Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare vari approcci virologici e biochimici per analizzare il ruolo di una via di segnalazione dell'ospite nella replicazione litica di un modello di virus dell'herpes. Qui, come esempio, esaminiamo il ruolo della proteina di segnalazione antivirale mitocondriale Mavs durante l'infezione con il virus dell'herpes gamma HV 68. I primi ad esaminare il ruolo dei Mavs durante l'infezione acuta, i topi wild type e Mavs knockout vengono infettati con gamma HV 68 a seguito di un'infezione virale acuta.

Il polmone di topo viene raccolto e le cariche virali vengono determinate mediante un test di placca in cui i campioni vengono diluiti e piastrati in serie. Sui monostrati viene poi contato il numero di placche. L'aumento della carica virale nei topi knockout suggerisce che il gene di interesse svolge un ruolo antivirale.

Al contrario, la riduzione della carica virale nei topi knockout indica che il gene è necessario per l'infezione virale Per convalidare questi risultati. La cinetica di crescita virale in più fasi in vitro viene esaminata in fibroblasti embrionali di topo, wild type e mavs knockout I fibroblasti embrionali di topo vengono infettati con gamma HV 68 e incubati per vari periodi. Le cellule vengono quindi raccolte e vengono eseguiti saggi di placca per confrontare la cinetica di crescita in più fasi tra cellule wild type e cellule carenti di mavs.

Per convalidare ulteriormente questi risultati, le cellule di fibroblasti embrionali di topo wild type e mavs knockout sono state infettate con gamma HV 68. Quindi il DNA e l'RNA vengono estratti separatamente dalle cellule infette e i trascritti genomici virali vengono analizzati mediante PCR in tempo reale. Abbiamo avuto l'idea di questo protocollo quando abbiamo studiato il ruolo di una via di immunità dell'ospite durante un'infezione virale.

Questo protocollo può essere potenzialmente applicato per studiare le regole delle vie di segnalazione dell'ospite durante l'infezione da altri patogeni. Inizia questa procedura lasciando che i topi di cucciolata di sesso abbinato di sei-otto settimane si acclimatino per un periodo di quattro giorni dopo la spedizione. Il seguente esperimento sarà eseguito in una struttura a rischio biologico.

In preparazione, indossare dispositivi di protezione individuale tra cui un camice da laboratorio, guanti, una maschera e stivaletti che lavorano in un armadio di biosicurezza. Livello due. Preparare la sospensione virale con 40-10.000 PFU di gamma HV 68 e 30 microlitri di PBS sterile per ogni topo che verrà infettato.

Mantenere la sospensione virale in ghiaccio dopo un'iniezione intraperitoneale di ketamina xilazina. Assicurati che i topi siano stati sedati eseguendo un pizzicotto delle dita. Quindi, utilizzando una pipetta, erogare 30 microlitri della sospensione virale goccia a goccia nella narice sinistra o destra.

Appoggiare il topo su un fianco per cinque-10 minuti per facilitare la consegna del virus nel polmone per le vie aeree. Quindi rimetti i topi nella loro gabbia e monitorali fino a quando non si sono completamente ripresi dalla sedazione. Successivamente, il tessuto polmonare viene raccolto dai topi iniettati per preparare un lisato cellulare per valutare il titolo virale a vari giorni dopo l'infezione.

Mettere i polmoni raccolti da topi sacrificati in provette sterili da 1,5 millilitri con tappo a vite contenenti 500 microlitri di perle di silice di zirconia da 1,0 millimetri su ghiaccio. In caso contrario, si procede alla fase successiva lo stesso giorno. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Altrimenti, aggiungere un millilitro di siero freddo senza DMEM. Posizionare il tubo in una frusta per microsfere e premere start per omogeneizzare i polmoni per 30 secondi. Per evitare il surriscaldamento del campione che potrebbe inattivare il virus.

Raffreddare la provetta con ghiaccio per almeno un minuto dopo 30 secondi di omogeneizzazione. Quindi ripeti questo processo. Quindi, centrifugare il tessuto omogeneizzato a 16.000 RCF a quattro gradi Celsius per un minuto.

Dopo la rotazione, i detriti cellulari saranno sul fondo del tubo e i lipidi saranno in superficie. Prelevare immediatamente il nat come mostrato qui per eseguire un test della placca utilizzando un monostrato NIH tre, T tre o BHK 21. Successivamente, viene eseguito un test della placca Per determinare il titolo virale presente nel campione, iniziare il test della placca effettuando una diluizione seriale del surnatante virale.

Innanzitutto, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 270 microlitri di terreno in una piastra a 96 pozzetti. Lascia vuota la prima riga. Quindi aggiungere 200 microlitri di surnatante alla prima fila della piastra a 96 pozzetti, ogni campione in triplicato.

Quindi, trasferire 30 microlitri di campione dalla prima fila alla fila successiva e mescolare. Quindi trasferire 30 microlitri di composto nella fila successiva e mescolare. Ripetere questo passaggio più volte per ottenere diluizioni seriali decuplicate.

Quindi, aggiungere il surnatante virale diluito sul monostrato cellulare. In una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra in un'incubatrice e agitare la piastra ogni 30 minuti durante un'incubazione di due ore dopo l'incubazione per rimuovere i detriti cellulari, aspirare il surnatante dalla piastra.

Quindi lavare le celle una volta con terreno fresco. Dopo il lavaggio, aggiungere alle cellule un terreno contenente metilcellulosa. Incubare le cellule per quattro-sei giorni.

Dopo che sono trascorsi dai quattro ai sei giorni. Utilizzare un microscopio per leggere il numero di targa per ogni campione. Registrare il numero di placche per ogni diluizione.

Quindi calcola la media e la deviazione standard. I pozzetti contenenti troppe o troppo poche placche non possono essere utilizzati per calcolare con precisione il titolo. Quindi, per ogni campione, utilizzare una diluizione in cui ci sono da sette a 70 placche.

Questo campione diluito 1000 volte ha una media di 23 placche per pozzetto. Per calcolare il titolo virale nella soluzione non diluita, moltiplicare il fattore di diluizione per il numero di placche per il numero di microlitri in un millilitro. Quindi dividerlo per il volume di surnatante diluito aggiunto per pozzetto.

Quindi, in questo esempio, 1000 volte 23 placche per 1000 microlitri per millilitro diviso per 100 microlitri equivale a 2,3 volte 10 per la quinta unità di formazione per millilitro. Successivamente, una soluzione virale con un titolo noto viene utilizzata per determinare la cinetica di crescita di gamma HV 68 nei fibroblasti embrionali di topo Gli ORM iniziano dividendo i miti wild type e quelli carenti di un gene ospite in una piastra a 24 pozzetti a 10.000 cellule per pozzetto. Il giorno successivo, sostituire il fluido in ogni pozzetto con 0,5 millilitri di una sospensione gamma HV 68 a basso MOI.

Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e lasciare che l'incubazione proceda per due ore durante l'incubazione. Scuotere la piastra ogni 30 minuti dopo l'incubazione. Utilizzare una pipetta per rimuovere la sospensione virale e aggiungere 0,5 millilitri di DM EM completo fresco contenente l'8% di siero fetale bovino alle cellule infette da virus.

Rimetti le cellule nell'incubatrice a vari giorni dall'infezione. Raccogli le cellule terminali medie pipettando su e giù più volte. Trasferirli in provette da centrifuga sterili da 1,5 millilitri, congelare immediatamente le provette a meno 80 gradi Celsius per rilasciare la gamma HV 68 dai Mets.

Eseguire tre cicli di congelamento e scongelamento. Scongelare le celle posizionandole a 37 gradi Celsius. Quindi vorticare e rimetterli nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Determinare il titolo virale mediante un test di placca utilizzando un monostrato NIH tre, T tre o BHK 21 come mostrato in precedenza per esaminare se la replicazione del DNA o dell'RNA è influenzata da un deficit nei geni dell'ospite o nei geni virali. Iniziare con i mes infetti a vari giorni dopo l'infezione, scartare il surnatante, sciacquare le cellule con PBS freddo e tripsina cellule di ghiaccio. Quindi pellettare le celle mediante centrificazione a 1000 RCF a temperatura ambiente per un minuto dopo la centrifuga, scartare il surnatante e conservare le celle a meno 80 gradi Celsius.

Estrarre il DNA e l'RNA totali, che sono di origine ospite e virale. Quindi centrifugare le colonne di centrifuga. Eseguire la PCR in tempo reale utilizzando il DNA totale e il primer specifico per le trascrizioni litiche virali.

Determinare la quantità relativa del genoma intracellulare gamma HV 68 in riferimento a un gene di housekeeping dell'ospite come la beta actina. Preparare il CDNA con RNA totale e primer oligo DT. Eseguire la PCR in tempo reale utilizzando CD NA e primer come sopra per determinare la quantità relativa di trascritti virali.

In riferimento a quello del gene housekeeping dell'ospite, Mavs è l'abbreviazione di segnalazione antivirale mitocondriale, come mostrato qui. La molecola adattatore Mavs trasmette la segnalazione dai recettori citosolici dell'occhio di rig per attivare NF kappa B e i fattori regolatori dell'interferone IRF che a loro volta sovraregolano l'espressione genica delle citochine pro-infiammatorie e degli interferoni. Qui sono mostrate le cariche virali nel polmone dei topi wild type infetti con gamma HV e i topi compagni di cucciolata carenti di Mavs.

Il deficit di Mavs ha ridotto significativamente la carica virale nel polmone a 10 giorni dall'infezione, indicando che Mavs è necessario per un'efficace infezione virale in vivo. Questa figura mostra una curva di crescita virale a più stadi su fibroblasti embrionali di topo wild type e su quelli carenti di carenza di Mavs in Mavs. La crescita virale significativamente ritardata sui fibroblasti embrionali di topo, indicando che Mavs è necessaria per un'efficiente replicazione virale, i livelli di mRNA dei geni litici virali nei fibroblasti embrionali di topo infetti da gamma HV 68 sono stati analizzati mediante deficit di PCR in tempo reale in Mavs, riducendo significativamente i livelli di mRNA di tre geni litici essenziali.

Tutti questi risultati supportano la conclusione che Mavs è necessario per l'attivazione della trascrizione gamma HV 68 e la replicazione litica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come interrogare l'interazione ospite-patogeno a più livelli, sia in VO che in Vevo. Non dimenticare che lavorare con gli agenti patogeni potrebbe essere estremamente esitante.

Precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale devono essere prese durante lo svolgimento degli spettacoli.