Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di acquisire immagini di alta qualità, a riflessione interna totale, a fluorescenza o a tappeto erboso di microrganismi portatori di pareti cellulari. Ciò si ottiene preparando prima i vetrini coprioggetto e le celle. Il secondo passo consiste nell'allineare con precisione la configurazione del microscopio per una qualità dell'immagine ottimale.

Successivamente, vengono scelti gli incidenti, gli angoli e le condizioni di imaging corretti per l'acquisizione di immagini o filmati. La fase finale è l'elaborazione post-imaging delle immagini acquisite. In definitiva, la microscopia del tappeto erboso viene utilizzata per studiare le dinamiche della localizzazione delle proteine nella corteccia cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metalli eccedenti come quelli convenzionali o confocali per microscopia, è che il contrasto dell'immagine al microscopio è molto alto, consentendo tempi rapidi e scarsa illuminazione. In quanto tale, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle membrane, come i meccanismi della segregazione laterale delle proteine o la mobilità delle proteine di membrana. I vetrini coprioggetti per la microscopia del tappeto erboso devono essere puliti dalle particelle di polvere prima dell'uso.

Poiché il tappeto erboso è sensibile ai segnali di fondo derivanti dalla polvere su un vetrino coprioggetti sporco. Per iniziare la procedura di pulizia dei vetrini coprioggetto è necessario un vetrino coprioggetto pulito con meno sfondo. Usa una pinza per posizionare i vetrini coprioggetti in un supporto di ceramica con coperchio.

Quindi, riempi un contenitore di vetro con un molare di idrossido di sodio. Questo idrossido di sodio può essere riutilizzato più volte. Posizionare il supporto in ceramica contenente i vetrini coprioggetto nell'idrossido di sodio e incubare i vetrini per due ore con una rotazione lenta e continua.

Non incubare per più di otto ore, poiché ciò creerà vetrini coprioggetto opachi dopo due ore, lavare i vetrini coprioggetto con acqua distillata due volte per cinque minuti ogni volta sotto una lenta rotazione continua, conservare i vetrini coprioggetti puliti nel supporto in ceramica ricoperto di etanolo al 100%. Per preparare le cellule più sottili del bacillo per la microscopia del tappeto erboso, diluire a un OD 600 da 0,01 a 0,05 in cinque millilitri di terreno di coltura appropriato e crescere fino alla fase esponenziale. Preparare l'1,25% di aros in un mezzo sintetico, sciogliere la polvere di aros in un tubo di plastica da 1,5 millilitri a 95 gradi Celsius, quindi conservare in un blocco riscaldante a 72 gradi Celsius.

Aggiungere una piccola goccia di aros al centro di un vetrino e con un secondo vetrino, premere gli aros in un tampone piatto dopo almeno due minuti, separare accuratamente i vetrini. Centrifugare 500 microlitri di cellule più sottili del bacillo in una microcentrifuga a 12.000 giri/min per un minuto. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un terreno da 50 microlitri.

Aggiungere da due a quattro microlitri di cellule al centro del tampone aros. Quindi, utilizzare una pinza per rimuovere un vetrino coprioggetti pulito dal contenitore pieno di etanolo e asciugarlo con aria pressurizzata. Posizionare con cura il vetrino coprioggetto sul campione.

Lasciare riposare le cellule per almeno due minuti prima della microscopia. Per l'imaging a lungo termine, sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con la miscela riscaldata di vaselina, lanolina e paraffina o Val app. Per preparare le cellule di Saccharomyces visi per la microscopia del tappeto erboso, diluire una precoltura e farle crescere in terreni appropriati per almeno cinque ore.

Alla fase esponenziale, prelevare un vetrino coprioggetto dal contenitore pieno di etanolo e asciugarlo con aria pressurizzata con una pipetta. Cinque microlitri, conval e una o con una soluzione sul coperchio. Scivolare e asciugare con aria pressurizzata A si lega ai carboidrati della parete cellulare del lievito e immobilizza le cellule del lievito.

Quindi, trasferire 4,5 microlitri di una sospensione di cellule di lievito su un lato del con, un vetrino coprioggetti rivestito. Posizionare con cautela il vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso su un vetrino da microscopio, iniziando da un bordo e lasciando cadere lentamente. In questo modo si eviterà la formazione di bolle d'aria.

Lasciare riposare le cellule per almeno due minuti prima di sigillare al microscopio i bordi del vetrino coprioggetto con l'app val per l'imaging a lungo termine. Tutti gli esperimenti mostrati in questo video sono stati eseguiti su una configurazione personalizzata del tappeto erboso basata su un supporto IMEX completamente automatizzato con un obiettivo Olympus 100 x 1,45 NA. Le sorgenti luminose utilizzate sono diodi da 75 milliwatt, laser a stato solido pompato o DPSS a 488 nanometri e 561 nanometri.

Angoli del tappeto erboso e fluorescenza. Il recupero dopo il fotobleaching o la posizione frat può essere regolato istantaneamente tramite due galvanometri. Un terzo galvanometro viene utilizzato per passare da epi, fluorescenza, frap e tappeto erboso.

I galvanometri, che sono controllati direttamente dal software di acquisizione in tempo reale, consentono una semplice misurazione della cinetica di localizzazione per gli oggetti tracciati nelle immagini del tappeto erboso raccolte con una telecamera CCD EM e una lente di ingrandimento due x davanti alla telecamera. Anche l'acquisizione è controllata dal software di acquisizione in tempo reale. Prima di lavorare con il laser, indossare occhiali di sicurezza laser, proiettare il laser sul soffitto in modalità tappeto erboso e calibrare la posizione di zero gradi in modo che il laser sia in linea retta.

Con l'obiettivo, focalizzare il punto laser a una dimensione minima dopo una regolazione ottimale, il profilo laser dovrebbe formare un punto ben definito con una forma approssimativamente rotonda. Eseguire la calibrazione prima di ogni sessione. Per ottenere una qualità dell'immagine ottimale, l'allineamento del microscopio per tappeti erbosi è fondamentale per il successo di questa procedura.

L'incidenza, gli angoli e i parametri corretti per l'acquisizione delle immagini devono essere regolati con cura per una qualità dell'immagine ottimale. Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, identificare la posizione delle celle utilizzando l'illuminazione in campo chiaro. I LED rossi sono particolarmente buoni in quanto non inducono danni significativi alla foto.

Passa all'illuminazione laser e seleziona i laser e le combinazioni di filtri appropriati per eccitare i fluorofori di scelta, assicurandoti che l'angolo del tappeto erboso sia subcritico. In caso contrario, i segnali derivanti dalle proteine di fusione GFP non verranno rilevati. Trova la sezione superiore della cella, che è il lato della cella rivolto verso il vetrino coprioggetti.

Aumentare gradualmente l'angolo di incidenza del raggio laser fino a quando i segnali scompaiono, quindi diminuire lentamente l'angolo fino al punto in cui riappare la fluorescenza sulla superficie cellulare. Regolare nuovamente la messa a fuoco Z per una posizione ottimale sulla superficie. Gli angoli accettabili del tappeto erboso non creano un alone sfocato sul bordo della cellula, come illustrato da questo esempio di proteina di lievito.

PMA one GFP ripreso con angoli di incidenza decrescenti dall'alto a sinistra al basso a destra. Le immagini mostrano un'improvvisa perdita di segnale all'angolo critico e una progressiva diminuzione delle informazioni strutturali e del rapporto segnale/rumore, regolando l'intensità del laser e il guadagno della telecamera per massimizzare la gamma dinamica. In genere, le telecamere E-M-C-C-D sono ottimali per rilevare segnali molto bassi con un rapporto segnale/rumore elevato.

La microscopia del tappeto erboso è molto sensibile alle piccole altezze. Le differenze del vetrino coprioggetto si traducono in poche celle che possono essere visualizzate contemporaneamente. Questa immagine di una densa sospensione di perline fluorescenti è un esempio di un campo visivo irregolare in cui solo una parte del campo visivo è a fuoco.

Pertanto, per le piccole cellule, la regione di acquisizione può spesso essere ridotta a una sottoregione contenente l'oggetto scelto. Per gli esperimenti con tappeto erboso a doppio colore, lo spurgo dei fluorofori deve essere ridotto al minimo per le coppie R-F-P-G-F-P. Utilizzare filtri di emissione separati poiché la RFP viene eccitata settimanalmente da una luce a 488 nanometri.

Di seguito viene illustrato un flusso di lavoro tipico per evitare sbavature e l'imaging a due colori. Dopo aver acquisito l'imaging delle cellule con set di filtri separati, le immagini vengono devolute e allineate utilizzando perline fluorescenti prima di essere unite Per l'analisi, un parametro critico che influenza la qualità dell'immagine è l'allineamento laser e un obiettivo pulito. Dopo aver allineato il laser e messo a fuoco la posizione Z utilizzata per l'imaging del tappeto erboso, rimuovere il campione e pulire l'obiettivo da tutto l'olio.

L'olio residuo porterà alla diffrazione della luce laser e a macchie nel profilo del raggio. La microscopia del tappeto erboso può essere utilizzata per visualizzare la distribuzione degli omologhi dell'actina e degli enzimi della parete cellulare nelle cellule batteriche. In questo risultato rappresentativo, le cellule sottili del bacillus che esprimono fusioni GFP dell'actina hoog MBL o della transpeptidasi PBPH sono state visualizzate mediante tappeto erboso ed epifluorescenza regolare.

Le immagini qui riportate rappresentano proiezioni medie di una serie temporale per indicare l'area coperta da mobile. Patch MBL monitorate con diverse modalità di imaging. Il contorno blu nell'immagine sovrapposta indica il confine della cella visualizzato da un'immagine in campo chiaro.

La transpeptidasi PBPH espressa settimanalmente si localizza in chiazze corticali che sono difficilmente visibili dall'epifluorescenza, ma possono essere chiaramente distinte dal tappeto erboso. La ridotta penetrazione può essere osservata al meglio per il segnale P-B-P-H-G-F-P ai SEPTA indicati dalle frecce, che appaiono come linee in epifluorescenza, ma come punti nel tappeto erboso. La prossima serie di immagini mostra un confronto tra l'epifluorescenza e l'illuminazione del tappeto erboso del componente del complesso TOR, bit 61 in Saccharomyces visi.

Questa proteina viene espressa settimanalmente e forma piccole chiazze corticali con solo poche copie proteiche per cerotto. Nell'epifluorescenza sono visibili solo poche macchie sopra il forte sfondo, mentre le macchie possono essere visualizzate con un ottimo rapporto segnale/rumore nel tappeto erboso. Un ulteriore miglioramento del contrasto dell'immagine può essere ottenuto attraverso varie fasi di elaborazione delle immagini, come la sottrazione di immagini sfocate gaussiane o mediane, mentre la sottrazione locale dello sfondo rimuove il rumore e rende più nitide le strutture ad alta intensità.

Questo spesso avviene al prezzo di una perdita di strutture fini e di un'amplificazione esagerata delle regioni ad alta intensità. Come indicato dalla freccia, una procedura superiore è la deconvoluzione 2D, che può essere eseguita con pacchetti software gratuiti o disponibili in commercio. L'aumento del contrasto dopo la deconvoluzione è illustrato da questo filmato time-lapse di GFP RA due che mostra immagini alternate di tappeti erbosi grezzi e decentrati.

Poiché GFP RAs 2 è una proteina in rapido movimento, i tempi di acquisizione rapidi sono importanti per risolverla. Il suo comportamento dinamico. L'elaborazione delle immagini è particolarmente importante per le analisi di colocalizzazione, come illustrato in questo filmato a due colori time lapse di proteine di lievito, FET 3G FP e PMA one RFP.

I primi 10 fotogrammi rappresentano immagini raw e i fotogrammi rimanenti sono immagini devolute Per rendere possibile l'analisi, è fondamentale massimizzare il contrasto e rendere più nitide le immagini raw sfocate. Turf e frap offrono una potente combinazione per lo studio della dinamica delle proteine corticali. L'utilizzo di questa tecnica nelle cellule B più sottili che esprimono G-F-P-M-B-L ha escluso il treadmilling come meccanismo per la motilità osservata delle chiazze contenenti MBL.

Il grafico chm della zona in movimento e il profilo di intensità lungo il grafico chm indicato dalla linea tratteggiata sono mostrati in modo simile al frap del tappeto erboso della membrana plasmatica del lievito. Un PMA ha rivelato i lenti riarrangiamenti delle proteine della membrana plasmatica del lievito, che si distribuiscono in domini simili a reti che coprono l'intera superficie cellulare dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada a ricerche nel campo della biologia cellulare dei batteri per esplorare il meccanismo della sintesi della parete cellulare in BA subtilis.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire immagini del tappeto erboso di microrganismi come lieviti e batteri e di come questa tecnica possa aiutare nello studio delle proprietà dinamiche delle proteine corticali.