Un test in vitro per studiare l'interazione tra neutrofili e biofilm

Un biofilm è una comunità di batteri aderenti alla superficie incorporati all'interno di una matrice di sostanze polimeriche extracellulari, EPS, di origine microbica.

Per studiare le interazioni cellula immunitaria-biofilm in vitro, prendere un vetrino con un canale contenente un biofilm di Staphylococcus aureus, un patogeno opportunista. I batteri ingegnerizzati esprimono una proteina fluorescente per la rilevazione microscopica. Il canale si collega a serbatoi riempiti di terreno per fornire sostanze nutritive ai batteri.

Aggiungere una sospensione di neutrofili marcati con un colorante fluorescente per il tracciamento delle cellule. Il terreno contiene anche un omodidimero di etidio, che colora il DNA delle cellule morte. Incubare in condizioni fisiologiche.

I recettori di riconoscimento dei modelli sui neutrofili si legano ai modelli molecolari associati ai patogeni sui batteri. Il legame induce i neutrofili a fagocitare i batteri e a produrre specie reattive extracellulari dell'ossigeno o ROS, uccidendo i batteri.

Per eludere la risposta immunitaria, i batteri rilasciano enzimi disintossicanti che diminuiscono i ROS e la tossina leucocidina che causa la morte cellulare. La leucocidina monomerica si lega a recettori specifici sui neutrofili e subisce la multimerizzazione per formare un poro, interrompendo l'integrità della membrana e uccidendo le cellule.

L'omodimero di etidio entra attraverso la membrana cellulare danneggiata, colorando le cellule morte.

Sotto un microscopio a fluorescenza ad ampio campo, un sottogruppo di cellule batteriche e neutrofili appare morto, indicando l'interazione neutrofilo-biofilm.

Utilizzare un ceppo fluorescente di S. aureus, come USA300 che esprime GFP, per facilitare l'imaging al microscopio. Incubare i neutrofili con 100 micromolari di BCD per 30 minuti in un bilanciere a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica atmosferica. Assicurarsi che i campioni siano incubati al buio e limitare l'esposizione alla luce.

Per lavare il BCD in eccesso, centrifugare i neutrofili a 270 RCF per cinque minuti e aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in HBSS fresco. Quindi, aggiungere l'omodimero di etidio-1 ai neutrofili colorati con BCD a una concentrazione finale di 4 micromolari per monitorare la morte dei neutrofili e dei batteri.

Lavare il biofilm con HBSS e aggiungere 150 microlitri di neutrofili al biofilm di S. aureus che è stato coltivato in microvetrini. Incubare i microvetrini in una camera umidificata per 30 minuti. Il numero di cellule batteriche si baserà sulla conta cellulare ottenuta dalla placcatura del biofilm di 18 ore.

Visualizzare l'interazione del biofilm neutrofilo utilizzando canali fluorescenti corrispondenti ai coloranti fluorescenti o alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione delle proteine.