Name: Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Scopri la microscopia a due fotoni spettralmente risolta per quantificare le interazioni proteina-recettore G in vivo. Questo metodo permette di mappare l'efficienza FRET e determinare la stechiometria degli oligomeri nelle cellule.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dal UW-Milwaukee Research Initiative crescita, l&#39;Istituto Wisconsin e tecnologie biomediche per la salute e la Fondazione Bradley.

<ol><li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Nanoscopy+and+Multidimensional+Optical+Fluorescence+Microscopy%22">Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy</a>. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer. New York. (2006).</li>
<li>Raicu, V., Popescu, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Integrated+Molecular+and+Cellular+Biophysics%22">Integrated Molecular and Cellular Biophysics</a>. , Springer. London. (2008).</li>
<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The renaissance of fluorescence resonance energy transfer.</a> Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).</li>
<li>Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+quantified+in+vivo+by+spectrally+resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer.</a> Biochem J. 385, 265-277 (2005).</li>
<li>Maurel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nat Methods. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).</li>
<li>Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+protein+interactions+with+photoquenching+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET.</a> Nat Methods. 3, 519-524 (2006).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).</li>
<li>Wlodarczyk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FRET+signals+in+the+presence+of+free+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors.</a> Biophys J. 94, 986-1000 (2008).</li>
<li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentelle+und+theoretische+Untersuchung+des+zwischenmolekularen+bergangs+von+Elektronenanregungsenergie.+Z.+Naturforsch%5BTitle%5D)+AND+%22A%3A+Astrophys+Phys+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch.</a> A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-2124 (2006).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Resonance+Energy+Transfer+in+Homo-Oloigomeric+Complexes+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins.</a> J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).</li>
<li>Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+supramolecular+structure+and+spatial+distribution+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells.</a> Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).</li>
<li>Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectroscopic+method+for+determination+of+size+and+distribution+of+protein+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo.</a> Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).</li>
<li>Kurjan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+response+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pheromone response in yeast.</a> Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).</li>
<li>Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G-protein-coupled+receptors%3A+lessons+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questa presentazione, abbiamo illustrato come determinare le dimensioni e informazioni strutturali su un complesso proteico oligomeri in vivo. Mentre i dati presentati è stato ottenuto da un recettore di membrana specifico (cioè Ste2p) espressa in cellule di lievito, il metodo è onnicomprensivo, nel senso che può essere applicata a qualsiasi tipo di proteina espressa in qualsiasi tipo di cellula, la unica condizione è che le proteine sono contrassegnati con i marcatori fluorescenti appropriato. Future modifi...

<table><tbody><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene glicole 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Base di azoto per lieviti senza (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; e aminoacidi</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Integratori sintetici per mezzo di coltura privo di specifici nutrienti per lieviti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Histidina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in olio 100x corretto all'infinito Plan Achromat NA=1.43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni con risoluzione spettrale</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione in vivo di g interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Lo studio delle interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi è una zona importante della ricerca perché le informazioni accumulate entrambe le applicazioni industriali vantaggi così come gli aumenti di base conoscenze di base biologica. Förster (fluorescenza) Resonance Energy Transfer (FRET) tra una molecola donatore in uno stato elettronicamente eccitato e una molecola accettore vicino è stato spesso utilizzato per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi. Le proteine ​​di interesse sono contrassegnati da due diversi tipi di sonde fluorescenti ed espressi in cellule biologiche. Le sonde fluorescenti vengono eccitati, in genere utilizzando la luce laser, e le proprietà spettrali delle emissioni di fluorescenza provenienti dalle sonde fluorescenti vengono raccolti e analizzati. Le informazioni relative al grado di interazioni proteina è incorporato nei dati di emissione spettrale. Tipicamente, la cellula deve essere analizzato un certo numero di volte in modo da accumulare abbastanza informazioni spettrali di quantificare con esattezza la portata delle interazioni proteina per ogni regione di interesse all&#39;interno della cellula. Tuttavia, la composizione molecolare di queste regioni può cambiare durante il corso del processo di acquisizione, limitando la determinazione spaziale dei valori quantitativi di apparente efficienza FRET ad una media di cellule intere. Per mezzo di un spettralmente risolta microscopio a due fotoni, siamo in grado di ottenere un set completo di immagini spettralmente risolta solo dopo una scansione completa eccitazione del campione di interesse. Da questi dati spettrali a livello di pixel, una mappa di FRET efficienza per tutta la cella è calcolato. Applicando una semplice teoria di FRET in complessi oligomeriche alla distribuzione sperimentalmente ottenuto di FRET efficienza in tutta la cellula, una singola scansione spettralmente risolta rivela informazioni stechiometrico e strutturali per il complesso oligomeri in fase di studio. Qui si descrive la procedura di preparazione di cellule biologiche (il lievito Saccharomyces cerevisiae) che esprimono recettori di membrana (sterile 2 recettori α-factor) taggati con due diversi tipi di sonde fluorescenti. Inoltre, illustrare i fattori critici coinvolti nella raccolta di dati utilizzando la fluorescenza spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia. L&#39;utilizzo di questo protocollo può essere estesa allo studio di qualsiasi tipo di proteina che può essere espresso in una cellula vivente con un marcatore fluorescente collegato ad esso.

Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

Lo studio delle interazioni proteiche nelle cellule viventi rappresenta un'importante area di ricerca, poiché le informazioni accumulate avvantaggiano sia l'ambito industriale...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare informazioni strutturali e stechiometriche riguardo a una proteina. Tutti i complessi di legame che esprimono cellule biologiche vive, le cellule di lievito vengono ingegnerizzate geneticamente per esprimere le proteine di interesse legate a una sonda fluorescente donatrice o accettore. Le sonde donatrici possono essere eccitate direttamente da un laser.Mentre gli accettori possono essere eccitati solo tramite un trasferimento di energia da un donatore vicino eccitato, le cellule vengono esposte alla luce di un laser a impulsi nell'infrarosso vicino. La fluorescenza proveniente dalle sonde viene separata nelle sue componenti spettrali da un reticolo di trasmissione e proiettata sulla superficie di un array CCD a moltiplicazione elettronica. Pertanto, spettri fluorescenti completi provenienti da singoli legamenti, tutti quanti, vengono ottenuti per ogni posizione nel campione.Il profilo spettrale della fluorescenza rilevata dipende dall'interazione specifica delle proteine di interesse. I dati vengono analizzati per determinare, per ciascun pixel dell'immagine di una cellula scansionata, le emissioni separate delle sonde do

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Abbiamo sviluppato una piattaforma software che utilizza Imaris Neuroscienze, ImarisXT e MATLAB per misurare i cambiamenti nella morfologia di una forma indefinita preso da tridimensionale fluorescenza confocale di singole cellule. Questo nuovo approccio può essere usato per quantificare i cambiamenti nella forma cellulare dopo l'attivazione del recettore e rappresenta quindi un possibile strumento aggiuntivo per la scoperta di farmaci.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Semplici metodi per rilevare l'attivazione selettiva delle proteine G da parte dei recettori accoppiati a proteine G rimangono una sfida eccezionale nella segnalazione cellulare. Qui, i biosensori per il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sono stati sviluppati legando a coppie un GPCR a peptidi proteici G per sondare i cambiamenti conformazionali a concentrazioni controllate in cellule vive.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

I cambiamenti morfologici si verificano nelle cellule fibroblaste immunitarie dopo l'attivazione e promuovono alterazioni nel reclutamento cellulare. Utilizzo dell'imaging a 2 fotoni in combinazione con una proteina specifica fibroblasta geneticamente ingegnerizzata 1 (FSP1)-cre; tdTomato- linea di mouse flossa-stop-floxed (TB/TB) e verde fluorescente etichettato lipopolysaccharide-FITC, possiamo illustrare l'assorbimento altamente specifico di lipopolissaccharide nei fibroblasti dermici e...

In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.

Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Scopri la microscopia a due fotoni spettralmente risolta per quantificare le interazioni proteina-recettore G in vivo. Questo metodo permette di mappare l'efficienza FRET e determinare la stechiometria degli oligomeri nelle cellule.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

Esplora altri video