Name: La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Scopri la rilevazione del genoma di herpes simplex virus tipo 1 in gangli trigeminali di topi mediante ibridazione in situ fluorescente. Questo metodo consente di visualizzare il genoma virale nei singoli neuroni.

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Ringraziamo N. Sawtell (Centro Medico dell&#39;Ospedale Pediatrico di Cincinnati, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (Università di Cambridge, UK) e James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) per la fornitura di campioni provenienti da HSV-1 topi e conigli infettati, rispettivamente, e per i reagenti; H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Giappone) e S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Francia) per le discussioni utili. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programma ATIP, a PL, http://www.cnrs.fr), l&#39;Agenzia Nazionale Francese di Ricerca (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), la Fondazione FINOVI ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), il LABEX DEVweCAN (ANR-10-labx-61 ), della Université de Lyon, nell&#39;ambito del programma &quot;Investissements d&#39;Avenir &quot;(ANR-11-IDEX-0007) gestito dalla ANR ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), l&#39;Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 e ARC- 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ) e Inca (programma EPIPRO, <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e -cancer.fr</a> ). FC e PL sono ricercatori CNRS.

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo qui descritto permette il rilevamento di HSV-1 genoma latente all&#39;interno dei neuroni di sezioni di tessuto neuronali di topo. La nostra comprensione dei percorsi che regolano l&#39;espressione genica virale è stata limitata dalla mancanza di metodo per rilevare HSV-1 DNA genomico in situ all&#39;interno dei tessuti neuronali. Informazioni sul numero di copie del genoma e la proporzione dei neuroni infetti è venuto soprattutto da PCR sui neuroni dissociati 11,12. Nel chiarire il ruo...

<html> Tipo virus herpes simplex 1 (HSV-1) è un virus umano neurotropo persistente, stabilendo una infezione latente a lungo termine nei neuroni dei gangli del trigemino (TG) del sistema nervoso periferico, da cui si riattiva periodicamente per replicare e diffondersi. La HSV-1 è un genoma 150 kb dsDNA localizzazione nel nucleo del neurone ospitante dove rimane plasmidi chromatinized come multicopia, che non si integrano nel genoma della cellula ospite 1,2. Durante la latenza, il programma genetico HSV-1 ciclo replicativo è fortemente represso, e l&#39;espressione genica è limitata alla trascrizione latenza associata (LAT) locus, da stabilimento latenza apertura di riattivazione 3. LAT produce un lungo 8.5 kb non codificante RNA trasformato in un importante 2 kb lariat stabile, e molti miRNA 4-7. HSV-1 latenza è quindi caratterizzato dalla presenza del DNA genomico virale, LAT RNA, e l&#39;assenza di proteine ​​del ciclo replicativi rilevabili. ONTENUTO &quot;&gt; I modelli animali, prevalentemente topo e coniglio, sono modelli sperimentali riassumono diverse caratteristiche di latenza umana. Uno dei principali interessi di tali modelli è che essi consentono studiare aspetti fisiologici di HSV-1 latenza in ospiti immunocompetenti. Negli ultimi decenni , molti strumenti sperimentali, quali virus e topi geneticamente modificati, sono stati sviluppati per studiare la fisiologia, genetica e biologia cellulare di HSV-1 latenza, da tessuti animali. Finora, DNA genomico virale è stata rilevata e quantificata mediante Southern blot e qPCR da dissociato TG. Tuttavia, attualmente non esiste un metodo per rilevare il HSV-1 genoma mediante ibridazione in situ su sezioni di tessuto 8. conseguenza, la latenza viene normalmente valutata su sezioni istologiche attraverso la rilevazione di RNA LAT da RNA ibridazione in situ anziché rilevazione del genoma virale. Poiché non è stato possibile caratterizzare cellule infette in base alla presenza di genomi virali, this limitazione tecnica è stato un grave inconveniente per l&#39;analisi di molti aspetti delle interazioni ospite-virus, come il rapporto tra il genoma virale e l&#39;espressione genica cellulare e virale o cellulo-mediata risposta immunitaria dell&#39;ospite 9,10. Soprattutto, l&#39;eterogeneità cellula-cellula dell&#39;infezione latente rimane relativamente inesplorato e ha dimostrato di essere un elemento chiave della latenza nei topi e nei neuroni dei gangli sensoriali umani impiantati in topi SCID 11-17. Tipicamente, è stato dimostrato da qPCR che il HSV-1 genoma numero di copie per cellula varia da 5 a diverse centinaia. Anche se LAT appare come un regolatore chiave della latenza e la riattivazione, i dati qPCR sui neuroni isolati e in situ PCR indicato che solo un sottoinsieme di neuroni latentemente infette, a partire da 30%, esprime il locus LAT 11,12,18-21. Come la cellula ospite e l&#39;ambiente cellulare all&#39;interno del tessuto impatto sulla costituzione di latenza virus el&#39;espressione genica virale rimane poco chiaro. Qui si descrive un robusto ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la rilevazione efficiente di bassa copia HSV-1 DNA genomico entro sezioni di tessuto neuronali animali. Questo metodo è stato progettato e da noi utilizzato per ottenere l&#39;accesso a microscopia ad alta risoluzione di immagini che è necessario studiare l&#39;interazione del genoma virale con la cellula ospite componenti intra-nucleari 22. Inoltre, si descrive un metodo di colorazione multipla per la rilevazione simultanea del DNA virale con RNA e proteine, che è uno strumento unico per descrivere le interazioni virus-ospite che regolano l&#39;espressione genica virale. Il metodo può essere applicato anche per una vasta gamma di analisi che richiedono la rilevazione di HSV-1 genoma latente, come quantificazione neuroni infetti in gran numero di sezioni. Un passo fondamentale è quello di applicare antigene trattamento di recupero per rendere il DNA virale accessibile a ibridazione. Così, questo protocollo potrebbe anche essere efficace per il rilevamentodi altri virus dsDNA, che attualmente non rilevabili da approcci DNA-FISH convenzionali all&#39;interno di tessuti animali.

<table><tbody><tr><td>Topi Balb/c</td><td>Janvier, Francia</td><td></td><td>Femmine di 6 settimane</td></tr><tr><td>HSV-1 ceppi</td><td>SC16 ceppo (wild type)</td><td></td><td>Vedi Labetoule, M. et al. Invest. Oftalmolo. Sci 44, 217&ndash; 225 (2003) per i dettagli sul ceppo HSV-1 e sulla preparazione del virus.</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>Iniezione intraperitoneale di una soluzione contenente ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg)</td></tr><tr><td>xilazina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Sospendere 4 g di PFA in 90 ml di acqua. Aggiungi 50 &micro; l di 1N NaOH e calore a 60 &deg; C a bagnomaria con agitazione. Il PFA si dissolve in circa 30 minuti. Aggiungere 10 ml di 10x PBS. Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservata a -20 gradi; C in tubi da 5 ml. Cautela. Manipolare sotto una cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica salina</td><td>Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4 (sterile)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>Preparare una soluzione di saccarosio al 20% in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Terreno di inclusione per criosezione - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA vettoriale di grandi dimensioni</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>Per purificare il vettore Cosmid o BAC contenente il genoma HSV-1 e conservarlo a -20 &deg; Kit</td></tr><tr><td>di traduzione C Nick</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53021</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50 Mini colonna rotante</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermatozoi di salmone DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo grado di biologia molecolare</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>Preparare una soluzione al 70%</td></tr><tr><td>Sperma di salmone DNA</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Formamide Grado di biologia molecolare</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>Attenzione. Manipolare sotto la cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Sonda commerciale biotinilata HSV-1&nbsp;</td><td>Enzo Scienze della Vita</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penna idrofobica ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x Citrato di sodio salino (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>Preparare una soluzione 2x SSC in ddH20.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Preparare una soluzione madre al 10% in acqua e conservare a +4 °C. Preparare la soluzione allo 0,5% in 1x PBS subito prima dell'uso.</td></tr><tr><td>10 mM Citrato di sodio pH 6,0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Preparare una soluzione madre da 100 mM (10x). Pesare 10,5 g di acido citrico (MW 210,14). Attenzione, irritante e tossico, indossare maschera e guanti adeguati), e sciogliere in 400 ml di acqua. Regolare il pH a 6,0 con 1 N NaOH (attenzione, irritante, indossare guanti). Regolare a 500 ml con acqua distillata. Diluire 10 volte in acqua distillata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanolo, grado di biologia molecolare</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Destrano solfato - MW 500.000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>La soluzione di Denhardt (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gomma cementizia "FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA&nbsp; - Kit di purificazione PCR Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione T7 in vitro</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotina-16-UTP</td><td>Roche Scienze Applicate</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Minicolonna per purificazione di RNA</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Complesso ribonucleosidico vanadile</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>Preparare una soluzione al 3% in acqua distillata. Conservare a +4 gradi C e proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>Lievito tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>preparare una soluzione da 10 mg/ml in acqua priva di RNAsi</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Nella sezione dei risultati sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anti-topo CENP-A (mAb di coniglio C51A7, Cell Signaling Technologies) e anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td></tr><tr><td>Anticorpi fluorescenti secondari</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>Gli anticorpi secondari fluorescenti utilizzati abitualmente nel nostro protocollo sono gli anticorpi di capra marcati con Alexa Fluor (IgG H+L). L'anticorpo utilizzato nella sezione dei risultati è un anticorpo anti-capra di coniglio labalato con Alexa Fluor 488 (riferimento A11001)</td></tr><tr><td>Kit di amplificazione del segnale della tiramide (TSA) - Streptavidina + Alexa Fluor 350 (fluorescenza blu)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>I kit TSA sono disponibili anche dal kit Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) - Streptavidina + Alexa Fluor 488 (fluorescenza verde)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Preparare un 0,5 &micro; g/ml di soluzione in 1x PBS immediatamente prima dell'uso. Eliminare la soluzione rimanente.</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 22 mm x 50 mm. 1.5 vetro</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72204-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio con agente anti-sbiadimento - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Un altro prodotto convenzionale è Fluoromount G di Electron Microscopy Science</td></tr><tr><td>Superfrost vetrini</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Attrezzatura/Materiale</td><td>Nota di riferimento dell'azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago per infezione</td><td></td><td></td><td>Micropipetta in vetro trafilata a caldo. Realizzato su misura.</td></tr><tr><td>Attrezzature per dissezione</td><td>Moria, Francia</td><td></td><td>Forbici e pinze microchirurgiche</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Dispositivo pompa microsiringa (Nano Pump)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica France CM</td><td>1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80 &deg; C congelatore</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Low -80 &deg; C</td></tr><tr>Forno <td></td><td></td><td>a microonde domestico</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco secco</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubatrice Scivolo fossato</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Coplin Barattolo</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Contenitore in vetro colorato</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Le immagini presentate nella sezione dei risultati sono state raccolte con un AxioObserver Zeiss con obiettivo 40X LD NeoFluor N.A 0.6 e 100X PlanApochromat N.A 1.3. Set di filtri #38, #43 e #43. Sorgente luminosa a fluorescenza HXP 120. Fotometrica Fotocamera CCD CoolSNAP HQ2. Il segnale sarà più facilmente osservato su un recente microscopio ad alta efficienza come la serie Zeiss AxioImager/AxioObserver, la serie Nikon Ti-E/Ni-E o la serie Leica DM/DMI6000</td></tr></tbody></table>

la rilevazione del genoma e trascrizioni di un virus dna persistente in tessuti neuronali da fluorescente in situ ibridazione in combinazione con immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Codetection singola cella di un gene, il suo prodotto RNA e proteine ​​regolatrici cellulari è fondamentale per studiare regolazione dell&#39;espressione genica. Questa è una sfida nel campo della virologia, in particolare per persistenti virus a DNA nucleare replicanti che coinvolgere modelli animali per il loro studio. Tipo virus herpes simplex 1 (HSV-1) stabilisce un&#39;infezione latente permanente nei neuroni periferici. Latent virus funge da serbatoio, da cui riattiva e induce un nuovo episodio erpetica. La biologia cellulare di HSV-1 latenza rimane poco compresa, in parte a causa della mancanza di metodi per rilevare HSV-1 genomi in situ in modelli animali. Descriviamo un DNA-ibridazione in situ fluorescente (FISH) approccio efficiente rilevazione low-copia genomi virali all&#39;interno di sezioni di tessuti neuronali provenienti da modelli animali infetti. Il metodo si basa sul-based calore antigene smascheramento, e direttamente etichettati sonde di DNA fatti in casa, o sonde disponibili in commercio. Abbiamo sviluppato un Stai triplaapproccio ning, combinando DNA-FISH con RNA-FISH e immunofluorescenza, utilizzando perossidasi basato amplificazione del segnale per soddisfare ogni esigenza di colorazione. Un miglioramento importante è la possibilità di ottenere, entro 10 micron sezioni di tessuto, segnali a bassa priorità bassa che possono essere esposte ad alta risoluzione mediante microscopia confocale e grande campo epifluorescenza convenzionale. Inoltre, la colorazione tripla lavorato con una vasta gamma di anticorpi diretti contro proteine ​​cellulari e virali. Il protocollo completo dura 2,5 giorni per accogliere anticorpo e la penetrazione della sonda all&#39;interno del tessuto.

Dopo diversi mesi di test approfonditi, abbiamo scoperto che a base di calore chimico smascheramento fatto latente HSV-1 genoma disponibili per ibridazione in situ fluorescente. Durante il processo, abbiamo provato varie procedure smascheramento, e trattamenti a base di solo calore (cioè il riscaldamento delle sezioni fino a temperatura sub-di ebollizione in un forno a microonde) apparso efficiente. Abbiamo poi testato diversi buffer di sale che vengono abitualmente utilizzati in immunoistochimica (IHC...

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all&#39;interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all&#39;interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare il genoma del virus dell'herpes simplex di tipo uno in sezioni di gangli trigeminali provenienti da topi infetti in forma latente mediante ibridazione in situ fluorescente. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando il virus nel labbro dell'animale, seguito da un periodo di incubazione di 28 giorni durante il quale il virus si stabilisce nei gangli trigeminali. Successivamente, i gangli trigeminali vengono prelevati, inclusi e tagliati mediante criosezione.Le sezioni sono sottoposte a diversi trattamenti preparatori, inclusa la fase fondamentale del riscaldamento in un tampone di citrato di sodio. Infine, viene eseguita l'ibridazione fluorescente in situ mediante sonde fluorescenti specifiche per l'herpes. In definitiva, i risultati possono mostrare la localizzazione del genoma virale all'interno del nucleo di singoli neuroni infetti attraverso l'uso della microscopia confocale.In molti casi, lo studio di un ciclo vitale vario richiede l'uso di modelli animali. Il principale vantaggio della tecnica qui presentata è che fornisce dati a livello di singola cellula mediante un approccio di istofluorescenza. Il modello animale di in

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Una tecnica che combina in colorazione tetramero situ e di ibridazione in situ (ISTH) consente la visualizzazione, la mappatura e l'analisi della vicinanza spaziale del virus-specifiche cellule T CD8 + ai loro infettati da virus obiettivi, e la determinazione delle relazioni quantitative tra questi effettori immuni e gli obiettivi ai risultati infezione.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Fonte: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Ibridazione fluorescente in situ quantitativa (FISH) e immunofluorescenza (IF) di prodotti genici specifici in cellule infette da KSHV. J. Vis. Exp. (2019)In questo video viene dimostrata l'ibridazione fluorescente in situ per visualizzare l'RNA virale in cellule infette da virus. Vengono illustrati i passaggi relativi all'ibridazione della sonda, all'amplificazione del segnale e all'analisi mediante microscopia confocale.

Determinazione della distribuzione dell'RNA virale nelle cellule ospiti mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Fonte: Baleriola, J., et. al., Rilevamento di mRNA localizzati assonalmente in sezioni cerebrali utilizzando l'ibridazione in situ ad alta risoluzione.  J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra il rilevamento dell'mRNA all'interno degli assoni colinergici in fette fisse di ippocampo di topo utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ e la colorazione degli anticorpi. La microscopia a fluorescenza rivela la localizzazione spaziale degli mRNA marcati con sonda e della colina acetiltransferasi...

Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Fabbriche di transcriptional virali sono strutture discrete che sono arricchiti con cellulare RNA polimerasi II per aumentare la trascrizione genica virale durante la riattivazione. Qui, è descritto un metodo per individuare i siti di trascrivere attivamente della cromatina virale nello spazio 3D nucleare da una combinazione di ibridazione di RNA immunofluorescenza colorazione ed in situ .

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Scopri la rilevazione del genoma di herpes simplex virus tipo 1 in gangli trigeminali di topi mediante ibridazione in situ fluorescente. Questo metodo consente di visualizzare il genoma virale nei singoli neuroni.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining (Video) | JoVE Journal

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

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