Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

Prendi una criosezione tissutale di carcinoma a cellule renali che mostra cellule T CD8+ infiltranti nel suo microambiente tumorale.

Trattalo con acetone per fissare e permeabilizzare il tessuto. Lavare per rimuovere l'acetone in eccesso.

Aggiungi avidina per saturare la biotina del tessuto endogeno. Successivamente, aggiungi la biotina per bloccare i siti di legame dell'avidina immobilizzati, riducendo al minimo le interazioni non specifiche.

Applicare siero contenente immunoglobuline per bloccare i recettori Fc delle cellule immunitarie, prevenendo il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere un cocktail di anticorpi primari che hanno come bersaglio CD8, un marcatore citotossico delle cellule T, e PD-1 e Tim-3, recettori inibitori espressi da sottopopolazioni di cellule T CD8+ resistenti all'immunoterapia.

Introdurre distinti anticorpi secondari marcati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi anti-CD8 e anti-Tim-3.

Aggiungere anticorpi secondari biotinilati che prendono di mira gli anticorpi anti-PD-1 e una diversa streptavidina marcata con fluoroforo che si lega alla biotina.

Applicare un mezzo di montaggio contenente colorante per colorare i nuclei delle cellule e posizionare un vetrino coprioggetti.

Acquisire immagini a fluorescenza multispettrale per identificare le cellule T CD8+ infiltranti il tumore e le sottopopolazioni resistenti all'immunoterapia che esprimono PD-1, Tim-3 o entrambe.

Dopo lo scongelamento, utilizzare un tovagliolo di carta per asciugare accuratamente i vetrini attorno alle sezioni di tessuto e circondare i tessuti con una penna barriera idrofobica. Quando la barriera si è asciugata, fissare i campioni in acetone al 100% per 5 minuti, seguiti da 2 minuti di asciugatura all'aria. Quindi, lavare i vetrini in TBS per 10 minuti.

Pretrattare i vetrini con tre gocce di avidina allo 0,1% per 10 minuti al buio. Quindi, tocca o scorri i vetrini per coprire il tessuto con la soluzione di avidina. Aggiungere tre gocce di biotina allo 0,01% a ciascun campione e toccare o scorrere la biotina sui campioni, seguita da un lavaggio TBS, come appena dimostrato. Quindi, bloccare qualsiasi legame aspecifico con 100 microlitri di siero normale al 5% in TBS per 30 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, picchiettare i vetrini per rimuovere il siero in eccesso, e incubare i vetrini in 100 microlitri del cocktail di anticorpi primari di interesse per 1 ora in una camera umidificata. Lavare i vetrini marcati con anticorpi in TBST per 5 minuti.

Dopo l'essiccazione, etichettare le cellule con 100 microlitri del cocktail di anticorpi secondari di interesse per 30 minuti nella camera umidificata, seguita da un lavaggio di 10 minuti in TBS. Incubare i vetrini etichettati con anticorpi secondari essiccati con 100 microlitri del cocktail di anticorpi terziari di interesse per 30 minuti, seguiti da un lavaggio finale di 10 minuti con TBS.

Al termine del lavaggio, asciugare i vetrini e montare i tessuti con il mezzo di montaggio integrato DAPI. Quindi, coprire ogni diapositiva con un vetrino coprioggetti e lasciare riposare il supporto di montaggio per almeno 2 ore.

Per scansionare i vetrini, aprire il software del microscopio e caricare il protocollo di scansione delle immagini. Caricare il primo vetrino sul tavolino del microscopio. Quindi, nella barra di controllo, fare clic su Imposta esposizione e regolare il tempo di esposizione per ciascun filtro fino a ottenere un segnale sufficiente ma non saturante.

Fare clic su Start nel pannello superiore e aprire la cartella ID lab. Immettere l'ID della prima diapositiva e fare clic su Avanti.

Per acquisire la panoramica del vetrino in condizioni di luce in campo chiaro con un ingrandimento 4x, fare clic su Imaging monocromatico e Trova campione. Per selezionare l'area di tessuto da scansionare, premere il tasto Ctrl e utilizzare il cursore per selezionare o deselezionare le regioni di interesse da scansionare con l'ingrandimento 4x.

Per ottenere un'immagine fluorescente rosso-blu-verde di ciascuna regione, fare clic su Imaging a bassa potenza. Per la selezione del campo ad alta potenza, premere il tasto Ctrl e selezionare almeno cinque regioni di interesse che corrispondono alle aree del tessuto che verranno scansionate con l'ingrandimento 20x.

Quindi, per ottenere un'acquisizione di immagini multispettrali di ciascun campo, fare clic su Imaging ad alta potenza, quindi su Archiviazione dati per memorizzare le immagini nella cartella ID laboratorio appropriata.