Name: Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Scopri la microscopia TIRF per studiare la dinamica delle proteine al cortice cellulare in microrganismi come lieviti e batteri. Questa tecnica offre alta risoluzione e contrasto per analisi in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Microscopia TIRF è la tecnica di scelta per proteine ​​di immagine periferici. La profondità bassa penetrazione del campo evanescente minimizza di luce fuori fuoco, che porta ad un ottimo segnale rispetto al rumore e consente di acquisizione dati con un frame rate elevati, o immagini di proteine ​​espresse molto debolmente. La combinazione di un elevato contrasto e frame rate elevati microscopia TIRF rende uno strumento ideale per immagini dinamiche spazio-temporali di proteine ​​localizzate corticale. È interessante no...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dello strumento / reagente </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Strumento </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Fino a </td><td></td><td> Configurazione personalizzata </td></tr><tr><td> Contenitore di vetro </td><td> Strumento </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Rastrello di colorazione Ceramic </td><td> Strumento </td><td> Sci Thomas. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalina A </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Coprivetrini # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscopio </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Microscopio </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Olio di immersione </td><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualizzazione di cortex organizzazione e dynamics in microrganismi, utilizzando total internal reflection fluorescence microscopy

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Microscopia TIRF è emerso come una tecnologia di imaging potente per studiare spazio-temporali dinamica delle molecole fluorescenti in vitro e in cellule viventi 1. Il fenomeno ottico di riflessione interna totale si verifica quando la luce passa da un mezzo con alto indice di rifrazione in un mezzo con indice di rifrazione basso ad un angolo maggiore di un angolo caratteristica critica (cioè più vicino ad essere parallelo al confine). Sebbene tutta la luce viene riflessa in tali condizioni, una onda evanescente viene creato attraverso e che si propaga lungo il confine, che decade esponenzialmente con la distanza, e penetra solo aree campione che sono 100-200 nm prossimità dell&#39;interfaccia 2. Oltre ad assicurare un&#39;elevata risoluzione assiale, l&#39;eccitazione ridotta di fluorofori fuoco crea un segnale molto alti rapporti di rumore e minimizza gli effetti dannosi di photobleaching 2,3. Essendo una tecnica widefield, TIRF permette anche più veloce di immagini acquisizione rispetto alla maggior parte di scansione in base configurazioni confocale. A prima vista, la profondità di penetrazione basso TIRF sembra essere incompatibile con imaging di cellule batteriche e fungine, spesso circondati da pareti cellulari spesse. Al contrario, abbiamo scoperto che le pareti cellulari del lievito e cellule batteriche effettivamente migliorare la utilizzabilità di TIRF e aumentare la gamma di strutture osservabili 4-8. Molti processi cellulari possono quindi accedere direttamente TIRF in piccoli microrganismi unicellulari, che spesso offrono potenti tecniche di manipolazione genetica. Questo ci permette di eseguire esperimenti in biochimica in vivo, dove la cinetica delle interazioni proteiche e delle attività può essere valutato direttamente in cellule viventi. Descriviamo qui le singole fasi necessarie per ottenere immagini di alta qualità per TIRF Saccharomyces cerevisiae o cellule di Bacillus subtilis. Segnaliamo vari problemi che possono Affect visualizzazione TIRF di sonde fluorescenti in cellule ed illustrare la procedura con esempi di applicazione diversi. Infine, abbiamo dimostrato come le immagini TIRF può essere ulteriormente migliorata utilizzando consolidate tecniche di restauro delle immagini.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia è un approccio efficace per osservare le strutture in prossimità della superficie cellulare ad elevato contrasto e risoluzione temporale. Abbiamo dimostrato come TIRF può essere utilizzato per studiare dinamica della proteina alla corteccia di cellule di cellule batteriche e fungine parete chiusi.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

La microscopia TIRF è emersa come una potente tecnologia di imaging per studiare le dinamiche spazio-temporali di molecole fluorescenti in vitro e in cellule viventi1. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini di alta qualità, mediante fluorescenza o riflessione totale interna, o immagini al microscopio ottico di microorganismi dotati di parete cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando le lamelle e le cellule. Il secondo passaggio consiste nell'allineare con precisione l'apparato microscopico per ottenere una qualità ottimale dell'immagine.Successivamente, si scelgono gli incidenti corretti, gli angoli e le condizioni di acquisizione per ottenere immagini o filmati. L'ultimo passaggio consiste nell'elaborazione post-acquisizione delle immagini ottenute. In definitiva, la microscopia TIRF viene utilizzata per studiare la dinamica della localizzazione delle proteine alla corteccia cellulare.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metalli eccessivi come la microscopia convenzionale o confocale è che il contrasto dell'immagine in microscopia è molto elevato, consentendo tempi rapidi e luce ridotta. Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle membrane, come i meccanismi di segregazione laterale delle proteine o la mobilità delle proteine

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Qui mostriamo i protocolli per l'esecuzione di singola molecola microscopia a fluorescenza a vivere cellule batteriche per permettere funzionali complessi molecolari per essere rilevati, monitorati e quantificati.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza.

Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per la visualizzazione di eventi esocitici nei neuroni corticali. Un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP) sensibile al pH emette fluorescenza dopo la fusione delle vescicole, con eccitazione...

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici 

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

Questo protocollo è una guida per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza su un microscopio a fluorescenza standard per l'imaging senza etichette, ad alto contrasto e ad alta velocità dei microtubuli utilizzando analisi in vitro.

Implementazione della microscopia di riflessione delle interferenze per l'imaging ad alta velocità e senza etichetta dei microtubuli

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Scopri la microscopia TIRF per studiare la dinamica delle proteine al cortice cellulare in microrganismi come lieviti e batteri. Questa tecnica offre alta risoluzione e contrasto per analisi in vivo.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Esplora altri video