Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini di alta qualità, mediante fluorescenza o riflessione totale interna, o immagini al microscopio ottico di microorganismi dotati di parete cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando le lamelle e le cellule. Il secondo passaggio consiste nell'allineare con precisione l'apparato microscopico per ottenere una qualità ottimale dell'immagine.

Successivamente, si scelgono gli incidenti corretti, gli angoli e le condizioni di acquisizione per ottenere immagini o filmati. L'ultimo passaggio consiste nell'elaborazione post-acquisizione delle immagini ottenute. In definitiva, la microscopia TIRF viene utilizzata per studiare la dinamica della localizzazione delle proteine alla corteccia cellulare.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metalli eccessivi come la microscopia convenzionale o confocale è che il contrasto dell'immagine in microscopia è molto elevato, consentendo tempi rapidi e luce ridotta. Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle membrane, come i meccanismi di segregazione laterale delle proteine o la mobilità delle proteine di membrana. I vetrini per microscopia turf devono essere puliti dalle particelle di polvere prima dell'uso.

Poiché il tappeto erboso è sensibile ai segnali di fondo derivanti dalla polvere su un vetrino sporco, è necessario un vetrino pulito con un fondo più basso per iniziare la procedura di pulizia dei vetrini. Utilizzare pinzette per posizionare i vetrini in un supporto in ceramica con coperchio.

Successivamente, riempire un contenitore di vetro con idrossido di sodio uno molare. Questo idrossido di sodio può essere riutilizzato più volte. Posizionare il supporto in ceramica contenente i coprioggetti nell'idrossido di sodio e incubare i coprioggetti per due ore sotto rotazione lenta e continua.

Non incubare per più di otto ore, poiché ciò provocherà l'opacizzazione dei vetrini dopo due ore; lavare i vetrini due volte con acqua distillata per cinque minuti ciascuna sotto rotazione lenta e continua, quindi conservare i vetrini puliti nel portavetrini in ceramica coperto con etanolo al 100%. Per preparare le cellule di bacillus subtilis per la microscopia in campo oscuro, diluire fino a un OD 600 compreso tra 0,01 e 0,05 in cinque millilitri di un adeguato mezzo di crescita e coltivare fino alla fase esponenziale. Per preparare l'aros al 1,25% in mezzo sintetico, sciogliere la polvere di aros in un tubo di plastica da 1,5 millilitri a 95 gradi Celsius, quindi conservare in un blocco riscaldante a 72 gradi Celsius.

Aggiungere una piccola goccia di aros al centro di un vetrino e, con un secondo vetrino, premere l'aros fino a formare un cuscinetto piatto dopo almeno due minuti, quindi separare con attenzione i vetrini. Centrifugare 500 microlitri di cellule di bacillus subtlest in un microcentrifugo a 12.000 giri al minuto per un minuto. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 50 microlitri di mezzo.

Aggiungere due a quattro microlitri di cellule al centro del pad di agarosio. Successivamente, utilizzare una pinzetta per rimuovere un'ogiva pulita dal contenitore riempito di etanolo e asciugarla con aria compressa. Posizionare con attenzione l'ogiva sul campione.

Lasciare sedimentare le cellule per almeno due minuti prima della microscopia. Per l'immagine a lungo termine, sigillare i bordi del vetrino con la miscela riscaldata di vaselina, lanolina e paraffina oppure con Val app. Per preparare le cellule di Saccharomyces visi per la microscopia in campo, diluire una precoltura e far crescere in un terreno appropriato per almeno cinque ore.

Per la fase esponenziale, prelevare un'oggettino dal contenitore riempito con etanolo e asciugarlo con aria compressa utilizzando una pipetta. Aggiungere cinque microlitri di soluzione di conval o di con A sull'oggettino e asciugare con aria compressa. La con A si lega ai carboidrati della parete cellulare del lievito e immobilizza le cellule di lievito.

Successivamente, trasferire 4,5 microlitri di una sospensione di cellule di lievito su un lato del con, un'ogiva coprioggetto rivestita. Posizionare con attenzione il coprioggetto, con il lato del campione rivolto verso il basso, su un vetrino microscopico partendo da un bordo e lasciando cadere lentamente le gocce. Questo eviterà la formazione di bolle d'aria.

Lasciare che le cellule si depositino per almeno due minuti prima della microscopia; sigillare i bordi del vetrino con val app per acquisizioni a lungo termine. Tutti gli esperimenti mostrati in questo video sono eseguiti su un sistema turf personalizzato basato su un supporto IMEX completamente automatizzato con un obiettivo Olympus 100x 1,45 NA. Le sorgenti luminose utilizzate sono laser a diodo da 75 milliwatt, pompati a stato solido o laser DPSS a 488 nanometri e 561 nanometri.

Angoli del TURF e fluorescenza. Il recupero dopo fotobleaching o la posizione FRAT possono essere regolati istantaneamente mediante due galvanometri. Un terzo galvanometro viene utilizzato per commutare tra epi, fluorescenza, FRAP e TURF.

I galvanometri, che sono controllati direttamente dal software di acquisizione in tempo reale, consentono una semplice misurazione della cinetica di localizzazione per gli oggetti tracciati nelle immagini di peluria, raccolte mediante una camera EM CCD e una lente con ingrandimento due volte posizionata davanti alla camera. L'acquisizione è anch'essa controllata dal software di acquisizione in tempo reale. Prima di lavorare con il laser, indossare gli occhiali di protezione per laser, proiettare il laser sul soffitto in modalità peluria e calibrare la posizione a zero gradi in modo che il laser si trovi in linea retta.

Con l'obiettivo, focalizzare il punto laser alla dimensione minima dopo un'ottimale regolazione; il profilo del laser dovrebbe formare un punto ben definito con una forma approssimativamente rotonda. Eseguire la calibrazione prima di ogni sessione. Per ottenere una qualità ottimale dell'immagine, l'allineamento del microscopio TURF è fondamentale per il successo di questa procedura.

L'incidenza, gli angoli e i parametri corretti per l'acquisizione delle immagini devono essere regolati con attenzione per ottenere una qualità ottimale delle immagini. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, identificare la posizione delle cellule utilizzando l'illuminazione in campo chiaro. I LED rossi sono particolarmente indicati poiché non inducono danni fotoindotti significativi.

Passare all'illuminazione laser e selezionare i laser e le combinazioni di filtri appropriati per eccitare i fluorocromi scelti, assicurandosi che l'angolo del prisma sia subcritico. In caso contrario, i segnali provenienti dalle proteine fuse con GFP non verranno rilevati. Individuare la sezione superiore della cellula, ovvero il lato della cellula rivolto verso il vetrino coprioggetto.

Aumentare gradualmente l'angolo di incidenza del fascio laser fino alla scomparsa dei segnali, quindi ridurre lentamente l'angolo fino al punto in cui la fluorescenza sulla superficie cellulare ricompare. Regolare nuovamente il fuoco Z per ottenere una posizione ottimale sulla superficie. Angoli di incidenza accettabili non producono un alone sfocato ai margini della cellula, come illustrato in questo esempio relativo a una proteina del lievito.

PMA con GFP immaginato con angoli di incidenza decrescenti da alto a sinistra a basso a destra. Le immagini mostrano una perdita improvvisa del segnale all'angolo critico e una diminuzione progressiva delle informazioni strutturali e del rapporto segnale-rumore; regolare le intensità del laser e il guadagno della telecamera per massimizzare la dinamica. In genere, le telecamere E-M-C-C-D sono ottimali per rilevare segnali molto bassi con elevati rapporti segnale-rumore.

La microscopia in campo è molto sensibile a piccole differenze di altezza. Difetti della lamellina possono portare a visualizzare contemporaneamente solo poche cellule. Questa immagine di una sospensione densa di microsfere fluorescenti rappresenta un esempio di campo visivo irregolare in cui solo una parte del campo è a fuoco.

Pertanto, per cellule piccole, la regione di acquisizione può spesso essere ridotta a una sotto-regione contenente l'oggetto di interesse. Per esperimenti TURF a doppio colore, il passaggio incrociato tra fluorofori deve essere minimizzato per coppie R-F-P-G-F-P. Utilizzare filtri di emissione separati poiché la RFP viene eccitata debolmente dalla luce a 488 nanometri.

Un flusso di lavoro tipico per evitare il passaggio di segnale e l'acquisizione di immagini a doppio colore è mostrato qui. Dopo aver acquisito le immagini delle cellule con set di filtri separati, le immagini vengono separate e allineate utilizzando perline fluorescenti prima di essere fuse. Per l'analisi, un parametro fondamentale che influenza la qualità dell'immagine è l'allineamento del laser e l'obiettivo pulito. Dopo aver allineato il laser e messo a fuoco sulla posizione Z utilizzata per l'acquisizione dell'immagine, rimuovere il campione e pulire l'obiettivo da tutto l'olio.

L'olio residuo provocherà una diffrazione della luce laser e la formazione di granulazioni nel profilo del fascio. La microscopia TURB può essere utilizzata per visualizzare la distribuzione degli omologhi dell'actina e degli enzimi della parete cellulare nelle cellule batteriche. In questo risultato rappresentativo, cellule di Bacillus subtilis che esprimono fusioni GFP dell'omologo dell'actina Mbl o della transpeptidasi PbpH sono state analizzate mediante microscopia TURB e microscopia a fluorescenza episcopica convenzionale.

Le immagini qui mostrate rappresentano proiezioni medie di una serie temporale per indicare l'area coperta da patch mobili di MBL monitorate con diverse modalità di imaging. Il contorno blu nell'immagine sovrapposta indica il contorno cellulare visualizzato a partire da un'immagine in campo chiaro.

La transpeptidasi PBPH espressa settimanalmente si localizza in chiazze corticali appena visibili in fluorescenza epifluorescente, ma chiaramente distinguibili con la tecnica turf. La penetrazione ridotta può essere osservata meglio per il segnale P-B-P-H-G-F-P all'levello delle SETTE indicati dalle frecce, che appare come linee in epifluorescenza ma come punti in turf. Questo successivo insieme di immagini mostra un confronto tra l'illuminazione in epifluorescenza e quella in turf del componente del complesso TOR, bit 61 in Saccharomyces visi.

Questa proteina è espressa debolmente e forma piccole aree corticali con solo poche copie proteiche per ciascuna area. In fluorescenza epi, solo poche aree sono visibili rispetto allo sfondo intenso, mentre nelle immagini turf le aree possono essere rilevate con un ottimo rapporto segnale-rumore. Un ulteriore miglioramento del contrasto dell'immagine può essere ottenuto mediante diverse fasi di elaborazione dell'immagine, come la sottrazione di immagini sfocate con filtro gaussiano o mediano, mentre la sottrazione del fondo locale elimina il rumore e definisce le strutture ad alta intensità.

Ciò avviene spesso al costo di una perdita delle strutture fini e di un'esagerata amplificazione delle regioni ad alta intensità. Come indicato dalla freccia, una procedura migliore è la deconvoluzione 2D, che può essere eseguita con pacchetti software gratuiti o commerciali. L'aumento del contrasto dopo la deconvoluzione è illustrato da questo filmato in time-lapse di GFP RAs due che mostra alternativamente immagini grezze e immagini di prato deconvolute.

Dato che GFP RAs due è una proteina ad alta mobilità, tempi di acquisizione rapidi sono fondamentali per risolvere il suo comportamento dinamico. L'elaborazione delle immagini è particolarmente importante per le analisi di codistribuzione, come illustrato in questo filmato a doppio colore con acquisizioni ripetute nel tempo di proteine del lievito, FET 3G FP e PMA uno RFP.

I primi 10 fotogrammi rappresentano immagini grezze e i fotogrammi rimanenti sono immagini elaborate. Per rendere possibile l'analisi, è fondamentale massimizzare il contrasto e rendere più nitide le immagini grezze sfocate. Turf e frap offrono una combinazione potente per lo studio della dinamica delle proteine corticali. L'uso di questa tecnica in cellule di B subtlest che esprimono G-F-P-M-B-L ha escluso il treadmilling come meccanismo responsabile della motilità osservata nelle aree contenenti MBL.

Il grafico chm della zona mobile e il profilo di intensità lungo il grafico chm indicato dalla linea tratteggiata sono mostrati in modo analogo al turf frap della membrana plasmatica del lievito. Un'analisi TPAs PMA ha rivelato i lenti riarrangiamenti delle proteine della membrana plasmatica del lievito, che si distribuiscono in domini simili a reti che coprono l'intera superficie cellulare dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada a ricerche nel campo della biologia cellulare dei batteri per esplorare il meccanismo della sintesi della parete cellulare in BA subtilis.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire immagini in campo oscuro di microrganismi come lieviti e batteri, e di come questa tecnica possa essere utile nello studio delle proprietà dinamiche delle proteine corticali.