Quantificazione basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da terapia

Prendi le cellule tumorali pretrattate con un farmaco chemioterapico che induce la senescenza in una percentuale di cellule.

Queste cellule accumulano granuli di lipofuscina autofluorescenti, un noto marcatore di senescenza.

Aggiungere un antibiotico che entra nelle cellule e inibisce le pompe protoniche lisosomiali, prevenendo l'acidificazione lisosomiale.

Un aumento del pH inattiva gli enzimi lisosomiali.

Le cellule senescenti sovraesprimono la β-galattosidasi lisosomiale anche a pH quasi neutro, rendendola un biomarcatore di senescenza.

Introdurre un substrato β-galattosidasi. Incubare.

La β-galattosidasi idrolizza il substrato internalizzato in un prodotto fluorescente, marcando le cellule senescenti.

Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Aggiungi un colorante per la vitalità cellulare. All'interno delle cellule vive, le esterasi attive convertono il colorante in un prodotto fluorescente impermeabile alla membrana. Le cellule morte con integrità della membrana compromessa rimangono non colorate.

Utilizzando la citometria a flusso, rilevare le cellule vitali che mostrano il doppio marcatore lipofuscina e substrato fluorescente della β-galattosidasi, indicando le cellule senescenti.

Quantificare la percentuale di cellule senescenti per dimostrare l'efficacia del farmaco.

In primo luogo, regolare il pH lisosomiale dei campioni di cellule in coltura aggiungendo una soluzione di un micromolare di bafilomicina A in DMEM al pellet cellulare a una concentrazione di una volta 10 per il sesto di cellule per millilitro e pipettare per mescolare. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius su un rotatore a bassa velocità. Quindi, per colorare la beta-galattosidasi associata alla senescenza, aggiungere ai campioni la soluzione madre DDAOG a 10 microgrammi per millilitro senza lavarli.

Porre su un rotatore per 60 minuti, al riparo dalla luce diretta. Come prima, centrifugare le provette. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di BSA ghiacciato allo 0,5% in PBS. Quindi, aggiungere 300 microlitri di soluzione diluita di viola calcinico 450 AM ai pellet cellulari lavati. Incubare per 15 minuti su ghiaccio al buio.

Trasferire i campioni di cellule in provette compatibili con strumenti di citometria a flusso. Nel software di acquisizione dati, aprire un istogramma del canale viola e un dot-plot del canale rosso lontano rispetto al canale verde. Avviare l'acquisizione dei dati del citometro a bassa velocità di aspirazione e posizionare i campioni di controllo positivi colorati con DDAOG sulla porta di aspirazione. Iniziare ad acquisire dati campione. Regolare le tensioni dei canali in modo che oltre il 90% degli eventi sia contenuto all'interno di ciascun grafico.

Quando tutte le impostazioni sono ottimali, registrare 10.000 eventi per campione. Posizionare i campioni di controllo solo per il veicolo macchiati con DDAOG sulla porta di aspirazione. Avvia l'acquisizione dei dati e registra 10.000 eventi per campione. Cerca un aumento dell'autofluorescenza o del segnale galattoside AF e DDAO rispetto al controllo positivo. Salvare i dati di esempio in formato . FCS ed esportare i file su una workstation dotata di software di analisi della citometria a flusso.