Quantificazione basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da terapia
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:19 min. • July 8th, 2025
Prendi le cellule tumorali pretrattate con un farmaco chemioterapico che induce la senescenza in una percentuale di cellule.
Queste cellule accumulano granuli di lipofuscina autofluorescenti, un noto marcatore di senescenza.
Aggiungere un antibiotico che entra nelle cellule e inibisce le pompe protoniche lisosomiali, prevenendo l'acidificazione lisosomiale.
Un aumento del pH inattiva gli enzimi lisosomiali.
Le cellule senescenti sovraesprimono la β-galattosidasi lisosomiale anche a pH quasi neutro, rendendola un biomarcatore di senescenza.
Introdurre un substrato β-galattosidasi. Incubare.
La β-galattosidasi idrolizza il substrato internalizzato in un prodotto fluorescente, marcando le cellule senescenti.
Centrifugare ed eliminare il surnatante.
Aggiungi un colorante per la vitalità cellulare. All'interno delle cellule vive, le esterasi attive convertono il colorante in un prodotto fluorescente impermeabile alla membrana. Le cellule morte con integrità della membrana compromessa rimangono non colorate.
Utilizzando la citometria a flusso, rilevare le cellule vitali che mostrano il doppio marcatore lipofuscina e substrato fluorescente della β-galattosidasi, indicando le cellule senes
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