimizzare il segnale, poiché il fascio a 404 nanometri retrodiffuso e la luce diffusa Raman potrebbero percorrere traiettorie leggermente diverse all'interno del sistema. Effettuare le regolazioni finali posizionando un forte diffusore Raman, come il toluene, sullo stadio del campione, sostituendo il filtro Raman e apportando piccole modifiche all'allineamento variando la fase di ritardo, lo specchio piezoelettrico e i controlli X, Y e Z della fibra per ottimizzare il segnale Raman.

Ora il sistema è pronto per acquisire spettri. Questo richiede innanzitutto l'acquisizione di diverse curve di fondo per correggere gli artefatti del sistema. Per prima cosa, con l'analizzatore impostato a zero gradi, il fascio di eccitazione acceso e il fascio pompa spento.

Ottenere uno spettro non filtrato, quindi impostare l'analizzatore a 90 gradi e acquisire uno spettro di fondo che rappresenti la luce parassita che attraversa i polarizzatori. Successivamente, mantenendo l'analizzatore a 90 gradi, spegnere il fascio Raman e accendere il fascio di pompaggio. Acquisire un secondo spettro di fondo che rappresenti la quantità di luce di pompaggio che attraversa i filtri dicromatici.

Infine, con tutti i laser spenti, acquisire uno spettro scuro di base che rappresenti il livello di corrente oscura della telecamera e dell'elettronica. Accendere quindi tutti i fasci e acquisire uno spettro temporizzato. Per ottenere lo spettro reale della sola luce passata attraverso la finestra temporale, lo spettro scuro e i due spettri di fondo devono essere sottratti da questo spettro temporizzato.

Qui vediamo un diagramma schematico del sistema di corrugazione. Il percorso del fascio pompa è indicato con una linea rossa continua, mentre il percorso dell'SHG è indicato con una linea blu scuro continua. Il percorso in cui si sovrappongono Raman e fluorescenza è indicato in verde.

Mentre il percorso in cui la fluorescenza è stata temporaneamente filtrata viene mostrato in giallo. Qui osserviamo gli spettri grezzi della cumarina disciolta in olio di immersione. La curva rossa mostra lo spettro ottenuto con il gate mantenuto aperto, mentre la curva nera mostra lo spettro ottenuto con l'analizzatore allineato per la trasmissione minima e un fascio pompa applicato.

La curva blu mostra lo spettro acquisito con l'analizzatore allineato per la trasmissione minima e senza fascio pompa applicato, mentre la curva verde mostra lo spettro acquisito con solo il fascio pompa applicato. Tutti gli spettri sono stati smussati mediante un filtro KY gole del terzo ordine a 11 punti. Le linee tratteggiate in magenta indicano la regione spettrale mostrata nel grafico seguente.

Qui osserviamo gli spettri della cumarina disciolta in olio di immersione dopo la sottrazione del fondo di fluorescenza. La curva rossa è lo spettro con il gate aperto, mentre la curva blu è lo spettro con gate. Lo spettro con gate mostra chiaramente il picco sovrapposto a elevato numero d'onda, caratteristico degli oli.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il laser deve innanzitutto disporre di un'energia impulsata sufficiente per azionare il ga e che il sistema richiede un sovrapposizione spaziale e temporale estremamente precisa dei due impulsi. Dopo aver visionato questo video e letto il protocollo allegato, si dovrebbe avere una buona comprensione di come separare il fascio laser in un fascio di eccitazione e un fascio di curva, e di come sovrapporre questi due fasci sia spazialmente che temporalmente.

Come registrare un segnale Raman mediante spettrografo e C, c, D, e anche come visualizzare e analizzare il segnale Raman. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di occhiali protettivi per laser devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Regole di sicurezza aggiuntive si applicano per l'uso del materiale non lineare e per l'uso del tuo campione specifico.