Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1^{+ +} Tim-3 CD8⁺ T cellule

L'obiettivo generale di questa analisi di immunofluorescenza multiplex è quello di contare automaticamente le cellule in base al loro fenotipo. Questo metodo consente la multifluorescenza e la conta cellulare automatica per analizzare il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie tumorali all'interno di un microambiente tumorale. Questa tecnologia ha facilitato la generazione di due tipi di prognosi composita per la previsione da parte dei marcatori derivati direttamente dal microambiente tumorale.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la procedura di fenotipizzazione è molto lunga e i dati grezzi risultanti richiedono un'ulteriore elaborazione. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di caratterizzare il fenotipo e le interazioni immunologiche delle cellule miranty annhodge. Dopo lo scongelamento, utilizzare un tovagliolo di carta per asciugare accuratamente i vetrini attorno alle sezioni di tessuto e quindi circondare i tessuti con una penna barriera idrofobica.

Quando la barriera si è asciugata, fissare i campioni in acetone al 100% per cinque minuti, seguiti da due minuti di asciugatura all'aria, quindi lavare i vetrini in TBS per 10 minuti. Pretrattare i vetrini con 3 gocce di avidina allo 0,1% per 10 minuti al buio, quindi picchiettare o scorrere i vetrini per coprire il tessuto con la soluzione di avidina. Aggiungere 3 gocce di biotina allo 01% a ciascun campione, quindi toccare o scorrere la biotina sui campioni, quindi eseguire un lavaggio TBS come appena dimostrato.

Quindi bloccare qualsiasi legame aspecifico con 100 microlitri di siero normale al 5% in TBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, picchiettare i vetrini per rimuovere il siero in eccesso e incubare i vetrini in 100 microlitri del cocktail di anticorpi primari di interesse per un'ora in una camera umidificata. Lavare i vetrini marcati con gli anticorpi in TBST per cinque minuti.

Dopo l'essiccazione, etichettare le cellule con 100 microlitri del cocktail di anticorpi secondari di interesse per 30 minuti nella camera umidificata, seguito da un lavaggio di 10 minuti in TBS. Incubare i vetrini etichettati con anticorpi secondari essiccati con 100 microlitri del cocktail di anticorpi terziari di interesse per 30 minuti seguiti da 10 minuti di lavaggio TBS. Al termine del lavaggio, asciugare i vetrini e montare i fazzoletti con un mezzo di montaggio integrato dapi.

Quindi trifoglio ogni vetrino con un vetrino coprioggetti e lascia riposare il supporto di montaggio per almeno due ore. Per scansionare i vetrini, aprire il software del microscopio e caricare il protocollo di scansione delle immagini. Caricare il primo vetrino sul tavolino del microscopio.

Quindi, nella barra di controllo, fare clic su imposta esposizione e regolare il tempo di esposizione per ciascun filtro fino a ottenere un segnale sufficiente ma non saturante. Fai clic su start nel pannello superiore e apri la cartella LabID. Immettere l'ID della prima diapositiva e fare clic su Avanti.

Per acquisire la panoramica del vetrino in condizioni di luce a campo chiaro con un ingrandimento 4x, fare clic sull'imaging monocromatico e trovare il campione. Per selezionare l'area di tessuto da scansionare, premere il tasto Ctrl e utilizzare il cursore per selezionare o deselezionare le regioni di interesse da scansionare con l'ingrandimento 4x. Per ottenere un'immagine fluorescente rosso/blu/verde di ciascuna regione, fare clic su immagine a bassa potenza.

Per la selezione del campo ad alta potenza, premere il tasto Ctrl e selezionare almeno cinque regioni di interesse che corrispondono alle aree del tessuto che verranno scansionate con l'ingrandimento 20x. Quindi, per ottenere un'acquisizione di immagini multispettrali di ciascun campo, fare clic su Immagine ad alta potenza e fare clic su Archiviazione dati per memorizzare le immagini nella cartella ID laboratorio appropriata. Per creare un nuovo progetto nel menu file, selezionare nuovo progetto, nel menu della funzione di ricerca, selezionare la segmentazione delle celle e, nel menu di digitazione fenotipica, selezionare la tipizzazione fenotipica, quindi fare clic su configura.

In formato immagine, selezionare multispettrale. Nel formato campione, scegliere la fluorescenza. Per integrare le immagini rappresentative nel progetto, nel menu file fare clic su Apri immagine e selezionare 10-30 immagini rappresentative dell'intera serie.

Per rimuovere l'autoflessione, aprire il vetrino non colorato e selezionare la sorgente della libreria e i fluorofori appropriati. Fare clic su Florescenza automatica e selezionare l'area di Florescenza automatica sulla diapositiva vuota. Per generare un'immagine composita, selezionare Prepara tutto per integrare la libreria di fluorescenza e gli spettri di fluorescenza automatica.

Fare clic sull'icona a forma di occhio per aprire il pannello dell'editor di visualizzazione e deselezionare l'autofluorescenza per tagliare il segnale di autofluorescenza. Seleziona un colore appropriato per ogni marcatore. Per segmentare le cellule, nel menu del compartimento, selezionare nuclei e membrana.

Nel menu dei nuclei, impostare DAPI come colorante del contatore nucleare. Fare clic sulle cellule del segmento e controllare la segmentazione dei nuclei nelle membrane cellulari. Per fenotipizzare le cellule, nel menu fenotipo, fare clic su aggiungi.

Per creare le categorie del fenotipo cellulare, selezionare più di cinque rappresentanti per la combinazione di fluoroforo e fluoroforo e fare clic su train classifier. Il classificatore sta creando un algoritmo che attribuisce un fenotipo per ogni cellula con un intervallo di confidenza. Ingrandisci e controlla i fenotipi delle cellule.

Quindi fare clic su fenotipo tutto per salvare l'algoritmo del fenotipo e il progetto di immagine, nel menu file selezionare Salva progetto. Quindi assegna un nome al progetto e salvalo. Per eseguire un'analisi batch della serie, selezionare l'analisi del bagno e selezionare il progetto salvato.

Selezionare una cartella per l'archiviazione dei dati in batch. Aggiungere le immagini da analizzare, quindi fare clic su Esegui. Al termine dell'analisi, controlla la qualità dell'immagine composita e verifica la tipizzazione fenotipica di tutte le immagini all'interno della serie.

L'analisi delle cellule T CD8 positive infiltranti il tumore, su un campione di carcinoma a cellule renali chiaro mediante imaging multispettrale a fluorescenza, rivela che circa la metà delle cellule T CD8 positive sono singole positive per PD-1 e circa 1/3 sono doppie positive per PD-1 e Tim-3. Dopo aver integrato questi vari segnali cellulari su una sezione di tessuto, la misurazione dell'intensità della florescenza PD-1 su cellule T PD-1 positive Tim-3 positive rispetto a PD-1 positive, Tim-3 negative CD8 positive, rivela che l'MFI PD-1 è maggiore quando Tim-3 è co-espresso, rafforzando la rilevanza funzionale dell'espressione di Tim-3. In questo esperimento rappresentativo, il 66% dei pazienti con tumore renale era positivo anche per l'espressione del ligando PD-1 e il 100% era positivo per il ligando Tim-3 Galactin-9.

Lo scoring clinico dei tessuti tumorali di pazienti con carcinoma a cellule renali, ha anche dimostrato la correlazione positiva tra il numero e la percentuale di cellule T CD-8 positive infiltranti il tumore che esprimono PD-1 e Tim-3 e i parametri di punteggio prognostico, ma non PD-1 positivo CD-8 che non esprime Tim-3. È interessante notare che i pazienti con carcinoma a cellule renali con cellule T CD-8 positive che esprimono PD1 con Tim 3 al di sopra della percentuale mediana avevano maggiori probabilità di recidiva, mentre l'espressione di PD-1 senza co-espressione di Tim-3 non era correlata con la recidiva del paziente. Mentre ho tentato questa procedura, è importante ricordare di rivedere il fenotipo delle cellule con due investigatori separati, incluso un patologo, se possibile.

Dopo questa procedura, altre questioni, come la citometria, possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande sull'impatto funzionale del fenotipo del sé dopo la stimolazione x-vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro per esplorare le risposte immunitarie negli organi interessati.