La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare il genoma del virus dell'herpes simplex di tipo uno in sezioni di gangli trigeminali provenienti da topi infetti in forma latente mediante ibridazione in situ fluorescente. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando il virus nel labbro dell'animale, seguito da un periodo di incubazione di 28 giorni durante il quale il virus si stabilisce nei gangli trigeminali. Successivamente, i gangli trigeminali vengono prelevati, inclusi e tagliati mediante criosezione.

Le sezioni sono sottoposte a diversi trattamenti preparatori, inclusa la fase fondamentale del riscaldamento in un tampone di citrato di sodio. Infine, viene eseguita l'ibridazione fluorescente in situ mediante sonde fluorescenti specifiche per l'herpes. In definitiva, i risultati possono mostrare la localizzazione del genoma virale all'interno del nucleo di singoli neuroni infetti attraverso l'uso della microscopia confocale.

In molti casi, lo studio di un ciclo vitale vario richiede l'uso di modelli animali. Il principale vantaggio della tecnica qui presentata è che fornisce dati a livello di singola cellula mediante un approccio di istofluorescenza. Il modello animale di infezioni da HS riproduce la maggior parte degli aspetti della storia naturale dell'infezione da HSV-1 nell'uomo.

Questo è l'ospite naturale del virus. L'infezione primaria avviene nei tessuti orali, quindi il virus si diffonde dalle labbra al ganglio trigemino. Questo è il sito principale della latenza dell'HSV nell'uomo, combinando tecniche immunoistochimiche e di colorazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardanti la latenza del virus dell'herpes, ad esempio in che modo il virus interagisce con i componenti nucleari e come tali interazioni influenzerebbero il mantenimento della latenza e, in ultima analisi, la riattivazione del virus. Per iniziare, procurarsi un topo anestetizzato e una soluzione madre del virus HSV-1, risospesa in mezzo privo di rosso fenolo.

Utilizzando un stereomicroscopio binoculare, inserire l'ago nello strato sottopiteliale del labbro superiore sinistro al confine mucocutaneo. Iniettare 0,5 microlitri di soluzione virale nell'arco di cinque secondi, quindi effettuare una seconda iniezione di virus nello stesso sito. Trasferire il topo in un incubatore a 37 gradi Celsius o su un tappetino riscaldante fino al suo risveglio.

Quindi riporlo nella gabbia di provenienza per il tempo di recupero richiesto prima di fissarlo mediante perfusione seguendo il protocollo descritto nel testo. Tagliare su entrambi i lati della mascella inferiore. Successivamente, tagliare la punta del naso appena dietro gli incisivi per esporre la cavità nasale.

Tagliare il palato a metà con le forbici, quindi metterlo da parte. I gangli trigeminali si trovano al di sotto del palato. Sono masse bianche di forma oblunga, lunghe due o tre millimetri, e sono collegati al nervo trigemino.

Tagliare i rami del nervo trigemino su ciascun lato dei gangli per staccarli dal bulbo. Utilizzando pinze chirurgiche, rimuovere i gangli e trasferirli in soluzione di saccarosio al 20% in PBS, lasciandoli incubare per 24 ore. Il giorno successivo, a temperatura ambiente, includere entrambi i gangli trigeminali in un unico blocco per la criosezione.

Medio di inclusione, congelare il blocco a meno 80 gradi Celsius fino al momento del taglio al criostato. Tagliare i gangli trigeminali longitudinalmente in sezioni da 10 micron e raccoglierle su vetrini Super Frost preriscaldati a 30 gradi Celsius. Su un singolo vetrino possono essere collocate quattro o cinque sezioni.

Assegnare più etichette serie al vetrino può essere utile. Se si prevedono diverse applicazioni a valle, lasciare asciugare le sezioni per cinque-dieci minuti prima di conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per questo protocollo, la sonda viene preparata etichettando i cosmidi contenenti porzioni di 30 chilobasi del genoma dell'HSV di tipo 1 con SI 3D CTP mediante traduzione NIC.

Viene precipitato e sospeso in forma amidica deionizzata e deve apparire rosa a causa dell'incorporazione di S SI tre il primo giorno. Posizionare i vetrini su un portavetrini a temperatura ambiente e lasciare asciugare le sezioni per 10 minuti. Successivamente, reidratare le sezioni in 1x PBS per 10 minuti.

Successivamente, permeabilizzare il tessuto in 0,5% Triton X-100 in 1x PBS per 20 minuti. Quindi lavare i vetrini tre volte per 10 minuti ciascun lavaggio con 2x SSC e mantenerli in 2x SSCC fino al riscaldamento del buffer di svelamento. Per lo svelamento, preriscaldare il buffer citrato in un forno a microonde fino a quando il buffer bolle.

Questo viene fatto riempiendo un vassoio per vetri da microscopio con 200 millilitri di tampone. Posizionare il vassoio in un contenitore più grande riempito con 500 millilitri di acqua distillata e preriscaldare il tampone fino all'ebollizione. Successivamente trasferire i vetri nel vassoio.

Verificare che siano completamente coperti con tampone nel forno a microonde. Riscaldare i vetrini nel tampone per circa 20 secondi, fino a quando il tampone raggiunge l'ebollizione. Non permettere al tampone di traboccare.

Quindi raffreddare le vetture a temperatura ambiente per due minuti e ripetere il ciclo di riscaldamento altre sei volte. È fondamentale determinare empiricamente il numero e la durata dei cicli di riscaldamento per garantire la riproducibilità della fase di svelamento. Il forno a microonde, il vassoio, il contenitore, il volume di tampone nel vassoio.

Il volume d'acqua nel contenitore deve essere mantenuto identico una volta terminato il riscaldamento. Trasferire i vetrini in due XSSC per cinque minuti sotto cappa, quindi incubare i vetrini in una soluzione di metanolo, acido acetico e PBS in rapporto da tre a uno a quattro per 15 minuti. Successivamente, incubare i vetrini in una miscela appena preparata di metanolo e acido acetico in rapporto tre a uno per 15 minuti.

Ora disidratare i preparati mediante incubazioni successive in etanolo al 70% per 10 minuti ciascuna, seguite da due incubazioni di 10 minuti in etanolo puro. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 10 minuti per prepararli al sonda. Applicare 80 microlitri di soluzione di sonda goccia a goccia sui preparati essiccati e coprirli con un coprioggetto.

Verificare che la soluzione di sonda si diffonda su tutta la superficie del vetrino e che non siano presenti bolle d'aria. Quindi sigillare il vetrino con cemento di gomma e lasciarlo asciugare. Procedere con la denaturazione incubando i vetrini a 80 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi trasferire rapidamente i vetrini su un vassoio metallico posto sul ghiaccio per cinque minuti. Procedere con un'ibridazione notturna a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Rimuovere il cemento di gomma con pinzette, tenendo i vetrini su un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius.

Rimuovere delicatamente il coprioggetto con la punta della lama del bisturi. Successivamente, lavare ripetutamente i campioni con SSC. A questo punto, colorare i campioni per 10 minuti con il colorante appropriato, come DAPI o hooks 3 3 3 4 2 a 0,5 microgrammi per millilitro in un XPBS.

Quindi lavare i vetrini tre volte con 1x PBS per 10 minuti per ogni lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, eliminare il più possibile il liquido dal vetrino. Successivamente, alla fine di ciascun vetrino, applicare 80 microlitri di mezzo di montaggio contenente un agente anti-sfaldamento.

Coprire lentamente il mezzo con un'ampolla di vetro di alta qualità ottica, evitando la formazione di bolle. Quindi sigillare il vetrino con smalto per unghie e conservarlo al buio a quattro gradi Celsius. Nell'elaborazione di questo protocollo, diversi tamponi salini sono stati testati per la rimozione della mascheratura.

Mentre i tamponi EDTA tendevano a danneggiare il tessuto, il tris citrato di sodio, l'HCL e l'acqua distillata si sono rivelati adatti alla rilevazione dell'HSV di tipo 1 per verificare che il protocollo fosse efficace con sonde commerciali. La rilevazione del genoma latente dell'HSV di tipo 1 è stata eseguita utilizzando una sonda biotinilata PAN HSV di tipo 1 ottenuta da Enzo Biochem; sono stati rilevati sia modelli con singolo punto che con punti multipli per il genoma dell'HSV di tipo 1.

Inoltre, il protocollo DNA FISH è stato testato su topi e conigli infettati con tre ceppi comuni di HSV di tipo 1. In tutti i casi, i genomi di HSV di tipo 1 hanno mostrato un segnale a macchie con luminosità e intensità variabili. In aggiunta, l'applicabilità del protocollo è stata verificata nel ciclo replicativo di HSV di tipo 1 eseguendo l'analisi DNA FISH su tessuti di topi in corso di infezione erpetica generalizzata.

In questi animali, sono stati rilevati ampi e brillanti aggregati di genomi dell'HSV di tipo 1 in diversi tessuti, inclusi i gangli della radice dorsale, gli occhi e il cervello. Il protocollo DNA FISH è molto versatile. Permette la codetenzione del genoma dell'HSV di tipo 1 e di RNA o proteine virali o cellulari.

Ad esempio, è possibile la codetenzione del genoma di HSV-1 insieme all'RNA latente di HSV-1; la codetenzione del genoma di HSV-1 con proteine cellulari come la proteina centromerica CENP-A è stata utilizzata per la codetenzione di HSV-1 con la cromatina e i corpi nucleari PML. La proteina associata A TRX è stata visualizzata mediante una colorazione tripla che mostrava il DNA di HSV-1 in rosso, il suo prodotto RNA latente in blu e la TRX in verde.

Una volta configurata la rimozione della mascheratura, la procedura FISH per il DNA è molto affidabile. Può essere eseguita in meno di 24 ore in lotti di 20 vetrini o più. Lo sviluppo di questa tecnica permetterà ai ricercatori che studiano i virus erpetici e altri virus persistenti di esplorare, a livello di singola cellula, come i componenti cellulari e l'architettura nucleare possano influenzare la biologia di questi virus.