Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

In questo video, le attività della chinasi e della fosfatasi vengono monitorate durante tutto il ciclo cellulare utilizzando il trasferimento di energia di risonanza Forrester o fret. Qui una sonda di attività polo come la chinasi uno o LK one ha la proteina fluorescente ciano CFP posizionata su un'estremità e la proteina fluorescente gialla YFP posizionata sull'altra. Questa sonda viene trasfettata in cellule OS U2.

Quindi, per esaminare lo stato di fosforilazione dei bersagli LK one durante la transizione G due due M, le cellule OS U2 TRANSFECTED sono sottoposte a imaging a fluorescenza time lapse. Quando CFP e YFP sono nelle immediate vicinanze e CFP è eccitato, l'energia viene trasferita a YFP e l'ammissione YFP può essere rilevata. Tuttavia, quando la sonda viene fosforilata, un cambiamento di conferma nella proteina separa CFP e YFP.

Ora, quando la CFP è eccitata, vengono rilevate una forte emissione di CFP e solo una debole emissione di YFP, la quantificazione del rapporto tra l'emissione di YFP dopo che sia la CFP che l'eccitazione YFP dimostrano che l'attività di PLK uno aumenta in G due e raggiunge il picco durante la mitosi. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la filmatura geometrica standard, è che viene posta un'attenzione specifica al fatto che il ciclo cellulare non sia perturbato né dalle condizioni di filmatura né dall'espressione di una sonda. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ciclo cellulare, come ad esempio dove e quando vengono attivate specifiche chinasi o fosfatasi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli enzimi regolati dal ciclo cellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui sono richieste condizioni di non conformità, come i saggi di proliferazione cellulare. Per monitorare il ciclo cellulare umano, le cellule U2 OS vengono trasfettate con una sonda PK one activity basata su FRET. Utilizzando un metodo standard di trasfezione del fosfato di calcio, le cellule vengono selezionate in pura micina per almeno sette giorni.

Ciò arricchisce la popolazione di cellule che esprimono la sonda e limita il numero di cellule con livelli di espressione tossici o livelli di espressione che influenzano gravemente il ciclo cellulare. I cloni stabili vengono quindi selezionati mediante un'espressione di diluizione limitata di CFP e YFP viene quindi esaminato per verificare che siano presenti in tutte le cellule approssimativamente allo stesso rapporto. Se alcune cellule contengono solo CFP o è probabile che in questo caso si sia verificata una ricombinazione, ripetere la preparazione del plasmide utilizzando batteri che sono meno inclini alla ricombinazione omologa, ad esempio due cellule che linearizzano il plasmide e ripetono la trasfezione.

Una volta che le cellule esprimono stabilmente la sonda, seminarle su piastre con fondo di vetro numero 1,5 dopo che si sono attaccate e sono confluenti dal 30 al 50%. Cambiare il mezzo con uno che sia indipendente dalla CO2 e non contenga rosso fenolo montare le cellule su un microscopio a epifluorescenza motorizzato Con controllo della temperatura impostato a 37 gradi centigradi. Il microscopio deve essere dotato di filtri di eccitazione ed emissione CFP e YFP.

Uno specchio ROIC adatto al monitoraggio di CFP e YFP e un obiettivo adatto alla risoluzione richiesta. In questo caso, viene utilizzato un obiettivo pneumatico 20 x NA 0,75. Utilizzando la luce trasmessa, mettere a fuoco le cellule.

Non utilizzare la luce fluorescente a questo punto poiché indurrà una risposta allo stress che potrebbe perturbare il ciclo cellulare. Per evitare la fototossicità, impostare la flessione al massimo disponibile che consenta la risoluzione subcellulare richiesta. Per questo esperimento, dovrebbe essere possibile distinguere il nucleo e il citoplasma.

Impostare un tempo di esposizione breve e inserire un filtro ad alta densità neutra. Quindi acquisire un'immagine di prova a 12 o 16 bit Utilizzando l'eccitazione e l'emissione YFP, regolare il tempo di esposizione e i filtri di densità neutra in modo che l'intensità media in una cella sia approssimativamente uguale all'intensità di fondo più cinque volte la differenza tra l'intensità minima e massima dello sfondo. Per verificare che le immagini non siano sature, esaminare l'intensità della fluorescenza per l'immagine campione.

L'intensità massima nell'immagine dovrebbe essere inferiore alla metà della gamma dinamica per consentire le differenze di intensità quando le cellule entrano in mitosi. Successivamente, ripetere questo processo utilizzando l'eccitazione CFP e i filtri di emissione YFP. Selezionare più regioni con celle trasfettate, escluse le regioni utilizzate per la messa a fuoco e l'ottimizzazione delle condizioni di esposizione.

Poiché queste procedure possono aver invocato una risposta allo stress, assicurarsi che l'intensità massima sia inferiore alla metà della gamma dinamica in tutte le cellule. Istruire il software ad acquisire due immagini ogni 45 minuti utilizzando l'eccitazione YFP, l'emissione YFP e l'eccitazione CFP. Filtri di emissione YFP.

Impostare anche la lunghezza totale dell'esperimento in modo che superi la durata del ciclo cellulare. Una volta impostato tutto, iniziare ad acquisire le immagini al termine dell'acquisizione, aprire le immagini acquisite e monitorare il tempo del ciclo cellulare dalla mitosi alla mitosi. Per le cellule che esprimono la sonda trasfettata qui, il tempo del ciclo cellulare era di circa 20-25 ore.

Confrontalo con i dati di controllo per il tipo di cella utilizzato. Se il tempo di ciclo della cella corrisponde ai tempi di riferimento, è possibile analizzare il fret. Una volta verificate le tempistiche, le immagini possono essere analizzate.

L'analisi può essere eseguita dalla maggior parte dei software dedicati alla microscopia. Qui, il freeware image j viene utilizzato con il plug-in ratio plus. Inizia l'analisi aprendo le immagini in Immagine J.Se le immagini sono in un formato stack multicolore, separa i singoli canali convertendoli in un hyper stack Selezionando l'immagine.

Quindi hyper stack, quindi stack a hyper stack. Viene visualizzata la finestra Converti in hyper stack con le impostazioni visualizzate, fare clic su OK. L'immagine verrà ora visualizzata con due barre di scorrimento sotto di essa.

Accanto a dividere le immagini in pile di canali singoli, fare clic sull'immagine e selezionare hyper stack per ridurre la dimensionalità. Si aprirà la finestra di riduzione, assicurando che i fotogrammi e mantieni sorgente siano selezionati. Quindi fare clic su OK.

Apparirà una nuova immagine contenente un solo canale. Ripeti questo processo per visualizzare una nuova immagine con il secondo canale. Successivamente, per aumentare la chiarezza visiva delle immagini finali, selezionare lo stack di emissione YFP di eccitazione YFP.

Fare clic su processo, quindi fare clic su matematica. Quindi moltiplicare Quando si apre la finestra di moltiplicazione, inserire tre per moltiplicare per tre la pila di emissioni YFP di eccitazione YFP. Il passaggio è facoltativo e garantisce che i rapporti non siano compresi nell'intervallo compreso tra zero e uno.

Quindi, sulla barra degli strumenti J dell'immagine, seleziona lo strumento a mano libera. Quindi nell'eccitazione YFP, stack di emissioni YFP, disegna una regione di interesse o ROI in un'area priva di celle, ma che è vicina a una cella che verrà misurata per aggiungere il ROI al gestore ROI, fai clic sugli strumenti di analisi. Poi responsabile del ROI.

Apparirà la finestra del ROI manager. Fare clic su aggiungi per salvare le coordinate del ROI per misurare l'intensità media del ROI nel camino di emissioni YFP di eccitazione YFP. Fare clic su analizza, quindi selezionare la misura.

Si aprirà la finestra dei risultati. Selezionare il camino di emissioni YFP di eccitazione CFP. Quindi fare doppio clic sulla ROI nel gestore ROI e ripetere la misurazione.

La misurazione viene aggiunta alla finestra dei risultati. Scorri fino ad altre posizioni nella pila per ripetere questo processo in più punti temporali. Verificare che le intensità di fondo vicino alla cella di interesse siano simili in tutto il film confrontando le misurazioni nella finestra dei risultati.

Per impostare le misure in modo che includano l'intensità minima, fare clic su analizza, quindi fare clic su imposta misure e indicare il valore di grigio minimo e massimo. Successivamente apparirà una finestra che mostra le alternative di misurazione. Dopo aver regolato la luminosità e il contrasto in base alle esigenze, disegna un ROI che copre la maggior parte di una cella e misura l'intensità minima in entrambe le pile.

Quindi prendi le misure come prima, questa volta usando una cella invece dello sfondo. Utilizzando i valori delle sezioni dei risultati, calcolare la differenza tra l'intensità minima misurata e l'intensità di fondo e dividerla per due. Questo fornisce una stima iniziale per un rapporto tra valore di ritaglio e apertura e plug-in selezionati.

Quindi rapporto più. Quindi, per il rapporto dei tasti, selezionare l'emissione YFP di eccitazione CFP S stack uno o per le sonde di visualizzazione del rapporto dei tasti invertiti in cui l'efficienza dei tasti diminuisce con la fosforilazione. Selezionare l'eccitazione YFP YFP emissione S stack one per inserire le intensità di fondo misurate e i valori di clipping.

Utilizzare i valori della finestra dei risultati e incollarli nella finestra del rapporto più. Imposta il ridimensionamento dello stack di rapporti risultante e applica una tabella di ricerca adatta per visualizzare le modifiche del rapporto. Le cellule OS U2 che esprimono un'attività PLK 1 con sonda basata su fret sono state filmate per 60 ore come descritto in questo video.

Questa immagine mostra l'ingresso mitotico cumulativo di 50 cellule che esprimono la sonda FRET, comprese le divisioni delle cellule figlie. La maggior parte delle cellule che esprimono la sonda prolifera con un tempo di ciclo cellulare compreso tra 20 e 25 ore, indicando che le condizioni di imaging e i livelli di espressione della sonda non influenzano la tempistica del ciclo cellulare. Una rappresentazione in falsi colori del rapporto dei tasti invertiti che segue una cella attraverso quattro divisioni dimostra che, sebbene vi sia un rumore considerevole, si osserva una tendenza in cui l'attività di PK 1 aumenta in G 2 e raggiunge il picco durante la mitosi.

Quando i dati grezzi vengono filtrati in media e presentati sotto forma di grafico, il tempo tra i picchi di attività è facile da stimare. Questa figura mostra la quantificazione del rapporto di tasti invertiti della cella mostrata nelle immagini precedenti dal grafico. I tempi di attivazione possono essere stimati e, come si può vedere qui, la fosforilazione della sonda diventa visibile circa quattro ore prima che la fosforilazione raggiunga il picco nella mitosi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cellule in una condizione di assenza di stress, quindi questo viene fatto riducendo al minimo l'esposizione alla luce e per ridurre al minimo i cambiamenti di temperatura o pH. È anche importante ricordare che questo metodo monitora l'equilibrio tra l'attività della chinasi e della fosfatasi in una cellula. Questa procedura può essere combinata con l'interferenza dell'RNA o con schermi inibitori per identificare i regolatori a monte di queste chinasi e fosfotasi.