Visualizzazione dell'attività della proteina chinasi A in un topo utilizzando la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni

Fissare un topo anestetizzato con una finestra cranica sopra la sua corteccia motoria su un tapis roulant.

Il topo esprime un reporter della proteina chinasi-A nei neuroni corticali.

Posizionare il tapis roulant sotto un obiettivo FLIM a due fotoni.

Aggiungi una goccia d'acqua tra l'obiettivo e la finestra cranica.

Lascia che il mouse si svegli e si acclimati al tapis roulant.

Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, individuare la regione di imaging. Chiudere l'involucro del microscopio per bloccare la luce esterna.

Impostare i parametri di imaging, avviare la rotazione del tapis roulant per indurre la locomozione e avviare l'imaging.

La locomozione forzata attiva la PKA, che fosforila il reporter, avvicinando i fluorofori donatori e accettori.

Il microscopio dirige un laser a infrarossi, eccitando il donatore a trasferire energia all'accettore, riducendo la durata della fluorescenza del donatore.

Quando la locomozione si interrompe, la PKA e il reporter tornano ai loro stati inattivi, diminuendo il trasferimento di energia e aumentando la durata della fluorescenza del donatore.

Analizza le immagini per confrontare i livelli corticali di PKA durante il riposo e la locomozione.

Almeno due settimane dopo l'installazione della finestra cranica, impostare la lunghezza d'onda del laser di eccitazione a due fotoni a 960 nanometri e confermare una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi nel topo sperimentale anestetizzato. Posizionare il mouse anestetizzato sul tapis roulant motorizzato e montare la piastra della testa del mouse sul supporto della piastra della testa della configurazione del tapis roulant. Pulire la superficie del vetrino coprivetrino cranico con etanolo al 70% e posizionare il tapis roulant motorizzato sotto l'obiettivo 2pFLIM.

Applicare una goccia di acqua distillata tra il vetrino della finestra cranica nell'obiettivo e lasciare che il topo si svegli e si acclimati all'ambiente del tapis roulant e del microscopio per almeno 10 minuti. Navigare verso la posizione di iniezione in epi-illuminazione e documentare le caratteristiche fiduciali in campo chiaro per facilitare l'imaging della stessa regione di interesse durante le successive sessioni di imaging.

Spegnere la sorgente luminosa epi-illuminazione. Racchiudere l'involucro del banco di calibrazione per microscopio 2pFLIM. Per attivare i tubi fotomoltiplicatori del microscopio 2pFLIM, attivare il comando hardware di controllo della tensione. Per acquisire un'immagine Z-stack 2pFLIM, impostare la dimensione dell'immagine su 128 x 128 pixel. La velocità di scansione a 2 millisecondi per linea, il campo visivo da 90 a 100 micrometri nel fotogramma, con una media di tre fotogrammi.

Regolare le impostazioni di imaging in base alla preparazione e alla configurazione hardware. E ispezionare l'immagine acquisita nella vista FLIM. Utilizzare un campo visivo ridotto, una velocità di scansione ridotta, una maggiore potenza del laser e un numero maggiore di fotogrammi da calcolare per aumentare il numero di fotoni integrati e ridurre l'errore di stima della durata di vita secondo necessità.

Assicurati di ottenere abbastanza fotoni per regione di interesse. Un conteggio di foto integrato funzionante per un soma positivo in vista è di circa 1.000-10.000 fotoni.

Quando l'immagine è stata ottimizzata, acquisire le immagini Z-stack ripetute dalla linea di base a intervalli regolari per almeno 15 minuti a velocità 0 sul tapis roulant. Quindi impostare la rotazione del tapis roulant a circa centimetri al secondo per 15 minuti durante l'acquisizione di immagini 2pFLIM, seguite da almeno 20 minuti di acquisizione dell'immagine dopo aver spento la rotazione del tapis roulant per valutare la durata dell'attività della proteina chinasi A dopo la cessazione della locomozione forzata.

Per l'analisi delle immagini 2pFLIM, aprire le immagini in visualizzazione pellicola e fare clic sui campi dell'intervallo minimo e massimo di conteggio dei singoli fotoni per inserire i valori appropriati dell'intervallo di conteggio dei singoli fotoni minimo. Fare clic sul campo del valore del tempo 0 per immettere il valore del tempo 0 e fare clic sul campo del valore di soglia minimo della luminanza della durata per immettere il valore di soglia desiderato tra 5 e 30 fotoni.

Fai clic sul pulsante Nuovo gruppo e assegna un nome al gruppo dell'esperimento per generare un gruppo che combina i dati di ogni immagine FLIM aggiunta. Fare clic su Regione di interesse nel modulo di controllo della regione di interesse e disegnare una regione di interesse attorno a un soma alfa-positivo T-ACCR. Spostare il limite Z inferiore e superiore nei cursori di controllo Z-stack per ridurre l'intervallo Z-stack e minimizzare la contaminazione del segnale proveniente dai fotoni di fondo e da altri Z-dip, quindi fare clic su Più per aggiungere l'immagine FLIM al gruppo.

Fare clic su calc per calcolare la durata media nell'errore di stima della durata per la regione di interesse e aprire il file successivo nella serie di immagini 2pFLIM. Misurare lo stesso soma T-ACCR alfa-positivo in ogni immagine consecutiva nel tempo, regolando la regione di interesse attorno al soma secondo necessità. Quando tutte le immagini sono state analizzate, selezionare il tempo di emissione dei fotoni medio delta T0 nel modulo di controllo del gruppo e fare clic sul campo del numero di base per inserire l'indice delle immagini di interesse per definire le immagini utilizzate per calcolare la durata di base.

Quindi, fare clic su Grafico per generare un grafico contenente la risposta FLIM all'attività T-ACCR alfa positiva durante l'esperimento nelle regioni di interesse definite per consentire un confronto dell'attività della proteina chinasi A durante la locomozione della chinasi in diverse regioni di interesse.