Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

Prendi una criosezione tissutale di carcinoma a cellule renali che mostra cellule T CD8+ infiltranti nel suo microambiente tumorale.

Trattalo con acetone per fissare e permeabilizzare il tessuto. Lavare per rimuovere l'acetone in eccesso.

Aggiungi avidina per saturare la biotina del tessuto endogeno. Successivamente, aggiungi la biotina per bloccare i siti di legame dell'avidina immobilizzati, riducendo al minimo le interazioni non specifiche.

Applicare siero contenente immunoglobuline per bloccare i recettori Fc delle cellule immunitarie, prevenendo il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere un cocktail di anticorpi primari che hanno come bersaglio CD8, un marcatore citotossico delle cellule T, e PD-1 e Tim-3, recettori inibitori espressi da sottopopolazioni di cellule T CD8+ resistenti all'immunoterapia.

Introdurre distinti anticorpi secondari marcati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi anti-CD8 e anti-Tim-3.

Aggiungere anticorpi secondari biotinilati che prendono di mira gli anticorpi anti-PD-1 e una diversa streptavidina marcata con fluoroforo che si lega alla biotina.

Applicare un mezzo di montaggio contenente colorante per colorare i nuclei delle cellu