Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare le informazioni metriche e strutturali della stoia sulle proteine. Tutte le cellule di lievito sono geneticamente modificate per esprimere le proteine di interesse attaccate a una sonda fluorescente donatrice o accettore. Le sonde dei donatori possono essere eccitate direttamente da un laser.

Mentre gli accettori possono essere eccitati solo attraverso un trasferimento di energia da un donatore eccitato nelle vicinanze, le cellule sono esposte alla luce di un laser pulsato nel vicino infrarosso. L'inseminazione fluorescente dalle sonde viene separata nelle sue componenti spettrali da un reticolo di trasmissione e proiettata sulla superficie di un array CCD moltiplicatore di elettroni. Pertanto, spettri fluorescenti completi da individuale, tutti i legamenti sono ottenuti per ogni posizione nel campione.

Il profilo spettrale della fluorescenza rilevata dipende dall'interazione specifica delle proteine di interesse. I dati vengono analizzati per determinare, per ogni pixel dell'immagine di una cella di scansione, le emissioni separate dalle sonde donatrice e accettore. L'efficienza del trasferimento di energia viene determinata in corrispondenza di ciascun pixel dell'immagine, quindi i pixel vengono piegati in base all'efficienza dei tasti e all'istogramma.

L'interpretazione dell'istogramma consente la determinazione in vivo della proteina, delle dimensioni e della configurazione del complesso. Ciao, mi chiamo Michael Stoneman del Riku Research Group presso l'Università del Wisconsin Milwaukee. Mi chiamo Singh.

Vengo da Rikus Lab nel Wisconsin, Milwaukee. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i profili di emissione completi di centinaia di tutti i complessi legamentosi all'interno di una cellula si ottengono con una scansione completa della cellula. In genere, la maggior parte dei metodi di microscopia a fluorescenza richiede che la cellula di interesse venga scansionata più volte al fine di accumulare informazioni spettrali sufficienti per determinare l'efficienza dei tasti in varie regioni di interesse all'interno della cella.

Tuttavia, le reazioni biochimiche di diffusione possono modificare la composizione molecolare di queste regioni di interesse e quindi limitare le informazioni ottenute nella scansione dell'immagine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle proteine, l'interazione proteica nelle cellule viventi, come ad esempio qual è la dimensione del danno degli oligomeri? In quale fase del ciclo di vita delle proteine si allevano gli oligomeri e qual è il ruolo dell'oligomero di questa proteina nella funzione cellulare?

Il fotomicroscopio a risoluzione spettrale due accumula informazioni spettrali sui complessi olima nella cella dell'immagine scansionando il fuoco del fascio di eccitazione attraverso il campione di interesse in un certo numero di posizioni. Una coppia di specchi a scansione ortogonali viene utilizzata per traslare il fuoco del raggio laser attraverso il campione in due direzioni diverse. Il movimento degli specchi di scansione è controllato da computer e sincronizzato con l'estrazione dei dati di intensità di fluorescenza dalla telecamera CCD dalle scansioni lineari: è possibile ricostruire mappe spaziali di intensità di fluorescenza corrispondenti a una particolare lunghezza d'onda della luce.

Al fine di ricostruire con precisione le mappe spaziali di intensità fluorescente a raggi X e calcolare la lunghezza d'onda effettiva corrispondente a ciascuna di queste mappe, il protocollo di scansione lineare deve essere calibrato utilizzando una soluzione di fluoresceina. Per iniziare la procedura di calibrazione, inviare allo spettro di eccitazione ad una lunghezza d'onda di 800 nanometri, che è due volte la lunghezza d'onda di eccitazione massima del tag donatore GFP due due da inviare allo spettro di eccitazione, traslare il prisma situato all'interno della cavità laser per modificare la dispersione della velocità di gruppo utilizzando il programma per computer a cui è interfacciata la fotocamera. Inviare un comando al chip CCD per abbassare la temperatura del chip CCD alla temperatura più bassa raggiungibile.

Al fine di ridurre il rumore scuro. Pipettare 10 microlitri di soluzione di fluoresceina su un vetrino da microscopio con un vetrino coprioggetti in modo che uno strato sottile del campione sia uniformemente disperso nella regione tra il vetrino coprioggetti e il vetrino da microscopio, posizionare una piccola goccia di olio da immersione sulla superficie del vetrino coprioggetti. Ora fissare il microscopio, far scorrere sullo stadio di traslazione XY, Z e traslare il vetrino e il tavolino nella direzione dell'asse ottico Regolando manualmente l'attuatore lineare, traslare il vetrino fino a quando l'obiettivo del microscopio non entra in contatto con la goccia di olio da immersione, commutare la fotocamera in una modalità video di acquisizione dati in modo che la luce ammessa che colpisce l'array CCD venga visualizzata sullo schermo del computer in tempo reale.

Spegnere tutte le luci ambientali della stanza per ridurre il rumore di fondo rilevato dall'array CCD. Regolare lentamente il micrometro che controlla lo stadio di traslazione nella direzione dell'asse ottico per portare il campione nel punto focale del raggio laser. Quando il campione di fluoresceina è a fuoco, l'emissione apparirà come una linea netta sull'array CCD.

Scaricare la lettura delle intensità dei pixel dall'array CCD al computer. Misurare l'intensità dei pixel in funzione della posizione sull'array CCD aprendo la matrice scaricata dei valori di intensità nell'immagine J e tracciando una linea attraverso la regione fluorescente. Utilizzare il comando image day.

Analizza il profilo del grafico per creare un grafico che illustri lo spettro di emissione del campione di fluoresceina. Regola il parametro incrementale dello specchio, che controlla il movimento del laser. Messa a fuoco nella direzione Y, in modo tale che le posizioni y adiacenti all'interno del campione determinino lo spostamento del picco degli spettri fluorescenti esattamente di un pixel lungo la dimensione spettrale sull'array CCD.

Per monitorarlo, scarica l'intensità degli spettri della fluoresceina per due diverse posizioni Y nel campione. Quindi apri le immagini di intensità con l'immagine J e trova la posizione del pixel di picco per ciascuno degli spettri fluorescenti. Utilizzando il cursore J dell'immagine, lasciando aperto l'otturatore del CCD, è possibile eseguire la scansione della messa a fuoco laser sul campione in direzione X.

La luce emessa da ciascun voxel lungo la linea della scansione dovrebbe cadere in modo incidente sull'array CCD alla fine di ogni scansione lineare, memorizzare i dati dall'array CCD ottenuti per questa scansione lineare e quindi cancellare i pixel dell'array CCD. Sposta la posizione del laser. Metti a fuoco nella direzione Y della quantità determinata in precedenza.

Quindi scansionare il raggio laser in direzione X attraverso il campione. Ancora una volta, lasciando aperto l'otturatore del CCD si memorizzano i dati. Ripetere questa procedura di scansione lineare fino a quando un'area fisica più grande di circa il 50% delle dimensioni di una singola cellula biologica è stata illuminata dalla luce laser.

La relazione tra il numero di riga di una particolare immagine a scansione lineare e la lunghezza d'onda dovrebbe essere utilizzata per ricostruire le immagini per ottenere più mappe facciali di intensità fluorescente ex-moglie a diverse lunghezze d'onda. Per ottenere l'immagine di presentazione fluorescente dell'ex moglie per una particolare lunghezza d'onda, trovare il numero di riga sull'immagine ottenuta dalla prima scansione della linea che corrisponde a questa lunghezza d'onda. Quindi la riga adiacente dell'immagine di scansione lineare successiva corrisponde alla riga successiva dell'immagine di emissione fluorescente.

Per quella particolare lunghezza d'onda, impilare tutte le righe di immagini che corrispondono a questa lunghezza d'onda per ottenere le mappe spaziali di intensità fluorescente XY del campione a quella lunghezza d'onda. Ripetere questa procedura per tutte le altre lunghezze d'onda ottenibili per raccogliere dati sui campioni. Per prima cosa, rimuovere dall'incubatrice le piastre con le colonie di lievito trasformate.

Dovrebbero esserci almeno tre tipi di cellule trasformate. Cellule che esprimono le proteine di interesse etichettate con entrambi i tipi di sonde fluorescenti. Cellule che esprimono solo proteine marcate con le sonde fluorescenti del donatore e cellule che esprimono solo proteine marcate con le sonde fluorescenti accettori.

Aggiungere 100 microlitri di cloruro di potassio da 100 millimolari in una provetta da microcentrifuga. Quindi, utilizzando una punta per micropipette, raschiare da tre a cinque colonie di lievito dalla piastra di cellule che esprimono proteine marcate con entrambi i donatori e ad eccezione di una sonda fluorescente e di un inoculo del cloruro di potassio da 100 millimolari. Con queste cellule, rimuovere 10 microlitri della sospensione cellulare e dispensarla su un nuovo microscopio. Diapositiva.

Coprire la gocciolina con un vetrino coprioggetti e posizionare una goccia di olio sulla superficie del vetrino coprioggetti. Quindi, chiudere manualmente l'otturatore nel percorso del raggio laser per impedire alla luce laser di raggiungere l'obiettivo del microscopio. Fissare il vetrino del microscopio al tavolino di traslazione XY, Z e traslare il tavolino del vetrino nella direzione dell'asse ottico fino a quando l'obiettivo del microscopio non entra in contatto con la goccia di olio da immersione.

Ora attiva l'illuminazione della luce ad ampio campo e vai alla fotocamera. Modalità video di raccolta dati. L'immagine ad ampio campo del campione sarà fortemente sfocata a causa della presenza del reticolo di trasmissione nel percorso di emissione.

Pertanto, posizionare un filtro passa-banda con una larghezza totale piccola metà massima nel percorso ottico che precede il reticolo di trasmissione. Traslare lentamente la fase di traslazione nella direzione dell'asse ottico mentre si visualizza l'immagine delle cellule sullo schermo della fotocamera fino a quando le cellule non vengono messe a fuoco. Traslare il tavolino in direzione X o Y per portare una singola cella nella posizione del fuoco del raggio laser.

Spegnere la sorgente di illuminazione a campo largo e rimuovere il filtro del percorso di banda dal percorso di emissione. Sblocca il raggio laser per un breve periodo di tempo visualizzando contemporaneamente il segnale ricevuto dall'array CCD. Se viene rilevato un segnale fluorescente sull'array CCD durante il tempo in cui il raggio laser è incidente sulla cella, eseguire una scansione completa di acquisizione dati fluorescente di questa cella.

È fondamentale utilizzare gli stessi parametri di scansione, in particolare il numero di linee e l'incremento del motivo come determinato nella procedura di calibrazione illustrata in precedenza. Ripetere il processo di acquisizione dei dati di localizzazione cellulare e fluorescenza per un gran numero di cellule che esprimono proteine attaccate sia ai tag donatori che ai tag accettori. Dopo aver accumulato un numero sufficiente di immagini a fluorescenza di cellule che esprimono proteine marcate con entrambi i recettori, ripetono l'intero processo sia per le cellule che esprimono solo proteine marcate con le sonde fluorescenti del donatore sia per le cellule che esprimono solo proteine marcate con le sonde fluorescenti accettori.

Infine, ricostruisci tutte le scansioni per ottenere una risoluzione spettrale. Le mappe spaziali di intensità fluorescente XY per ogni set di dati utilizzando la procedura descritta in precedenza, illustrate in queste tre figure sono le mappe spaziali risultanti calcolate da due misurazioni al microscopio di fotoni risolte spettralmente eseguite su una cellula di lievito che esprime il recettore sterile al fattore alfa. Mappe bidimensionali dei segnali del donatore e dell'accettore sono state ottenute analizzando i profili di emissione spettrale ottenuti da ciascuna posizione della cellula.

Alle intensità di fluorescenza vengono assegnati falsi colori in base ai loro valori e la scala viene mostrata come un riquadro. Una mappa bidimensionale delle efficienze apparenti dei tasti è stata quindi calcolata utilizzando le immagini KDA e KAD utilizzando i valori estratti dalla mappa delle efficienze apparenti dei tasti della cella appena mostrata. I valori EAPP misurati della cella sono rappresentati da cerchi.

La linea continua rossa rappresenta l'adattamento migliore ai dati misurati utilizzando la somma delle singole funzioni del calcio rappresentate da linee verdi continue. L'analisi dell'istogramma, descritto nel testo del protocollo, conferma che il complesso sterile di tutti i legamenti del recettore a due fattori alfa assume la forma di un tetramero a forma di RBA in vivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questo esperimento, è importante mantenere bassa la potenza della sorgente di eccitazione. È importante evitare l'eccitazione multipla del donatore con un singolo impulso.