Name: One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri un protocollo rapido per valutare le modalità di morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni ionizzanti mediante microscopia a fluorescenza con DAPI. Questo metodo consente di identificare apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza simultaneamente.

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Ringraziamo la signora Akiko Shibata per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da localizzativi dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone per i programmi per scuole laureate leader, coltivando Global Leaders in ingegneria e pesante dello ione Therapeutics.

1. preparazione dei materiali <ol><li>Autoclave vetrini coprioggetto.
	<ol><li>Posizionare i vetrini in un becher di vetro.</li>
		<li>Coprire il becher di vetro con lamina.</li>
		<li>Autoclave a 121 ° C a 15 psi per 20 min.</li>
		<li>Secca a 50 ° C. Conservare a temperatura ambiente in una cappa di cultura.</li>
	</ol></li> <li>Preparare soluzione di fissaggio: paraformaldeide 3% + 2% di saccarosio in tampone fosfato salino (PBS).
	<ol><li>a una bottiglia di vetro di 1.000 mL, aggiungere 700 mL di PBS e paraformaldeide 30 g. 
		Attenzione: Paraformaldeide è corrosivo, indossare guanti appropriati.</li>
		<li>Paraformaldeide sciogliere completamente dal riscaldamento a 80 ° C, utilizzando un forno a microonde. 
		Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici, indossare una maschera.</li>
		<li>Lasciare a temperatura ambiente per una notte.</li>
		<li>Aggiungere 20 g di saccarosio.</li>
		<li>Aggiungere PBS per rendere il volume totale di 1 L.</li>
		Tubi <li>aliquota in 50 mL. Soluzione di fissaggio può essere conservata per 3 anni a-20 ° C o 3 mesi a 4 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparazione della coltura delle cellule Nota: queste procedure devono essere eseguite in una cappa di cultura.
Cellule di osteosarcoma umano U2OS <ol><li>cultura e passaggio per mantenere la crescita logaritmica 5. 
	Nota: Altri tipi di cellule possono essere utilizzati dopo aver determinato la dose di irradiazione ottimale.</li>
	<li>Pulire un bisturi con asciugamani di carta inumiditi con etanolo al 70%. Utilizzando il bisturi, posizionare un coprioggetto su una piastra di coltura cellulare di 35mm (d'ora in poi semplicemente indicato come &#34; il piatto &#34;). 
	Nota: Il numero di vetrini in un piatto può essere aumentato secondo la sperimentale di progettazione (vedi discussione).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di coltura: DMEM completati con 10% siero bovino fetale. 
	Nota: Altri mezzi di comunicazione possono essere utilizzati secondo il tipo di cella scelta.</li>
	<li>Wipe forcipe con carta assorbente inumidito con etanolo al 70%. Utilizzando le pinze, premere delicatamente al centro del vetrino coprioggetti. Aspirare i terreni di coltura dal piatto completamente, pur mantenendo una stretta su vetrini coprioggetto. 
	&#8203; Nota: questo passaggio promuove immobilizzazione di vetrini coprioggetto al piatto.</li>
	<li>Staccare aderente cellule coltivate usando tripsina 5.
	<ol><li>Terreni di coltura dal piatto di aspirare.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS e agitare delicatamente il piatto.</li>
		<li>PBS aspirare dal piatto.</li>
		<li>Aggiungere tripsina 1 mL [0.25w/v% tripsina-1 mmol/L EDTA] al piatto.</li>
		<li>Incubare per 5 min a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2.</li>
		<li>Aggiungere 9 mL di coltura al piatto.</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta di 1000 μL, preparare una sospensione unicellulare.</li>
	</ol></li> <li>Contare le cellule 5.
	<ol><li>In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 0,9 mL di sospensione cellulare e 0,1 mL 0,4% soluzione di blu di Trypan.</li>
		<li>Applicare 10 μL di un emocitometro.</li>
		<li>Esaminare il numero di senza macchia (cioè, dal vivo) le cellule al microscopio invertito-fase.</li>
	</ol></li> <li>In una provetta da 15 mL, preparare 3 mL di sospensione cellulare in terreni di coltura ad una densità di 0.5 x 10 5 cellule/mL. 
	Nota: Cella densità possono essere modificate secondo sperimentale bisogno (Vedi discussione).</li>
	<li>Delicatamente aggiungere 2 mL di sospensione cellulare al piatto.</li>
	<li>Incubare durante la notte a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Irradiazione Attenzione: gestire l'irradiatore di raggi x con cura secondo il produttore &#39; istruzioni s.
<ol><li>Esaminare le cellule al microscopio invertito-fase. Confermare che le cellule siano fissate per il vetrino coprioggetto e vivo.</li>
	<li>Irradiare il piatto con 6 Gy dei raggi x (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>Incubare per 72 h a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2. 
	Nota: Il tempo di incubazione può essere modificato secondo la sperimentale di progettazione (Vedi discussione).</li>
</ol> 4. Fissazione <ol><li>terreni di coltura dal piatto di aspirare.</li>
	<li>Usando le forbici, tagliare la punta di una micropipetta 1.000 μL Suggerimento 5 mm dall'estremità. 
	Nota: La punta di taglio consente di applicare uniformemente la soluzione di fissazione.</li>
	<li>Usando la punta di taglio, aggiungere 1 mL di soluzione di fissazione (preparata al punto 1.2) al piatto da parete laterale del piatto. 
	Nota: Questo passaggio è tempo-sensibile e pertanto deve essere eseguito senza cambio micropipetta punte durante la manipolazione di campioni multipli. Applicazione di soluzione di fissaggio direttamente alla parte inferiore del piatto può danneggiare le cellule.</li>
	<li>Mettere il piatto in un piatto quadrato cultura. Agitare il piatto quadrato cultura delicatamente per distribuire uniformemente la soluzione di fissaggio sopra il vetrino coprioggetto.</li>
	<li>Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Soluzione di fissaggio aspirare dal piatto.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di PBS al piatto da parete laterale del piatto. 
	Nota: Applicazione di PBS direttamente alla parte inferiore del piatto può danneggiare le cellule.</li>
	<li>PBS aspirare dal piatto.</li>
	Ripetere i punti 4.7 e 4.8 due volte <li>. 
	Nota: Il piatto possa essere memorizzato per 1 settimana a 4 ° C con il coprioggetto bagnata in 2 mL di PBS.</li>
</ol> 5. Macchiatura di DAPI <ol><li>a un bicchiere di diapositiva, applicare 5 μL 1 μg/mL DAPI colorazione reagente. 
	Nota: Il reagente di colorazione DAPI è stabile per 6 mesi se conservato al riparo dalla luce pari o inferiore a -20 ° C.</li>
	<li>Usando un bisturi, rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto.</li>
	<li>Disegnare l'eccesso di PBS su vetrini coprioggetto toccando il bordo del vetrino coprioggetti con un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Montare il vetrino coprioggetto capovolto sulla goccia di DAPI colorazione reagente sul vetro diapositiva affinché le cellule sono esposte al reagente di colorazione DAPI. 
	Nota: Questo passaggio è tempo-sensibile. Essiccazione del DAPI colorazione reagente può portare alla macchiatura suboptimali.</li>
	<li>i campioni possono essere conservati per 1 anno a -20 ° C.</li>
</ol> 6. Acquisizione immagini <ol><li>esaminare il campione su un microscopio a fluorescenza. I nuclei sono visualizzati utilizzando il filtro DAPI. 
	Nota: Sia un 20x o una lente di olio X 60 possa essere utilizzati, secondo il ricercatore &#39; interesse. Quando si utilizza un obiettivo di olio X 60, aggiungere una goccia di olio sul vetrino coprioggetti. Fare attenzione che i campioni non tocchino la lente; in caso contrario, la lente può essere danneggiata.</li>
	<li>Acquisire immagini dei nuclei utilizzando una telecamera CCD e software di acquisizione di immagini digitali con le seguenti impostazioni e parametri: filtro DAPI, immagini monostrato, guadagno di 1 X e l'esposizione automatica.</li>
	Acquisizione di immagini di <li>finitura: Wipe il 20x lente con asciugamani di carta imbevuti di Pulitore lenti. Pulire il 60 X obiettivo olio con carta assorbente inumiditi con cloroformio.</li>
</ol> 7. Valutazione delle modalità di morte delle cellule clonogeniche <ol><li>In immagini selezionati casualmente, contare il numero dei nuclei che soddisfano i criteri per apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare fino a quando il numero totale di nuclei contati raggiunge 300. Eseguire questo passaggio in triplice copia per ogni impostazione sperimentale.
	<ol><li>Criteri per apoptosi: presenza di apoptotic corpi (cioè, nuclei condensati e frammentati) 6 , 7.</li>
		<li>Criteri per catastrofe mitotica: presenza di nuclei mostrando due o più distinti lobi o micronuclei 8 , 9 , 10.</li>
		<li>Criteri per la senescenza cellulare: presenza di senescenza-collegata heterochromatic fuochi (SAHF) (cioè, DNA nucleare che contiene i fuochi di brillanti, densi di 30-50) 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
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<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Di seguito sono riportati i passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, le cellule devono essere coltivate su piastra di coltura come uno strato monomolecolare perché una valutazione morfologica di DAPI-ha macchiato i nuclei è difficile per le celle multilivello. A tal fine, al punto 2.9, si raccomanda attenzione trasferimento di piastra di coltura in un'incubatrice; agitazione del piatto cultura genera un turbinio di cellule sospese che porta alla concentrazione di cellule al centro della piastra di coltura. Inoltre, overconfluence che conduce alle celle multilivello dovrebbe essere evitato. A tal fine, al punto 2.7, il numero delle cellule seminate su piastra di coltura può essere modificato basato sul tempo e l'intervallo tra l'irradiazione e la fissazione di raddoppiamento della popolazione. È consigliabile una confluenza di circa 80 al momento della fissazione. In secondo luogo, la velocità è importante nella fissazione e colorazione DAPI (cioè, i passaggi 4 e 5). Inter-campione incoerenza per quanto riguarda il tempo impiegato per questi passaggi può condurre all'eterogeneità nell'intensità del segnale DAPI nei nuclei, che potrebbe oscurare la valutazione morfologica.
Al punto 2.2, si può aumentare il numero di vetrini in un piatto di sola cultura; un massimo di quattro vetrini può essere collocato in un piatto di 35 mm, e il numero può essere ulteriormente aumentato utilizzando piatti più sostanziosi. Immissione più vetrini coprioggetto in ogni piatto di cultura consente il funzionamento efficiente di valutazione del corso di tempo per un dato trattamento (cioè, il coperchio scivola possa essere raccolti da una piastra di coltura uno per uno in più momenti di interesse).
Al punto 3.2, la dose di irradiazione può essere modificata secondo l'interesse dei ricercatori. L'applicazione di una dose costante di linee cellulari multiple consente il confronto della sensibilità per ogni modalità di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. D'altra parte, l'uso di dosi di sopravvivenza clonogenic iso per ogni linea cellulare consente il confronto dei profili di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. La dose di sopravvivenza clonogenic iso può essere determinata dalla sopravvivenza clonogenic assay12. Il valore di10 D, la dose che fornisce 10% sopravvivenza clonogenic, è un punto finale comune per la dose di sopravvivenza clonogenic iso.
Al punto 3.3, il tempo da irradiazione di fissazione può essere modificato secondo l'interesse dei ricercatori; Questo è importante perché il tempo di picco per apoptosi indotta da IR, catastrofe mitotica e senescenza cellulare varia secondo trattamento e linea cellulare. In questo articolo, abbiamo usato 72 h dopo irradiazione come il punto di tempo che sarebbe più utile per lo screening iniziale dei profili di morte delle cellule clonogeniche, basato su studi multipli dal nostro gruppo e altri descritto come segue1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-indotta apoptosi in cellule stabilite da tumori solidi per la maggior parte si verifica un paio di giorni dopo irradiazione. (ii) catastrofe mitotica X-ray-indotta in cellule di cancro si verifica più prominente al secondo o terzo mitosi dopo il rilascio dall'arresto temporaneo ciclo cellulare indotta da irradiazione. Il rilascio avviene di solito circa 24 h dopo irradiazione, seguita dalla mitosi ripetute ad intervalli di circa 24 h. (iii) X-ray – indotta senescenza cellulare diventa evidente dopo un intervallo dipende la linea cellulare in questione: 2 giorni dopo irradiazione per alcuni casi in anticipo e 7 giorni dopo irradiazione per la maggior parte delle linee cellulari. Dopo aver ottenuto un quadro complessivo della cella clonogenic profili di morte lo screening iniziale, tempo corso esperimenti forniranno una delucidazione più dettagliata del tempo di picco per ciascun modo di morte delle cellule clonogenic in linea cellulare specifica e/o condizione di di interesse4.
Si deve osservare che il DAPI colorazione dosaggio e l'analisi di sopravvivenza clonogenic, metodo gold standard per la valutazione di sensibilità di radiazione, non sono intercambiabili. Apoptosi e catastrofe mitotica solo durare per ore. Così, il dosaggio per un punto dato tempo di colorazione DAPI rileva apoptosi e catastrofe mitotica, che si verifica nel punto di volta della valutazione. D'altra parte, i risultati della sopravvivenza clonogenic assay in un dato momento punto includono la quantità totale di apoptosi e catastrofe mitotica che si era verificato durante il periodo di incubazione, in genere 10-14 giorni dopo l'irradiazione. Diverso da apoptosi e catastrofe mitotica, cellule senescenti rimangono sulla piastra di coltura; si accumulano gradualmente nel tempo dopo irradiazione. Pertanto, i risultati di entrambi il DAPI colorazione dosaggio e l'analisi di sopravvivenza clonogenic riflette l'importo totale della senescenza che si è verificato durante il periodo di incubazione. D'importanza, la proporzione di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza indotta da irradiazione varia notevolmente secondo la cella linea e irradiazione della dose. Presi insieme, teoricamente, i risultati di un test non possono essere convertiti direttamente in quelli di altri test.
Il dosaggio di colorazione DAPI ha alcune limitazioni. In primo luogo, resta controverso se catastrofe mitotica è una modalità distinta della morte delle cellule. Nel campo della biologia di radiazione, catastrofe mitotica è considerata una modalità principali di morte cellulare indotta da IR che è distinta da altri meccanismi di clonogenic delle cellule morte1. D'altra parte, altri sostengono che catastrofe mitotica non è una modalità distinta di morte delle cellule, ma piuttosto un processo che precede la morte delle cellule, tra cui l'apoptosi e necrosi13,14. Così, l'apoptosi e la catastrofe mitotica possono sovrapporsi in una certa misura. Precedenti, secondo gli studi suggeriscono che la senescenza cellulare può verificarsi in assenza di SAHF in alcune linee cellulari e trattamento impostazioni2. Al presente, altri saggi appositamente per ogni cella clonogenic morte modalità deve essere utilizzata per aumentare la robustezza delle conclusioni di un esperimento dato. In terzo luogo, il dosaggio di colorazione DAPI non può valutare modi di morte delle cellule clonogeniche diverso da apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare (ad es., la necrosi e l'autofagia). In quarto luogo, l'utilità di DAPI macchiatura saggio come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia non è stata chiarita nella clinica. Da questo punto di vista, l'analisi di sopravvivenza clonogenic, che valuta la quantità totale di morte delle cellule clonogeniche, è superiore al DAPI macchiatura saggio perché è stata stabilita una correlazione tra SF2, la frazione sopravvivente di cellule irradiate con 2 Gy I raggi x e la risposta del tumore alla radioterapia15. Tuttavia, è interessante nota che l'analisi di sopravvivenza clonogenic non è utilizzata ampiamente nella clinica, principalmente a causa del requisito per un elevato grado di competenza e un lungo periodo di tempo (cioè, 14 giorni) per l'acquisizione dati. In confronto, la procedura per il dosaggio di colorazione DAPI è più semplice e richiede significativamente meno tempo, circa 3-4 giorni, per generare i risultati. L'utilità della colorazione DAPIanalisi come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia sarà testato in clinica nel prossimo futuro.
In sintesi, il dosaggio di colorazione DAPI è un dosaggio di conveniente One-Step per valutare simultaneamente i tre modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic. Questo approccio permette facilmente dello schermo per le modalità della morte delle cellule clonogeniche per varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l'obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.

Radiazioni ionizzanti (IR) induce i modi multipli di morte delle cellule clonogenic. La ricerca sulla morte cellulare indotta da IR clonogenic è importante per capire la tossicità di IR ai tessuti normali, così come per lo sviluppo di metodi per aumentare l'efficacia del trattamento di radioterapia del cancro. Apoptosis, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR1. L'apoptosi è una modalità regolamentata di morte delle cellule che è iniziata dal DNA danni1. Catastrofe mitotica è la morte delle cellule che si verifica a causa di mitosi aberrante derivanti da unrepaired del DNA double-strand break1. La senescenza cellulare è definita come uno stato di irreversibile delle cellule crescita arresto2; Si noti che la senescenza cellulare non è la morte delle cellule per sé, ma è una modalità di morte delle cellule clonogeniche perché esso abolisce la sopravvivenza clonogenic della cella senescente.
Varie analisi cell-based sono state sviluppate per valutare individualmente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. L'apoptosi può essere valutata dal terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end etichettatura (TUNEL) colorazione, colorazione di annessina V, test di frammentazione del DNA e sub-G1 ciclo cellulare fase determinazione di flusso cytometry1. Catastrofe mitotica può essere valutata dall'immunofluorescenza che macchia per indicatori mitotici, compreso MPM2, macchiatura TUNEL e la microscopia elettronica1. Senescenza cellulare può essere valutata dalla macchiatura di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), saggi di arresto di crescita e di microscopia elettronica1. D'importanza, la modalità predominante della morte delle cellule clonogeniche differisce tra linee cellulari e trattamento impostazioni3,4. Pertanto, per delucidare il profilo complessivo di morte delle cellule clonogeniche per una determinata impostazione sperimentale, saggi multipli che copre tutte queste modalità di morte devono essere condotta insieme, che è ad alta intensità di manodopera e di costi.
In questo articolo, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare indotta da IR3,4. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono identificati ciascuno basato sulle rispettive morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. Questo approccio sarà utile per le applicazioni tra cui la selezione per profili clonogenic delle cellule morte in varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l'obiettivo di indagare i meccanismi della morte cellulare nelle cellule bersaglio e condizioni di interesse.

<table><tbody><tr><td>vetrino coprioggetti</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 35 mm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>tripsina</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>microscopio a fase invertita</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>irradiatore a raggi X</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>piatto di coltura quadrato</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>vetrino</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI reagente</td> <td>di colorazioneMicroscopio a fluorescenza a segnalazione cellulare</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> a<td>fluorescenza</td> Nikon <td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filtro DAPI</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>lente per microscopio a fluorescenza (20&times;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo & lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>lente per microscopio a fluorescenza (60&, olio)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; olio 60X/1.40</td><td></td></tr><tr><td>olio</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td>software di <td></td></tr><tr><td>acquisizione immagini digitali</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Document</td><td></td></tr><tr><td>lens cleaner</td><td>Cloroformio Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

one-step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule clonogenic da microscopia di fluorescenza

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere l'effetto di IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR, cioè, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare vengono identificati in base sulle morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. L'apoptosi è determinata dalla presenza di corpi apoptotici (cioè, nuclei condensati e frammentati). Catastrofe mitotica è determinata dalla presenza di nuclei che presentano due o più distinti lobi e micronuclei. La senescenza cellulare è determinata dalla presenza di senescenza-collegata heterochromatic fuochi (cioè, DNA nucleare che contiene i fuochi di brillanti, densi di 30-50). Questo approccio consente lo sperimentatore allo schermo facilmente per modalità di morte delle cellule clonogenic utilizzando varie linee cellulari, impostazioni di trattamento e/o punti di tempo, con l'obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.

Ad esempio, cellule umane di osteosarcoma U2OS erano trattate con 6 Gy dei raggi x, incubate per 72 h e sottoposti a DAPI test secondo il protocollo di colorazione. La figura 1 Mostra immagini ingrandite per le tipiche morfologie nucleare associate di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare ottenuta utilizzando una lente di olio 60 ×. Fare riferimento alla procedura 7.1.1-7.1.3 per le morfologie caratteristiche per ogni modalità di morte delle cellule clonogenic. Figura 2 Mostra immagini Panoramica dei nuclei ottenuti utilizzando un obiettivo X 20. L'irradiazione con raggi x Gy 6 indotto catastrofe mitotica frequentemente, meno frequentemente l'apoptosi e senescenza cellulare raramente. In questo modo, l'esame presso un campo di basso ingrandimento permette di catturare in un colpo d'occhio il quadro generale del profilo clonogenic delle cellule morte in un determinato ambiente sperimentale. La figura 3 Mostra una rappresentazione grafica dei dati quantificati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
Figura 1: ingrandita immagini di DAPI-ha macchiato i nuclei risultati tipiche morfologie di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini nucleare sono stati acquisiti utilizzando un 60 X lente di olio. Barra della scala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
Figura 2: Panoramica di immagini di DAPI-ha macchiato i nuclei delle cellule trattate con i raggi x. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x o mock-irradiati. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini dei nuclei sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo X 20. Cerchi, apoptosi; frecce, catastrofe mitotica. Barra della scala = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
Figura 3: dati quantificati per apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare indotto in cellule trattate con i raggi x. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x o mock-irradiati. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini dei nuclei sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo X 20. Da campi aleatori, un totale di 300 nuclei sono stati valutati per apoptosi (Ap), catastrofe mitotica (MC) e senescenza cellulare (Sns). Le valutazioni sono state eseguite in triplice copia. I valori medi sono mostrati, e barre di errore indicano le deviazioni standard. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere gli effetti della IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di uno stadio per valutare i modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic basata sulla morfologia di 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)-macchiato i nuclei visualizzati da microscopia di fluorescenza.

One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

L'obiettivo generale di questo saggio è quello di valutare le principali modalità di morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni ionizzanti sulla base delle morfologie caratteristiche dei nuclei colorati con DAPI. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle radiazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rapida ed economica è che le principali modalità di morte cellulare clonogenica indotta dalle radiazioni ionizzanti possono essere valutate simultaneamente.In generale, gli individui che non conoscono la biologia delle radiazioni avranno difficoltà a valutare la morte cellulare clonogenica indotta dalle radiazioni perché sono necessari diversi test per valutare ciascuna modalità di morte cellulare. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo eseguito uno screening su larga scala della morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni utilizzando più linee cellulari e dosi di radiazioni. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia delle radiazioni, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la chemioterapia per il cancro.A dimostrare la procedura sarà il nostro collaboratore, Atsushi Shibata. Inizia sterilizzando un bisturi con carta assorbente inumidita con etanolo al 70%. Quindi utilizzare il bisturi per posizionare un vetrino coprioggetti in una capsula di coltura cellulare da 35 millimetri.Al piatto di coltura con il vetrino coprioggetto, aggiungere un millilitro di terreno di coltura. A questo punto, tenere delicatamente il centro del vetrino coprioggetto con una pinza sterile e aspirare completamente il terreno di coltura dalla piastra. Quindi, preparare una sospensione cellulare da tre millilitri in terreno di coltura in una provetta da 15 millilitri.Aggiungere la sospensione cellulare al piatto di coltura. E incubarlo per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Assicurarsi che le cellule siano attaccate al vetrino coprioggetto e siano vive esaminandole con un microscopio a contrasto di fase invertito.Ora irradiare la parabola con radiazioni a raggi X a sei grigi. Dopo l'irradiazione, incubare le cellule in un incubatore per 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Ora prelevare le cellule dall'incubatrice e aspirare il terreno di coltura dal piatto di coltura.Tagliare la punta di una micropipetta da 1.000 microlitri a circa cinque millimetri dall'estremità usando le forbici. E usalo per aggiungere un millilitro di soluzione di fissazione al piatto di coltura. Applicare la soluzione di fissazione lungo le pareti del piatto di coltura per ridurre al minimo i danni alle cellule.Quindi trasferire questo piatto di coltura in un piatto di coltura quadrato e agitarlo delicatamente per distribuire uniformemente la soluzione di fissaggio sul vetrino coprioggetti. Successivamente, incubare il piatto per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di fissaggio dal piatto.Ora aggiungi due millilitri di PBS lungo le pareti del piatto. E poi aspirare il PBS. Per prepararsi alla colorazione DAPI, aggiungere cinque microlitri di reagente per colorazione DAPI su un vetrino.Quindi rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto utilizzando un bisturi. E scaricare il PBS in eccesso sul vetrino coprioggetto toccando il bordo del vetrino coprioggetto con un tovagliolo di carta. Montare ora il vetrino coprioggetti capovolto sulla goccia di reagente di colorazione DAPI sul vetrino in modo che le cellule siano esposte al reagente di colorazione DAPI.Infine, esaminare le cellule colorate con un microscopio a fluorescenza dotato di filtro DAPI. Vengono mostrate le morfologie nucleari in ciascuna delle tre modalità di morte cellulare. Si osserva che le cellule apoptotiche hanno nuclei condensati.Lobi multipli sono osservati nei nuclei delle cellule sottoposte a catastrofe mitotica. Si è visto che le cellule sottoposte a senescenza mostrano caratteristici focolai di eterocromatina associati alla senescenza. Viene mostrata un'osservazione comparativa di nuclei irradiati con simulazioni e nuclei irradiati con sei raggi X grigi.I cerchi indicano i nuclei in fase di apoptosi e le frecce indicano i nuclei in fase di catastrofe mitotica. Viene mostrata la valutazione di circa 300 nuclei sottoposti ad irradiazione rispetto al mock. Si è visto che l'irradiazione a raggi X dei sei grigi causa più frequentemente la catastrofe mitotica a circa il 25%, seguita dall'apoptosi a circa il 5% e da eventi di senescenza molto rari.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare le celle applicando le soluzioni direttamente sui vetrini. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi citofluorimetrica o le proteine marcatrici di morte cellulare, nonché la colorazione con beta-galattosidasi associata alla senescenza per valutare la senescenza per comprendere ulteriormente ciascuna modalità di morte cellulare clonogenica.

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L'applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell&#39;espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

Questo video dimostra la metodologia per lo screening dei principali profili di morte cellulare cellulare nelle linee cellulari tumorali indotte da radiazioni ionizzanti (IR) utilizzando il saggio di colorazione DAPI. I nuclei colorati con DAPI delle cellule bersaglio in fase di morte cellulare mostrano morfologie distinte e possono essere facilmente identificati mediante microscopia a fluorescenza.

Screening della morte cellulare mediante colorazione DAPI: un metodo per lo screening rapido della morte cellulare clonogenica indotta da IR in linee cellulari cancerose

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.

Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Descriviamo qui un protocollo per studiare la citotossicità di pre-attivato CD8+ T cellule contro le cellule tumorali dalla rilevazione apoptotic microscopia del cancro cellule via in tempo reale. Questo protocollo può studiare i meccanismi dietro la soppressione delle cellule T indotta da cellula mieloide e valutare composti puntati replenishing T cellule tramite blocco delle cellule mieloidi soppressive immuni.

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all'interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.

Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per studiare e quantificare la morte cellulare negli organoidi del colon umano in risposta a perturbageni citotossici come le citochine. L'approccio impiega un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), la microscopia a fluorescenza dal vivo e un software di analisi delle immagini open source per quantificare le risposte di singoli organoidi a stimoli citotossici.

Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

Scopri un protocollo rapido per valutare le modalità di morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni ionizzanti mediante microscopia a fluorescenza con DAPI. Questo metodo consente di identificare apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza simultaneamente.

One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza (Video) | JoVE Journal

One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza

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