La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare il genoma del virus dell'herpes simplex, tipo uno, in sezioni di gangli del trigemino da topi infettati in modo latente mediante ibridazione fluorescente in situ. Ciò si ottiene inoculando prima il virus nel labbro animale, seguito da un periodo di incubazione di 28 giorni durante il quale il virus si stabilisce nei gangli del trigemino. Successivamente, i gangli del trigemino vengono raccolti, incorporati e criosezionati.

Le sezioni sono sottoposte a diversi trattamenti preparatori, tra cui la fase chiave del riscaldamento in un tampone di citrato di sodio. Infine, l'ibridazione fluorescente in situ viene eseguita utilizzando vesti fluorescenti specifiche per l'herpes. In definitiva, i risultati possono mostrare il posizionamento del genoma virale all'interno del nucleo di neuroni infettati individualmente attraverso l'uso della microscopia confocale.

In molti casi, lo studio di un ciclo di vita diverso richiede l'uso di modelli animali. Il vantaggio principale della tecnica qui rappresentata è che fornisce dati a livello di singola cellula utilizzando un approccio di fluidizzazione dell'istituto. Il modello killer reale delle infezioni da HS riproduce la maggior parte degli aspetti della storia naturale dell'infezione da HSV 1 nell'uomo.

Questo è l'ospite naturale del virus. L'infezione primaria viene prodotta nei tessuti orali, quindi il virus progredisce dalle labbra ai due gangli. Questo è il lato principale della latenza HS V negli esseri umani Combinato due immuno e colorazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la latenza del virus dell'herpes, come ad esempio il modo in cui il virus interagisce con i componenti nucleari e come queste interazioni influenzerebbero il mantenimento della latenza e infine la riattivazione del virus. Per iniziare, avere un topo anestetizzato e una soluzione stock di virus HSV. Risospeso in mezzo privo di rosso fenolo.

Utilizzando uno stereoscopio binoculare, inserire l'ago nello strato sottoepiteliale del labbro superiore sinistro in corrispondenza del bordo mucocutaneo. Iniettare 0,5 microlitri di soluzione virale in cinque secondi, quindi effettuare una seconda iniezione di virus nello stesso sito. Trasferisci il mouse in un'incubatrice a 37 gradi Celsius o in un termoforo fino al risveglio.

Quindi mettilo nella sua gabbia domestica per il tempo di recupero richiesto prima di fissarlo perfù secondo il protocollo di testo. Taglia su ciascun lato della mascella inferiore. Quindi taglia la punta del naso appena dietro gli incisivi per rivelare la cavità nasale.

Tagliate il palato a metà con le forbici, e poi mettetelo da parte. I gangli del trigemino si trovano sotto il palato. Sono masse oblunghe bianche, lunghe da due a tre millimetri e sono collegate al nervo trigemino.

Taglia i rami del nervo trigemino su ciascun lato dei gangli per liberarli dal tronco encefalico. Utilizzando una pinza chirurgica, rimuovere i gangli e trasferirli al 20%Il saccarosio in PBS li lascia incubare per 24 ore. A temperatura ambiente il giorno successivo, incorporare entrambi i gangli del trigemino in un unico blocco di criosezione.

Incorporando il mezzo, congelare il blocco a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene sezionato su un criostato. Tagliare i gangli del trigemino nel senso della lunghezza in sezioni di 10 micron e raccoglierle su vetrini super frost riscaldati a 30 gradi Celsius. Da quattro a cinque sezioni possono stare su una singola diapositiva.

Può essere utile assegnare alla diapositiva più etichette di serie. Se sono previste diverse applicazioni a valle, lasciare asciugare le fette per cinque-10 minuti prima di conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per questo protocollo, la sonda viene preparata marcando cosmi contenenti 30 porzioni di kilobase del genoma di HSV one con SI 3D CTP mediante traduzione NIC.

È precipitato e sospeso in forma deionizzata ammide e dovrebbe apparire rosa a causa dell'incorporazione di S SI tre il primo giorno. Posizionare i vetrini su un supporto per vetrini a temperatura ambiente e lasciare asciugare le sezioni per 10 minuti. Quindi reidratare le sezioni in un XPBS per 10 minuti.

Quindi, permeare il tessuto in Triton X 100 allo 0,5% in un XPBS per 20 minuti. Quindi lavare i vetrini tre volte per 10 minuti per lavaggio con due XSS e tenerli in due XSSC fino a quando il tampone di smascheratura non si riscalda. Per smascherare, preriscaldare il tampone citrato in un forno a microonde fino a quando il tampone bolle.

Questo viene fatto riempiendo un vassoio di vetro per vetrini con 200 millilitri di tampone. Mettere la teglia in un contenitore più grande riempito con 500 millilitri di acqua distillata e preriscaldare il tampone fino a ebollizione. Quindi trasferire i vetrini nel vassoio.

Verifica che siano completamente coperti con il tampone nel microonde. Riscaldare i vetrini nel tampone per circa 20 secondi fino a quando il tampone raggiunge l'ebollizione. Non lasciare che il tampone trabocchi.

Quindi raffreddare i vetrini a temperatura ambiente per due minuti e ripetere il ciclo di riscaldamento altre sei volte. È fondamentale determinare empiricamente il numero e la durata dei cicli alimentari per la riproducibilità della fase di smascheramento. Il forno a microonde, la teglia, il contenitore, il volume di tampone nella teglia.

Il volume d'acqua nel contenitore deve essere mantenuto identico al termine del riscaldamento. Trasferire i vetrini in due XSSC per cinque minuti sotto una cappa aspirante, incubare i vetrini in una soluzione da tre a uno a quattro di metanolo, acido acetico e PBS per 15 minuti. Quindi incubare i vetrini in una miscela di metanolo e acido acetico tre a uno preparata di recente per 15 minuti.

Ora disidratare le sezioni attraverso successive incubazioni di 10 minuti in etanolo al 70%, seguite da due incubazioni di 10 minuti in etanolo puro. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 10 minuti per prepararli alla sonda. Applicare 80 microlitri di soluzione tastatrice sulle sezioni asciutte goccia a goccia e coprirle con un vetrino coprioggetti.

Verificare che la soluzione di sondaggio si diffonda su tutta la superficie del vetrino coprioggetto e che non vi siano bolle. Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con cemento di gomma e lasciarlo asciugare. Procedere con la denaturazione incubando i vetrini a 80 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi trasferire rapidamente i vetrini su un vassoio metallico con ghiaccio per cinque minuti. A seguire questa operazione è seguita da un'ibridazione notturna a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Rimuovere il cemento di gomma con una pinza con le guide su un blocco termico a 37 gradi Celsius.

Rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetto con la punta della lama di un bisturi. Quindi, lavare ripetutamente le sezioni con SSC. Ora, colorare i campioni per 10 minuti con il colorante appropriato come DAPI o uncini 3 3 3 4 2 a 0,5 microgrammi per millilitro in un XPBS.

Quindi lavare i vetrini tre volte con un XPBS per 10 minuti per lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, scolare quanto più liquido possibile dal vetrino. Quindi, alla fine di ogni vetrino, applicare 80 microlitri di terreno di montaggio con un agente antisbiadimento.

Coprire lentamente il mezzo con un vetrino coprioggetti di alta qualità ottica, evitando la formazione di bolle. Quindi sigillare il vetrino con smalto per unghie e conservarlo al buio a quattro gradi Celsius. Nello sviluppo di questo protocollo, sono stati testati diversi tamponi salini per l'unmasking.

Mentre i tamponi EDTA tendevano a danneggiare il tessuto. Il citrato di sodio, il tris, l'HCL e l'acqua distillata erano adatti per l'HSV una rilevazione per verificare che il protocollo funzionasse con le sonde commerciali. La rilevazione del genoma latente dell'HSV one è stata eseguita utilizzando una sonda biotinilata PAN HSV ottenuta da Enzo Biochem, è stato possibile rilevare sia pattern spot singoli che multipli per il genoma dell'HSV one.

Inoltre, il protocollo DNA fish è stato testato su topi e conigli infettati con tre ceppi di HSV uno comunemente usati. In tutti i casi, i genomi dell'HSV hanno mostrato un segnale a macchia di leopardo con luminosità e intensità variabili. Inoltre, l'applicabilità del protocollo è stata testata nel ciclo replicativo di HSV one eseguendo DNA fish su tessuti di topi sottoposti a infezione da herpes generale.

In questi animali, sono stati rilevati aggregati grandi e luminosi di genomi di HSV one in vari tessuti, inclusi gli occhi e il cervello DRG. Il protocollo DNA fish è molto versatile. Consente la co-rilevazione del genoma di HSV one e di RNA e proteine virali o cellulari.

Ad esempio, è possibile la co-rilevazione di HSV un genoma insieme all'HSV one lat RNA è fattibile la co-rilevazione di HSV one genoma con proteine cellulari come la proteina Centro MERIC CE NPA A è stata utilizzata la co-rilevazione di HSV uno con i corpi nucleari della cromatina e della PML. La proteina A TRX associata è stata visualizzata con una tripla colorazione che mostra HSV 1D NA in rosso. Il suo prodotto di RNA è in blu e un TRX in verde.

Una volta impostato lo smascheramento, la procedura del DNA fish è molto robusta. Può essere fatto in meno di 24 ore in lotti di 20 vetrini o più. Lo sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori che studiano i virus dell'herpes e altri virus persistenti di esplorare, a livello di singola cellula, come i componenti cellulari e l'architettura nucleare potrebbero influenzare la biologia di questi virus.