Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

L'elevato volume di informazioni biologiche ottenute dall'analisi delle immagini con codice a barre multiplex consente agli scienziati di comprendere meglio il microambiente tumorale e la distribuzione speciale all'interno delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questo metodo è che ci fornisce informazioni molto più dettagliate dallo stesso campione di tessuto con la possibilità di fare una fenotipizzazione più profonda delle singole cellule. Questo metodo ha permesso a pannelli personalizzabili di studiare il microambiente tumorale per scoprire potenzialmente biomarcatori predittivi nel tessuto tumorale da utilizzare come nuovo trattamento target.

Per iniziare la colorazione anticorpale coniugata con oligonucleotidi, immergere i vetrini di copertura in una soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% per 24 ore, a temperatura ambiente per prepararli al posizionamento e all'aderenza dei tessuti. Dopo aver drenato la soluzione di Poly-L-Lisina, lavare i vetrini di copertura con acqua ultrapura per 30 secondi. Dopo il lavaggio, rimuovere i foglietti di copertura dall'acqua ultrapura e metterli su un asciugamano privo di lanugine per asciugarli durante la notte.

Posizionare sezioni spesse 5 micron del tessuto di interesse al centro di un vetrino di copertura caricato con poli-L-lisina e lasciarle asciugare durante la notte. Preriscaldare un portaslip di copertura in un forno a 60 gradi Celsius, durante la notte. Inserire il vetrino contenente sezioni di tessuto nel supporto preriscaldato.

Dopo averlo cotto a 60 gradi Celsius per 30 minuti, controllare che la paraffina si sia sciolta dal tessuto. Posizionare rapidamente il portavetrino contenente il campione in sequenza, in una serie di soluzioni. Infine, posizionare il portavetrina in acqua ultrapura trattata con DEPC per due giri di cinque minuti ciascuno.

Preparare una camera di umidità posizionando un tovagliolo di carta imbevuto d'acqua sul fondo di una scatola di punta della pipetta vuota. Riempire una pentola a pressione con acqua, sufficiente a coprire metà dell'altezza di un becher da 50 millilitri. Mettere 5 millilitri di metanolo per campione in un becher a 4 gradi Celsius.

Diluire il volume richiesto di tampone AR9 a 1X con pirocarbonato etilico o acqua ultrapura trattata con DEPC. Quindi, riempire un becher di vetro da 50 millilitri con circa 40 millilitri del tampone AR9 diluito. Immergere il campione nel portaslip di copertura nel becher e coprire completamente il becher con un foglio di alluminio.

Posizionare il becher ricoperto di fogli di alluminio nella pentola a pressione riempita d'acqua e cuocere a circa 15 PSI per 20 minuti. Quindi rimuovere il becher e scartare con cura il foglio di alluminio. Lasciare raffreddare il becher a temperatura ambiente per circa 10 minuti.

Rimuovere il supporto della slitta dal buffer 1X AR9. Incubarlo due volte in acqua ultrapura trattata con DEPC per due minuti. Nel frattempo, recuperare il tampone di idratazione, il diluente anticorpale e le soluzioni bloccanti N, G, J e S dal kit di colorazione multiplexato.

Posizionare il campione di coperchio in 5 millilitri del tampone di idratazione due volte, per due minuti ciascuna. Quindi posizionare il campione di vetrino di copertura in 5 millilitri del blocco diluente anticorpale multiplex di imaging e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi.

Dopo l'incubazione, posizionare il vetrino di copertura nella camera di umidità precedentemente preparata. Pipettare 190 microlitri del cocktail di anticorpi sul campione di vetrino di copertura e incubare a temperatura ambiente per tre ore. Quindi, lavare il campione due volte, ciascuna con 5 millilitri del blocco diluente anticorpale multiplex per due minuti.

Per fissare gli anticorpi legati al tessuto, incubare i vetrini di copertura per 10 minuti in 16% di formaldeide diluita all'1,6% con soluzione di conservazione e lavarli tre volte con PBS. Dopo aver incubato il coperchio scivola per cinque minuti in metanolo, pre-raffreddare a 4 gradi Celsius. Dopo il lavaggio, incubare nuovamente i vetrini di copertura per 20 minuti, in 5 millilitri del reagente fissativo diluito con PBS e lavarli tre volte con PBS prima di conservarli.

Prepara il master mix del reporter seguendo la composizione menzionata nel testo. Riempire un pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con 245 microlitri di una soluzione contenente il master mix reporter e i fluorofori specifici con codice a barre per quel ciclo sperimentale. La figura mostra una configurazione della piastra reporter utilizzata qui per un pannello di carcinoma.

Per proteggere i fluorofori con codice a barre, far aderire un coperchio della piastra di alluminio sopra la piastra reporter a 96 pozzetti e posizionare la piastra all'interno dello strumento di imaging multiplexato. Calibrare la messa a fuoco dell'imaging utilizzando il canale DAPI posizionando un vetrino di copertura del campione sullo stadio del microscopio e pipettare manualmente 700 microlitri di una titolazione 1:1500 di una soluzione di colorazione nucleare sul tessuto. Per preparare lo strumento di imaging multiplexato, diluire il tampone di imaging multiplexato 10X a 1X utilizzando acqua ultrapura trattata con DEPC e riempire i flaconi di reagente con soluzioni o solventi appropriati.

Impostare tutti i parametri del microscopio e selezionare le regioni di interesse sul foglietto di copertina del campione da fotografare. Inserire il progetto sperimentale nel software di gestione degli strumenti. Fare clic sul pulsante Esperimento nel software di controllo e nella finestra Configurazione e gestione esperimento fare clic sul pulsante Nuovo modello.

Digitare il nome del progetto nello spazio accanto al pulsante Progetto e immettere il numero totale di cicli. Fare clic sul pulsante Assegnazione canale, digitare le informazioni per ogni ciclo nelle colonne, come il ciclo corretto, i numeri dei pozzi, i posti Z-stack, il nome del marcatore, la classe e il tempo di esposizione per ogni ciclo. Quindi avvia l'esperimento facendo clic su Avvia esperimento e salvalo.

Fare clic sull'icona QuPath sul computer e aprire il software. Trascinare il file qptiff nella finestra del visualizzatore. Fare clic sul pulsante Luminosità e contrasto per aprire la finestra Contrasto luminosità.

Selezionare o deselezionare l'indicatore nella colonna selezionata per mostrare o nascondere il segnale del marcatore. Fare clic sul pulsante zoom per adattare per ingrandire o ridurre l'area di interesse. Se visualizzate utilizzando il software di analisi delle immagini, le immagini composite mostravano tutti i marcatori o i marcatori selezionati come desiderato.

Sono stati rivelati l'intensità del segnale, la gamma dinamica e la distribuzione spaziale di tutti i marcatori. Questa tecnica ha permesso l'analisi di tutti i 26 marcatori a livello subcellulare in una singola sezione di tessuto. Seguendo il processo di analisi delle immagini multiplex, con approcci informatici è possibile elaborare e analizzare i dati ad alta dimensione di singole cellule per dedurre intuizioni biologiche e cliniche.

L'analisi delle immagini con codice a barre multiplexing è una potente metodologia che consente agli scienziati di profilare il tessuto tumorale e rispondere alla loro domanda di ricerca in base ai marcatori nei pannelli.