One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza

L'obiettivo generale di questo saggio è quello di valutare le principali modalità di morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni ionizzanti sulla base delle morfologie caratteristiche dei nuclei colorati con DAPI. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle radiazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rapida ed economica è che le principali modalità di morte cellulare clonogenica indotta dalle radiazioni ionizzanti possono essere valutate simultaneamente.

In generale, gli individui che non conoscono la biologia delle radiazioni avranno difficoltà a valutare la morte cellulare clonogenica indotta dalle radiazioni perché sono necessari diversi test per valutare ciascuna modalità di morte cellulare. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo eseguito uno screening su larga scala della morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni utilizzando più linee cellulari e dosi di radiazioni. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia delle radiazioni, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la chemioterapia per il cancro.

A dimostrare la procedura sarà il nostro collaboratore, Atsushi Shibata. Inizia sterilizzando un bisturi con carta assorbente inumidita con etanolo al 70%. Quindi utilizzare il bisturi per posizionare un vetrino coprioggetti in una capsula di coltura cellulare da 35 millimetri.

Al piatto di coltura con il vetrino coprioggetto, aggiungere un millilitro di terreno di coltura. A questo punto, tenere delicatamente il centro del vetrino coprioggetto con una pinza sterile e aspirare completamente il terreno di coltura dalla piastra. Quindi, preparare una sospensione cellulare da tre millilitri in terreno di coltura in una provetta da 15 millilitri.

Aggiungere la sospensione cellulare al piatto di coltura. E incubarlo per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Assicurarsi che le cellule siano attaccate al vetrino coprioggetto e siano vive esaminandole con un microscopio a contrasto di fase invertito.

Ora irradiare la parabola con radiazioni a raggi X a sei grigi. Dopo l'irradiazione, incubare le cellule in un incubatore per 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Ora prelevare le cellule dall'incubatrice e aspirare il terreno di coltura dal piatto di coltura.

Tagliare la punta di una micropipetta da 1.000 microlitri a circa cinque millimetri dall'estremità usando le forbici. E usalo per aggiungere un millilitro di soluzione di fissazione al piatto di coltura. Applicare la soluzione di fissazione lungo le pareti del piatto di coltura per ridurre al minimo i danni alle cellule.

Quindi trasferire questo piatto di coltura in un piatto di coltura quadrato e agitarlo delicatamente per distribuire uniformemente la soluzione di fissaggio sul vetrino coprioggetti. Successivamente, incubare il piatto per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di fissaggio dal piatto.

Ora aggiungi due millilitri di PBS lungo le pareti del piatto. E poi aspirare il PBS. Per prepararsi alla colorazione DAPI, aggiungere cinque microlitri di reagente per colorazione DAPI su un vetrino.

Quindi rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto utilizzando un bisturi. E scaricare il PBS in eccesso sul vetrino coprioggetto toccando il bordo del vetrino coprioggetto con un tovagliolo di carta. Montare ora il vetrino coprioggetti capovolto sulla goccia di reagente di colorazione DAPI sul vetrino in modo che le cellule siano esposte al reagente di colorazione DAPI.

Infine, esaminare le cellule colorate con un microscopio a fluorescenza dotato di filtro DAPI. Vengono mostrate le morfologie nucleari in ciascuna delle tre modalità di morte cellulare. Si osserva che le cellule apoptotiche hanno nuclei condensati.

Lobi multipli sono osservati nei nuclei delle cellule sottoposte a catastrofe mitotica. Si è visto che le cellule sottoposte a senescenza mostrano caratteristici focolai di eterocromatina associati alla senescenza. Viene mostrata un'osservazione comparativa di nuclei irradiati con simulazioni e nuclei irradiati con sei raggi X grigi.

I cerchi indicano i nuclei in fase di apoptosi e le frecce indicano i nuclei in fase di catastrofe mitotica. Viene mostrata la valutazione di circa 300 nuclei sottoposti ad irradiazione rispetto al mock. Si è visto che l'irradiazione a raggi X dei sei grigi causa più frequentemente la catastrofe mitotica a circa il 25%, seguita dall'apoptosi a circa il 5% e da eventi di senescenza molto rari.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare le celle applicando le soluzioni direttamente sui vetrini. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi citofluorimetrica o le proteine marcatrici di morte cellulare, nonché la colorazione con beta-galattosidasi associata alla senescenza per valutare la senescenza per comprendere ulteriormente ciascuna modalità di morte cellulare clonogenica.